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Immunology and Infection

एक Photoactivatable एगोनिस्ट का उपयोग कर टी सेल सक्रियण के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/56655
Automatic Translation
1,2, 1
1Immunology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Weill-Cornell Graduate School of Medical Sciences

Summary

यह प्रोटोकॉल टी सेल सक्रियण के सटीक spatiotemporal नियंत्रण को सक्षम करने, photoactivatable पेप्टाइड-MHC का उपयोग कर टी लिम्फोसाइटों को सक्रिय करने के लिए एक इमेजिंग-आधारित पद्धति का वर्णन करता है ।

Abstract

टी लिम्फोसाइटों तेजी से, ध्रुवीय संकेतन में संलग्न हैं, TCR सक्रियण के बाद मिनट के भीतर होने वाली । यह प्रतिरक्षा synapse, एक छवि कक्ष-सेल जंक्शन है कि टी सेल सक्रियण और दिशाहीन लक्ष्य प्रभाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है के गठन लाती है । इन प्रक्रियाओं को प्रभावी ढंग से अध्ययन करने के लिए, एक इमेजिंग दृष्टिकोण है कि तेजी से कब्जा करने के लिए सिलवाया है, ध्रुवीकरण प्रतिक्रियाओं आवश्यक है । यह प्रोटोकॉल ऐसी प्रणाली का वर्णन करता है, जो एक photoactivatable पेप्टाइड-प्रमुख histocompatibility कॉम्प्लेक्स (pMHC) पर आधारित होती है जो पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में आने तक गैर-stimulatory है. लक्षित decaging videomicroscopy प्रयोगों के दौरान इस एजेंट के TCR सक्रियण और अनुवर्ती सेलुलर प्रतिक्रियाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन निगरानी की सटीक spatiotemporal नियंत्रण द्वारा कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIRF) इमेजिंग सक्षम करता है । यह दृष्टिकोण भी आनुवंशिक और औषधीय गड़बड़ी रणनीतियों के साथ संगत है । यह अच्छी तरह से परिभाषित आणविक रास्ते के विधानसभा के लिए अनुमति देता है कि TCR ध्रुवीकरण cytoskeletal संरचनाओं कि आबाद प्रतिरक्षा synapse के गठन के लिए संकेतन लिंक ।

Introduction

टी लिम्फोसाइटों (टी कोशिकाओं) सेल सतह MHC के संदर्भ में प्रदर्शित प्रतिजनी पेप्टाइड्स पहचानने से सेलुलर प्रतिरक्षा में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । प्रतिजन मांयता है, जो TCR द्वारा मध्यस्थता है, भोली टी कोशिकाओं के भेदभाव ड्राइव और cytolytic और प्रभाव आबादी द्वारा संचार प्रतिक्रियाओं के वितरण को बढ़ावा देता है । TCR सगाई भी सेलुलर वास्तुकला में नाटकीय परिवर्तन लाती है । मिनट के भीतर, टी कोशिकाओं प्रतिजन के पक्ष पर gloms-प्रस्तुत सेल (APC), एक ध्रुवीय प्रतिरक्षा synapse (है) के रूप में जाना जाता इंटरफेस बनाने1,2। साइटोकिंस के दिशात्मक रिलीज को सक्षम करने या, साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs), lytic प्रोटीन है कि APC नष्ट करने के मामले में द्वारा potentiates टी सेल प्रभाव प्रतिक्रियाओं है ।

pMHC द्वारा TCR सगाई कई बहाव अनुकूलक अणुओं की तेजी से फास्फारिलीकरण, टी कोशिकाओं के सक्रियकरण के लिए लिंक सहित (अक्षांश), जो अंततः मजबूत synaptic cytoskeleton के remodeling को बढ़ावा देता है लाती है 2 । Cortical रेशा actin (एफ actin) ड्राइव टी APC सतह पर फैल सेल, और फिर एक कुंडलाकार में एफ-actin संचय द्वारा विशेषता संरचना में हल करता है परिधि और केंद्र से कमी है । एफ actin अंगूठी गठन कसकर microtubule आयोजन केंद्र (MTOC, भी टी कोशिकाओं में centrosome कहा जाता है) के उंमुखीकरण के लिए युग्मित है बस अंतरफलक के केंद्र के नीचे एक स्थिति के लिए । दोनों ईवेंट्स प्रारंभिक antigen पहचान के मिनट के भीतर हो और जिसमें क्रमिक सक्रियण ईवेंट्स और प्रभाव प्रतिसाद हो वास्तु प्रसंग स्थापित करें ।

अध्ययन करने के लिए, विभिंन प्रयोगशालाओं दृष्टिकोण है जिसमें APC एक कांच की सतह है कि या तो शामिल मैटीरियल TCR लाइगैंडों है या एक लिपिड bilayer है कि खुद लाइगैंडों3,4शामिल का समर्थन करता है की जगह है विकसित किया है । टी कोशिकाओं के रूप में इन सतहों कि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRF) या फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है पर संपर्कों की तरह है, जल्दी टी सेल सक्रियण के उच्च संकल्प अध्ययन को सक्षम करने और गठन है ।

हालांकि इन तरीकों को पूरी तरह से इकट्ठे के उत्कृष्ट दृश्य के लिए अनुमति दी है, TCR निंनलिखित संकेत के बहुत: pMHC बंधाव सेकंड के भीतर होता है, TCR सक्रियण के बाद की घटनाओं के अनुक्रम का निर्धारण सही प्रयास उलझी . इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए एक photoactivation दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसमें photoactivatable pMHC को TCR सक्रियण5,6,7का spatiotemporal नियंत्रण प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रणाली में, टी कोशिकाओं कांच सतहों photoactivatable pMHC युक्त है कि गैर है stimulatory पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के साथ विकिरणित तक TCR के लिए संलग्न हैं । टी सेल के नीचे सतह के एक माइक्रोन आकार क्षेत्र के यूवी विकिरण एक stimulatory क्षेत्र है कि टी सेल द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है बनाने photocage निकालता है । बाद संकेतन घटनाओं और cytoskeletal remodeling तो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं । दो photoactivatable के संस्करण एंटीजन पेप्टाइड्स, मोठ cytochrome सी88-103 (एमसीसी) और ovalbumin257-264 (ओवा), जो कक्षा द्वितीय MHC i-Ek और वर्ग i MHC H2-kbके सन्दर्भ में प्रस्तुत किए गए हैं, क्रमशः विकसित (चित्र 1) । यह दोनों CD4+ टी एमसीसी-I-Ek (5C व्यक्त करने के लिए विशिष्ट कोशिकाओं के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । C7, 2B4, या और TCRs) और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट ओवा-H2-K b (OT1 TCR व्यक्त करना).

पिछले एक दशक से अधिक, TCR photoactivation और इमेजिंग दृष्टिकोण को जल्दी TCR संकेतन कदम की सटीक कैनेटीक्स स्थापित करने के लिए उपयोग किया गया है और भी आणविक रास्ते की पहचान करने के लिए ध्रुवीकरण cytoskeletal remodeling5, ६ , 7 , 8 , 9 , 10. उदाहरण के लिए, परख का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी कि APC की ओर centrosome उंमुखीकरण लिपिड दूसरा दूत diacylglycerol के एक स्थानीयकृत ढाल द्वारा मध्यस्थता है पर केंद्रित है । यह प्रत्याशित है कि इस पद्धति के अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान है कि मांग उच्च टी सेल समारोह के संकल्प इमेजिंग विश्लेषण जारी रहेगा ।

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Protocol

1. Stimulatory ग्लास सतहों की तैयारी

  1. कोट आठ-biotinylated पाली के साथ अच्छी तरह से चैम्बर्ड coverglass-L-lysine (बायो पीएलएल) पतला 1:500 आसुत, जल में (ddH2ओ) । कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए मशीन ।
  2. H2O से धो लें ।
  3. आर टी पर 2 एच के लिए सूखी ।
  4. ब्लॉक बायो-पीएलएल लेपित अवरुद्ध बफर के साथ सतहों (HEPES बफर खारा [10 मिमी HEPES पीएच ७.४, १५० mM NaCl], 2% BSA के साथ) पर 30 मिनट के लिए RT.
    1. भंग 5 पाली के मिलीग्राम-एल-lysine hydrobromide 1 मिलीलीटर में 10 मिमी नापो4, पीएच ८.५ ।
    2. जोड़ें १२५ μmol (०.५५ मिलीग्राम) के एन एच-बायोटिन (से एक १०० मिलीग्राम/DMSO में एमएल स्टॉक) और प्रतिक्रिया की पीएच की जांच करें । यदि पीएच ८.५ के नीचे है, 4 N NaOH के 2 μL इसे बढ़ाने के लिए पीएच ८.५ और ९.५ के बीच में जोड़ें ।
    3. 30 मिनट के लिए भंवर ।
    4. 20 मिमी Tris पीएच ८.० में भंग १०० मिमी glycine के ५० μL के साथ प्रतिक्रिया बुझाने.
    5. 10 मिनट के लिए पूरी शक्ति से स्पिन और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
      नोट: जैव पीएलएल गुणवत्ता आम तौर पर कोटिंग धारावाहिक दो द्वारा पिछले तैयारी की तुलना में है-एक ९६-अच्छी एलिसा प्लेट पर सामग्री की गुना कमजोर पड़ने और क्षारीय फॉस्फेट युग्मित streptavidin के साथ गर्मी के बाद बायोटिन सामग्री बढ़ाता है ।
  5. ब्लॉकिंग बफ़र निकालें । कुओं को सूखने न दें । streptavidin जोड़ें (१०० µ g/mL बफ़र अवरुद्ध में) । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  6. एचबीएस में धोयें. भरें और उलटा चैंबर स्लाइड वेल्स 4-5 बार, कुओं से एचबीएस निकाल रहा है । कुओं को सूखने न दें ।
  7. सतह के लिए biotinylated pMHC लाइगैंडों और आसंजन अणुओं जोड़ें ।
    नोट: एमसीसी और ओवा ऑर्थो-nitrobenzyl आधारित सुरक्षा समूहों (जैसे, nitrophenylethyl (NPE) या nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) को जोड़ने के द्वारा photocaged जा सकता है ε-एमिनो के प्रमुख lysines समूह (एमसीसी में K12, K7 में) । Photocaged एमसीसी और ओवा वाणिज्यिक विक्रेताओं से प्राप्त किया जा सकता है । जलीय बफर में पुनर्गठन के बाद, वे बैक्टीरियल व्यक्त I-Ek और H2-kb की स्थापना की गई दृष्टिकोण11,12का उपयोग करके में फिर से सामने आया है ।
  8. photoactivatable एमसीसी या ओवा पेप्टाइड का सत्यापन
    1. एक handheld यूवी लैंप के साथ यूवी irradiating द्वारा पिंजरे NVOC-संरक्षित पेप्टाइड्स ( सामग्री की तालिकादेखें) आर टी पर 20 मिनट के लिए)
    2. पल्स १.० एक्स 105 APCs के साथ 1 µ एम के nonstimulatory पेप्टाइड (नकारात्मक नियंत्रण, जैसे एचबी), unirradiated photoactivatable पेप्टाइड, विकिरणित photoactivatable पेप्टाइड, और एगोनिस्ट पेप्टाइड (सकारात्मक नियंत्रण, उदा, एमसीसी) के लिए 1 ज के लिए ३७ ° c पर रात भर ।
    3. को उत्तेजित टी कोशिकाओं 5C व्यक्त । C7/2B4/और TCR, CH12 या CH27 बी कोशिकाओं का उपयोग करें । OT1 टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, RMA-s या EL4 thymoma कोशिकाओं का उपयोग करें ।
    4. ९६ में टी कोशिकाओं के बराबर संख्या के साथ स्पंदित APCs मिश्रण-अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेटें २०० µ एल के एक अंतिम मात्रा में ३७ ° c पर 12-24 घंटे के लिए ।
    5. एक अच्छी तरह से supernatants पुनर्प्राप्त और streptavidin-सहिजन peroxidase वर्णमिति डिटेक्शन के साथ एलिसा द्वारा IL-2 का विश्लेषण ।
      नोट: electrospray मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सभी पेप्टाइड्स की caging स्थिति की पुष्टि MHC परिसरों में सामने लाने से पहले, पुरजोर रूप से अनुशंसित है ।
  9. MHC की तह और शुद्धिकरण करने के लिए ताकि प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए । उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पंनी में तह प्रतिक्रियाओं लपेटो और यूवी लैंप बंद के साथ जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी बाहर ले ।
    नोट: यह पाया गया है कि photoactivatable एमसीसी-I-Ek और ओवा-H2-kb उच्च घनत्व पर यूवी स्वतंत्र टी सेल सक्रियण प्रेरित, संभवतः अधूरा कार्यात्मक caging के कारण । इसलिए, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC के 10-30एक्स अतिरिक्त में पतला है (उदा I-ek -स्थिरीकरण कदम के दौरान हीमोग्लोबिन64-76 पेप्टाइड (एचबी)). यह क्रमिक इमेजिंग प्रयोग के शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाता है ।
  10. CD4+ T कक्षों को photoactivate करने के लिए, सामूहिक रूप से biotinylated एचबी-i-Ek (3 µ g/एमएल) के मिश्रण का उपयोग करें, biotinylated photoactivatable एमसीसी-i-ek (०.१ µ g/एमएल), और biotinylated एंटीबॉडी के खिलाफ वर्ग i MHC H2-kk (०.५ µ g/ mL). विरोधी H2-kk एंटीबॉडी को प्रोत्साहित 5C. C7/2B4/और टी कोशिकाओं है, जो H2-kkएक्सप्रेस, के लिए कांच की सतह पर फैल बिना सक्रियण के दौर से गुजर ।
  11. सीडी 8 + T कक्षों के लिए, biotinylated H2 के मिश्रण का प्रयोग करें-D b का असर पेप्टाइड KAVYDFATL (1 µ g/ml), biotinylated photoactivatable ओवा-H2-Kb (०.१ µ g/ml), और आसंजन अणु extracellular के िकैम डोमेन-1 (2 µ g/ml कीट सेल संस्कृति13) द्वारा उत्पादित । िकैम-1 टी सेल सतह पर integrin LFA1 आकर्षक द्वारा घनिष्ठ संपर्क गठन को प्रोत्साहित करती है ।
  12. सभी प्रोटीन मिश्रण को अवरुद्ध बफर में लागू करें, 1 ज के लिए मशीन के बाद आरटी पर या 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे ।
    नोट: इस तरह की सतहों पर आणविक घनत्व ~ µm2 प्रति ८००० पहले से6निर्धारित किया गया है । यह देखते हुए कि photoactivatable pMHC का प्रतिनिधित्व करता है ~ 1/30 सतह पर biotinylated प्रोटीन कागु , इसका घनत्व होगा ~ २६७ अणुओं प्रति µm2, decaging करने के लिए पहले ।
  13. १.६ चरण में के रूप में धोने और उपयोग करने के लिए तैयार जब तक एचबीएस में छोड़ दें ।
  14. जोड़ें २००,००० CD4+ या सीडी 8 + टी एक अच्छी तरह से में उपयुक्त TCR व्यक्त कोशिकाओं और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर पालन करने की अनुमति । एक बार कोशिकाओं से जुड़ा है और सतह पर फैल गया है, वे photoactivation और इमेजिंग के लिए तैयार हैं ।
    नोट: Retroviral transduction फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच के साथ प्रभाव टी कोशिकाओं के विस्तार में वर्णित है elswhere6,7। कैल्सियम सिग्नलिंग को कैल्शियम सेंसिटिव डाई Fluo-46से भरी untransduced टी कोशिकाओं का प्रयोग करके भी अध्ययन किया जा सकता है । ratiometric डाई फ्रा-2 की सिफारिश नहीं है क्योंकि यह यूवी रेंज में उत्तेजना की आवश्यकता है, जो भी photoactivatable pMHC के decaging लाती है ।

2. छवि अधिग्रहण

  1. एक उल्टे TIRF माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण के लिए एक यूवी संगत 150X उद्देश्य लेंस के साथ सज्जित का उपयोग करें । यूवी विकीर्ण उपयोगकर्ता परिभाषित एक डिजिटल डायाफ्राम एक १०० डब्ल्यू पारा लैंप (एचबीओ) से जुड़ी प्रणाली का उपयोग कर क्षेत्र । प्रत्यक्ष यूवी एक ४०० एनएम लंबे पास दर्पण का उपयोग नमूना पर इस चिराग से प्रकाश ।
  2. स्थानीयकृत photoactivation और समय-चूक प्राप्ति के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । ज्यादातर प्रयोगों में, क्रमशः ४८८ एनएम और ५६१ एनएम उत्तेजना पराबैंगनीकिरण का उपयोग हरी और लाल दोनों चैनलों में निगरानी जांच । लेजर प्रकाश एक दोहरे bandpass dichroic दर्पण है कि भी यूवी रेंज (decaging सक्षम करने के लिए) में पहुंचाता का उपयोग कर नमूने पर निर्देशित है । कृपया सामग्री और माइक्रोस्कोप विंयास पर अतिरिक्त जानकारी के लिए 6 चित्रा की मेज देखें ।
  3. टी कोशिकाओं युक्त चैंबर स्लाइड बढ़ते के बाद, आवश्यक के रूप में TIRF या epifluorescence रोशनी प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें । लाइव मोड में, उन कक्षों के फ़ील्ड का चयन करें, जो ब्याज की फ्लोरोसेंट जांच (ओं) को अभिव्यक्त कर रहे हैं । सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर व्यक्तिगत कोशिकाओं के नीचे photoactivation के लिए माइक्रोन पैमाने क्षेत्रों की स्थापना ।
  4. समय चूक अधिग्रहण शुरू करते हैं । सामान्यतया, ८० timepoints, प्रत्येक समय बिंदु के बीच 5 s के अंतराल के साथ प्राप्त कर रहे हैं । यह अनुक्रमिक ४८८ एनएम और ५६३ एनएम जोखिम के लिए पर्याप्त समय से अधिक पत्ते, दोहरी रंग प्रयोगों के मामले में ।
  5. 10 timepoints के बाद, 1-१.५ s के लिए डिजिटल डायाफ्राम शटर खोलने के द्वारा चयनित क्षेत्रों photoactivate ।
  6. समय व्यतीत पूर्ण होने के बाद, कक्षों की किसी नई फ़ील्ड का चयन करें और प्रक्रिया दोहराएं ।

3. डेटा विश्लेषण

नोट: स्थानीयकृत लाइगैंडों के photoactivation एक सुपरिभाषित, स्टेशनरी stimulatory क्षेत्र जो संकेतन प्रतिक्रियाओं और cytoskeletal remodeling घटनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता बनाता है । विश्लेषण प्रोटोकॉल आम तौर पर या तो विकिरणित क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाता है या दूरी माप के लिए एक स्थानात्मक समापन बिंदु के रूप में विकिरणित क्षेत्र का उपयोग शामिल (उदाकरने के लिए centrosome के ध्रुवीकरण के आकलन के लिए विकिरणित क्षेत्र) । दोनों विश्लेषण प्रोटोकॉल नीचे वर्णित हैं । विभिंन इंटरैक्टिव छवि विश्लेषण कार्यक्रमों के लिए तीव्रता और दूरी माप है, जो तब अतिरिक्त प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए उत्पादन किया जा सकता बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. प्रतिदीप्ति तीव्रता
    1. कक्ष के बाहर एक पृष्ठभूमि क्षेत्र (fib) के प्रतिदीप्ति तीव्रता (fi) का निर्धारण करें । यह पृष्ठभूमि सुधार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
      1. सेल के बाहर एक माइक्रोन आकार वर्ग क्षेत्र ड्रा और एक मुखौटा बनाते हैं । प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने के लिए, विश्लेषण पर क्लिक करें | मुखौटा सांख्यिकी। माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता चुनें और मान निर्यात करें ।
        नोट: प्रक्रियात्मक विवरण (उदा. 3.1.1.1) Slidebook सॉफ़्टवेयर देखें ( सामग्री तालिकादेखें) । अंय सॉफ्टवेयर संकुल (जैसे, फिजी) का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल का कार्यांवयन थोड़ा अलग होगा ।
    2. प्रत्येक समय बिंदु के लिए photoactivated क्षेत्र के भीतर FI निर्धारित करें ।
      1. उस क्षेत्र को हाइलाइट करने के लिए मास्क का चयन करें जो photoactivated था । प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने के लिए, विश्लेषण पर क्लिक करें | मुखौटा सांख्यिकी। माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता चुनें और मान निर्यात करें ।
    3. क्षेत्र के भीतर मापा fi मान से पृष्ठभूमि फ़ाई घटाना । फिर, औसत से विभाजित करके सही फाई माप को सामान्य, पृष्ठभूमि photoactivation पहले 9 फ्रेम की सही फाई. ΔF/F = ((fi-fib)/mean (fi1-9)-fib)) ।
      नोट: ग्राफ ΔF समय के एक समारोह के रूप में एफ/।
  2. दूरी
    1. photoactivated क्षेत्र के केंद्र के एक्स और वाई निर्देशांक प्राप्त करें ।
      1. photoactivated क्षेत्र के केंद्र के x और y निर्देशांकों का निर्धारण करने के लिए, उस क्षेत्र को हाइलाइट करने के लिए मास्क का चयन करें जो photoactivated था । एक बार photoactivation के क्षेत्र पर प्रकाश डाला है, का चयन करें विश्लेषण । मुखौटा सांख्यिकी । क्षेत्र के केंद्र और मूल्यों का निर्यात ।
    2. निर्धारित एक्स और वाई प्रत्येक समय बिंदु के लिए ब्याज की फ्लोरोसेंट जांच के लिए निर्देशांक । यह आमतौर पर या तो मैनुअल या स्वचालित कण ट्रैकिंग के माध्यम से प्राप्त की है ।
      1. एक्स और वाई का निर्धारण करने के लिए ब्याज की फ्लोरोसेंट जांच के निर्देशांक, चुनें मैनुअल कण ट्रैकिंग और समय के साथ ब्याज की फ्लोरोसेंट जांच पर क्लिक करें । एक बार सभी समय अंक ट्रैक किया गया है, का चयन करें विश्लेषण । मुखौटा सांख्यिकी । क्षेत्र के केंद्र और मूल्यों का निर्यात ।
    3. ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन और photoactivated क्षेत्र के केंद्र के बीच दूरी की गणना हर समय समीकरण का उपयोग कर बिंदु के लिए: दूरी = √ ((x2-x1)2+ (y2-y1)2), जिसमें x2 और y2 ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन के निर्देशांक हैं और x1 और y1 photoactivated क्षेत्र के केंद्र के निर्देशांक हैं.
    4. ग्राफ समय के एक समारोह के रूप में दूरी ।

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Representative Results

photoactivation और इमेजिंग दृष्टिकोण अवलोकन और तेजी से सतही ठहराव, ध्रुवीकरण संकेत प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देता है । अपनी क्षमताओं को समझाने के लिए, यहां reproduced एक TCR-प्रेरित तमंचा संचय और centrosome reओरिएंटेशन के बीच spatiotemporal सहसंबंध की जांच कर प्रयोग है । 5C. C7 टी सेल विस्फोटों दो फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ retrovirally transduced थे: एक तमंचा युक्त प्रोटीन कळेनासे सी से मिलकर C1 डोमेन-θ GFP (c1-GFP) और आरएफपी-tubulin से जुड़ा हुआ सेंसर centrosome की निगरानी के लिए । टी कोशिकाओं तो चैंबर्ड coverglass से जुड़े थे photoactivatable एमसीसी युक्त-I-Ek। C1-GFP को epifluorescence मोड में TIRF माइक्रोस्कोपी और आरएफपी-tubulin का उपयोग करके imaged किया गया था । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, टी सेल के नीचे सतह के स्थानीयकृत photoactivation विकिरणित क्षेत्र में तमंचा के संचय लाती है । यह एक ही क्षेत्र के लिए centrosome के reओरिएंटेशन द्वारा सेकंड के भीतर पीछा किया जाता है ।

C1-GFP संचय समय के साथ photoactivated क्षेत्र के केंद्र में, पृष्ठभूमि सुधार के बाद, सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना द्वारा quantified किया जा सकता है (चित्रा 3). photoactivation के जवाब में Centrosome अभिविन्यास Centrosome और photoactivated क्षेत्र के केंद्र के बीच की दूरी की गणना द्वारा quantified किया जा सकता है (चित्रा 4) समय के एक समारोह के रूप में.

इस विधि के लिए तेजी से एक विस्तृत सरणी, ध्रुवीकरण प्रतिक्रियाओं, अनिवार्य रूप से कुछ भी है कि एक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है की जांच किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, TCR photoactivation जल्दी संकेतन microcluster गठन फ्लोरोसेंट लेबल Grb2 (Grb2-GFP) (चित्रा 5) का उपयोग कर निगरानी करने के लिए उपयोग किया जाता है । तमंचा संचय और centrosome पुनर्अभिविन्यास प्रतिक्रियाओं के समान, Grb2-GFP ध्रुवीकरण photoactivation (चित्रा 5) के बाद शीघ्र ही होता है, और सामान्यीकृत quantified तीव्रता दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रतिदीप्ति किया जा सकता है.

Figure 1
चित्रा 1: Photoactivation photocaged एमसीसी पेप्टाइड का उपयोग कर प्रणाली ।
(क) एमसीसी पेप्टाइड के लिए Photocaged रणनीति । एक NPE समूह एमसीसी पेप्टाइड के lysine अवशेषों से जुड़ा हुआ है । NPE के हटाने में यूवी विकिरण परिणाम, अपने मूल रूप से एमसीसी बहाल । (ख) जब NPE एमसीसी के लिए बाध्य है, 5C । C7 TCR एमसीसी के लिए बाध्य नहीं कर सकते । 5C की मांयता में NPE परिणाम निकालना । C7 देशी एमसीसी पेप्टाइड को TCR । (ग) photocaged रणनीति सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें photocaged ओवा पेप्टाइड यूवी विकिरण पर OT-1 TCR को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: तमंचा संचय और 5C में TCR के photoactivation के बाद centrosome reओरिएंटेशन के समय चूक असेंबल । C7 टी सेल.
5C. C7 सेल एक तमंचा, PKC के साथ मिलकर C1-डोमेन-GFP (c1-GFP) और टैग-आरएफपी Tubulin (आरएफपी-टब), centrosome के लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर से जुड़े युक्त । montages 5C के ध्रुवीकरण प्रतिक्रिया वर्णन । समय के साथ C7 टी कोशिकाओं । पीला अंडाकार और पाठ photoactivation के समय और स्थान का संकेत है । समय के साथ, C1-GFP photoactivated क्षेत्र पर जम जाता है, जिसके बाद photoactivated क्षेत्र की ओर centrosome अभिविन्यास होता है. स्केल बार: 10 µm ।

Figure 3
चित्रा 3: photoactivated क्षेत्र में तमंचा संचय का ठहराव
तमंचा, C1-GFP, photoactivated क्षेत्र में संचय (बाएँ) सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना द्वारा quantified जा सकता है, पृष्ठभूमि सुधार के बाद, photoactivated क्षेत्र पर (नीले छायांकन के साथ पीले वृत्त) समय के साथ. डेटा केवल photoactivation से पहले प्राप्त नौ फ्रेम के सापेक्ष सामान्यीकृत हैं. photoactivated क्षेत्र में C1-GFP संवर्धन का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता के विभाजन से विकिरणित क्षेत्र में पूरे कोशिका के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा गणना की जा सकती है, पृष्ठभूमि सुधार के बाद. समीकरण: ΔF/F = ((fi-fib)/mean (fi1-9)-fib)), जिसमें fi माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता है, में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । photoactivated क्षेत्र में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता तो समय के एक समारोह के रूप में रेखांकन किया जा सकता है (सही) । बैंगनी रेखा photoactivation के समय को इंगित करती है । स्केल बार: 10 µm ।

Figure 4
चित्रा 4: centrosome के ठहराव का ओरिएंटेशन ।
centrosome (आरएफपी-टब) के निर्देशांकों का निर्धारण समय के साथ मैन्युअल रूप से photoactivated क्षेत्र की ओर centrosome पथ पर नज़र रखने (सफेद तीर) हर समय बिंदु पर (बाएँ). photoactivated क्षेत्र के केंद्र के निर्देशांक निर्धारित करें (पीला वृत्त). centrosome और photoactivated क्षेत्र के केंद्र के बीच की दूरी हर समय दूरी के लिए समीकरण का उपयोग कर बिंदु पर गणना की जा सकती है = √ ((x2-x1)2+ (y2-y1)2), जिसमें x2 और वाई 2 centrosome के क्षेत्र के केंद्र के लिए x और y निर्देशांक हैं, और x1 और y1 photoactivated क्षेत्र के केंद्र के x और y निर्देशांक हैं । हर समय बिंदु पर photoactivated क्षेत्र के केंद्र से centrosome की दूरी तो समय के एक समारोह के रूप में ग्राफी किया जा सकता है (सही) । बैंगनी रेखा photoactivation के समय को इंगित करती है । स्केल बार: 10 µm ।

Figure 5
चित्र ५: Grb2-GFP microcluster गठन.
(क) प्रतिनिधि 5C. C7 सेल ने फ्लोरोसेंट लेबल Grb2 (Grb2-GFP) व्यक्त की । montages Grb2-GFP ओवरटाइम का ध्रुवीकरण प्रतिक्रिया वर्णन । पीला अंडाकार और पाठ photoactivation के समय और स्थान का संकेत है । समय के साथ, photoactivated क्षेत्र में Grb2-GFP जम जाता है । (ख) समय के साथ photoactivated क्षेत्र में Grb2-GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता का ठहराव. N = 15 कोशिकाओं । (ग) photoactivated अंचल के बाहर एक नियंत्रण क्षेत्र में Grb2-GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता का ठहराव. N = 15 कोशिकाओं ।

Figure 6
चित्रा 6: photoactivation और TIRF इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप विन्यास ।
४८८ एनएम और ५६१ एनएम पराबैंगनीकिरण क्रमशः हरे और लाल जांच के TIRF और epifluorescence इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है । photoactivation के लिए यूवी प्रकाश एक पारा (पारा) दीपक एक डिजिटल डायाफ्राम छोटे, उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों रोशन करने में सक्षम प्रणाली से जुड़ी से लिया जाता है । पारा लैंप से प्रकाश/डायाफ्राम एक longpass dichroic दर्पण है कि इमेजिंग पराबैंगनीकिरण को दर्शाता है के नीचे तैनात दर्पण द्वारा नमूने पर प्रतिबिंबित है । dichroic दर्पण यूवी प्रकाश पारित करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हाल के वर्षों में, प्रकाश सेलुलर प्रक्रियाओं के spatiotemporally नियंत्रित सक्रियण के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में उभरा है । विभिंन तरीकों से विकसित किया गया है, जुड़े लाभ और नुकसान के साथ प्रत्येक । यहां वर्णित प्रणाली, जो decaging मैटीरियल, extracellular लाइगैंडों के आधार पर है, के लिए आदर्श रूप से तीव्र, उपसेलुलर, ध्रुवीय संकेतात्मक प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूल है । इस दृष्टिकोण के रूप में ऊपर वर्णित टी कोशिकाओं में गठन की जांच करने के लिए लागू किया गया है । इसके अतिरिक्त, अंय रिसेप्टर्स के लिए बंदी लाइगैंडों इंजीनियर गया है, हमें सक्षम करने के लिए प्राकृतिक हत्या की कोशिकाओं और प्रतिलेखन कारक NF के परमाणु translocation में संकेत निरोधात्मक का आकलन करने के लिए एक ही रणनीति लागू करने के लिए रिसेप्टर की तरह टोल के जवाब में κB सिग्नलिंग14,15.

इस प्रोटोकॉल में, stimulatory लाइगैंडों यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे इमेजिंग प्रयोग की अवधि के लिए एक स्थिर, उत्तेजना के ध्रुवीय स्रोत के रूप में रहने के लिए मैटीरियल हैं । यह दृष्टिकोण सेल ध्रुवीकरण के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । यह हालांकि ध्यान दिया जाना चाहिए, कि TCR photoactivation दृष्टिकोण आसानी से समर्थित लिपिड bilayers पर अस्थायी नियंत्रित टी सेल सक्रियण के लिए अनुकूलित है. जाहिर है, एक इस संदर्भ में निरंतर, ध्रुवीकरण उत्तेजना हासिल नहीं कर सकते । यह अनावश्यक हो सकता है, तथापि, प्रयोगात्मक उद्देश्यों को देखते हुए ।

प्रणाली भी decaging के लिए यूवी प्रकाश स्रोत के संबंध में काफी लचीला है । वर्तमान में, एक १०० डब्ल्यू पारा दीपक रोशनी ध्यान केंद्रित के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक स्पंदित नाइट्रोजन लेजर (पल्स चौड़ाई 4 एनएस, पल्स ऊर्जा १२० एम एम), पहले6इस्तेमाल किया गया था । कई बार, एक हाथ में यूवी लैंप (३६५ एनएम, 4 डब्ल्यू) इमेजिंग नमूना पर तैनात किया गया है ताकि photostimulatable ligand के बड़े क्षेत्रों को पिंजरे में रखना । decaging प्रणाली की विशिष्ट सुविधाओं के प्रत्येक मामले में सवाल में प्रयोग की तकनीकी आवश्यकताओं पर निर्भर करेगा ।

जब इस प्रणाली को लागू करने, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मनाया प्रतिक्रियाओं photoactivation घटना के लिए विशिष्ट हैं, और नकली रिसेप्टर सक्रियण या यूवी प्रेरित धूप का परिणाम नहीं. इन कलाकृतियों को शासन करने के लिए, दो विशिष्टता नियंत्रण किया जा सकता है । पहला, photoactivation प्रयोगों के दौरान सीधे विकिरणित नहीं हैं कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता पर नजर रखी जा सकती है. यदि सतह को ठीक से पिंजरे में रखा गया है, तो इन कक्षों में प्रशंसनीय प्रतिक्रियाओं को नहीं देखा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, चित्र 5C) । दूसरा, प्रयोगों में जो टी कोशिकाओं यूवी विकिरणित photoactivatable लाइगैंडों कमी सतहों पर प्रदर्शन किया जा सकता है । यह नियंत्रण photoactivatable ligand से स्वतंत्र हैं जो यूवी-प्रेरित प्रभाव की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, संदर्भ 6 देखें) । प्रणाली अनुकूलन के दौरान, यह भी बेहद उपयोगी है हाथ में एक मजबूत सेलुलर इमेजिंग प्रतिक्रिया (जैसे, Grb2-GFP भर्ती) है कि दोनों तेजी से और स्थानीय है । सिग्नलिंग घटनाओं और photoactivation के बीच सहसंबंध का आकलन करना अधिक सरल है अगर उन घटनाओं रिसेप्टर उत्तेजना को spatiotemporally समीपस्थ हैं.

हालांकि photoactivation दृष्टिकोण रिसेप्टर संकेतन पर अति सुंदर spatiotemporal नियंत्रण प्रदान करता है, यह transfectable optogenetic सिस्टम द्वारा वहन अनुकूलन क्षमता का अभाव है16,17,18,19 ,20,21,22. कुछ optogenetic प्रोटीन भी photoreversible हैं, जो सशर्त नियंत्रण प्रदान करते हैं जो यहाँ वर्णित photoactivation दृष्टिकोण के साथ उपलब्ध नहीं है । optogenetic प्रणालियों में, तथापि, photoactivated प्रोटीन के प्रसार को विवश तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । यह विशेष रूप से एक उपसेलुलर संदर्भ में, ध्रुवीय संकेतन के विश्लेषण पेचीदा है ।

एक यह भी ध्यान रखना चाहिए कि इस photoactivation प्रणाली की आकर्षक इकाई एक कांच की सतह है, जो बोना के सभी पहलुओं को सेल-सेल इंटरैक्शन के दोहराऊंगा नहीं कर सकती. इस मुद्दे को दरकिनार जबकि संकेत दीक्षा के spatiotemporal नियंत्रण को बनाए रखने, जांचकर्ताओं एक ऑप्टिकल जाल प्रणाली का इस्तेमाल किया है एक टी सेल के साथ संपर्क में एक APC लाने के लिए, cytoskeletal पुनर्व्यवस्थाओं की शुरुआत के लिए अनुमति है और हो परिपक्वता है वास्तविक समय में23visualized । हालांकि इस प्रणाली को सटीक दीक्षा और cytoskeletal गतिशीलता के दृश्य एक वास्तविक APC का उपयोग कर सक्षम बनाता है, यह अपेक्षाकृत कम प्रवाह है और TIRF रोशनी है, जो प्रतिकूल छवि गुणवत्ता को प्रभावित करता है के साथ संगत नहीं है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि टी सेल के भीतर TCR प्रेरित संकेत के spatiotemporal नियंत्रण प्रदान करता है, अंततः TCR सक्रियण निंनलिखित तेजी से जैव रासायनिक परिवर्तन के elucidation के लिए अनुमति देता है । इस प्रणाली हमें एक बेहतर समझ कैसे TCR सक्रियकरण निंनलिखित संकेत घटनाओं टी सेल ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने के लिए, गठन है, और अंततः प्रभाव प्रतिक्रियाओं के वितरण का मतलब है के साथ प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सलाह और सहायता के लिए हुँसे लैब के सदस्यों को धंयवाद । स्वास्थ्य के अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित (R01-AI087644 को M.H. और P30-CA008748 को मेमोरियल Sloan-Kettering कैंसर सेंटर).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermofischer Scientific 155361
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin Thermofischer Scientific 20217 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin Thermofischer Scientific 434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500 Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK  For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK  Anaspec Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody BD Biosciences 553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb Anaspec Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db  Anaspec Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1  For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp UVP UVGL-25 Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system. Olympus Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm Andor
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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १३४ टी लिम्फोसाइटों टी सेल रिसेप्टर (TCR) सिग्नल Transduction सेल पोलर Centrosome Photochemistry मेजर Histocompatibility कॉम्प्लेक्स (Pmhc) Centrosome टोटल इंटरनल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (TIRF) इम्यूनोलॉजी सेल जीव विज्ञान
एक Photoactivatable एगोनिस्ट का उपयोग कर टी सेल सक्रियण के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण
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Sanchez, E., Huse, M. Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist. J. Vis. Exp. (134), e56655, doi:10.3791/56655 (2018).

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