Webbplats-regisserad immobilisering av benmorfogent Protein 2 till fasta ytor genom att klicka på kemi
Summary
Biomaterial dopade med Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) har använts som en ny terapeutisk strategi för att läka oläkta frakturer. För att övervinna biverkningar som följd av en okontrollerbar release av faktorn, föreslår vi en ny strategi för att webbplats-direkt immobilisera den faktorn, vilket skapar material med förbättrad osteogent kapacitet.
Abstract
Olika terapeutiska strategier för behandling av icke-läkande rörben defekter har undersökts intensivt. För närvarande används behandlingar finns flera begränsningar som har lett till användning av biomaterial i kombination med osteogent tillväxt faktorer, såsom ben morphogenetic proteiner (bmp). Vanligen används absorption eller inkapsling metoder kräver suprafysiologiska mängder BMP2, vanligtvis resulterar i en effekt av så kallade inledande burst-release som provocerar flera allvarliga negativa biverkningar. En möjlig strategi för att övervinna dessa problem vore att kovalent proteinet till schavotten. Dessutom bör koppling utföras på platsspecifika sätt för att garantera en reproducerbar produkt resultatet. Därför skapade vi en BMP2 variant, där en konstgjord aminosyra (propargyl-L-lysin) infördes i den äldre delen av proteinet BMP2 av kodon användning expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk kopplades till functionalized pärlor via koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC). Den biologiska aktiviteten av de kopplade BMP2-K3Plk bevisades in vitro- och osteogent aktiviteten av BMP2-K3Plk-functionalized pärlor bevisades i cellbaserade analyser. Functionalized pärlorna i kontakt med C2C12 celler skulle kunna framkalla alkaliskt fosfatas (ALP) uttryck i lokalt begränsad närhet av kornet. Således av denna teknik, functionalized ställningar kan produceras som kan utlösa celldifferentiering mot ett osteogent härstamning. Dessutom är lägre BMP2 doser tillräcklig på grund av webbplats-regisserad kopplat BMP2 kontrollerade orientering. Med den här metoden utsätts BMPs alltid deras receptorer på cellytan i lämplig orientering, vilket inte är fallet om faktorerna som är kopplade via icke-plats-riktade koppling tekniker. Produkt resultatet är mycket kontrollerbar och, således, resultat i material med homogena egenskaper, förbättra deras tillämplighet för reparation av kritisk storlek ben defekter.
Introduction
Det yttersta målet för ben vävnadsregeneration engineering och ben är att övervinna de nackdelar och begränsningar som inträffar under vanliga behandlingar av oläkta frakturer. Auto – eller allo-transplantationer används huvudsakligen som nuvarande terapi strategier, även om de båda har flera nackdelar. Den idealiska bentransplantation bör föranleda osteogenesis av såväl osteoinduction som osteoconduction, leder till osteointegration av transplantat i benet. Numera är bara auto-transplantation ansett som ”gold standard” eftersom det ger alla kännetecken för en idealisk bentransplantat. Tyvärr, det ger också viktiga negativa aspekter, såsom långa kirurgi gånger, och en andra trauma webbplats som vanligtvis innebär fler komplikationer (t.ex., kronisk smärta, hematom formationer, infektioner, kosmetiska defekter, etc.). Prövningar ympkvistar, har å andra sidan suboptimala egenskaper för alla allmänna aspekter1. Alternativa ben graft teknik har förbättrats under de senaste åren, i syfte att producera ställningar som är osteoinduktiv, osteokonduktivt, biokompatibla, och bioresorbable. Eftersom många biomaterial inte visar alla dessa osteogent egenskaper, har olika tillväxtfaktorer, främst BMP2 och BMP7, upptagits för att förbättra osteogent potentialen i den särskilda ställning2.
Som ett viktigt kriterium, bör sådana tillväxtfaktor leveranssystem ge en kontrollerad dos frisättning över tiden för att underlätta de väsentliga händelserna såsom cell rekrytering och fastsättning, cell inväxt och angiogenes. Dock orörlig BMPs, liksom andra osteogent tillväxtfaktorer har varit allmänt icke-kovalent3. Adsorption och klämskador tekniker kräver användning av suprafysiologiska mängder protein på grund av en inledande burst release, vilket leder till allvarliga nackdelar in vivo som vanligtvis påverkar omgivande vävnader genom att inducera ben överväxt, osteolys, svullnad och inflammation4. Således, lagring av tillväxtfaktorer på webbplatsen leverans under längre tidsperioder kan uppnås genom kovalent immobilisering metoder. Kemiskt modifierade BMP2 (succinylated5, acetylerade6 eller biotinylerade7), konstruerad heterodimerer8eller BMP2 härledda oligopeptider9 har utformats och används för att övervinna begränsningarna som avser absorptionen. Bio-aktiviteten i dessa konstruktioner är dock inte förutsägbar eftersom arrangemanget potentiellt hämmar bindningen av immobiliserade liganden till cellulära receptorer. Som tidigare visad är det viktigt att alla fyra receptor kedjor inblandade i bildandet av aktiverade ligand-receptor komplex samverkar med den immobiliserade BMP2 för att fullt ut aktivera alla nedströms signalering cascades10.
För att övervinna problemen med en inhomogena produkt resultatet med begränsningar när det gäller bioaktivitet, stabilitet och biotillgängligheten av immobiliserade faktorn, utformade vi en BMP variant kan kovalent bindning ställningar på ett sätt som webbplats-regi. Denna variant, som kallas BMP2-K3Plk, består av en konstgjord aminosyra som infördes genom genetiska kodon expansion11. Denna variant har varit framgångsrikt kopplade till ställningar med en kovalent kopplingen strategi samtidigt som dess biologiska aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genererar märkta proteinet varianter av genetiska kodon expansion tillåter införandet av olika icke-naturlig aminosyra analoger huvudsakligen vid någon av de primära proteinsekvens. Vid BMPs som BMP2, gemensamma taggar såsom en 6-histidin (hans)-tagg kan endast vara infört N-terminalt, eftersom protein´s C-terminal slutet är begravda i den tertiary proteinstrukturen, och kan således inte nås från utsidan. På andra positioner, kan storleken på taggen introducerade mycket sannolikt orsaka strukturella förän…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr M. Rubini (Konstanz, Tyskland) för att tillhandahålla plasmiden pyrrolysyl-tRNA-kodning och som tillhandahåller pRSFduet-pyrtRNAsynth kodning den motsvarande aminoacyl-tRNA-syntetas.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
