Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver kombinasjon bruken av ChIP-seq, 4sU-seq, totalt RNA-seq og ribosom profilering for linjer og primære celler. Det kan spore endringer i transkripsjon-faktoren bindende, de novo transkripsjon, RNA behandling, omsetning og oversettelse over tid og vise samlede hendelsesforløpet i aktivert og/eller raskt skiftende celler.

Abstract

Ved aktivering, cellene raskt endre sine funksjonelle programmer og dermed, gene expression profilen. Store endringer i genuttrykk oppstår, for eksempel under differensiering, morphogenesis og funksjonelle stimulering (for eksempel aktivering av immunceller), eller etter eksponering for narkotika og andre faktorer fra det lokale miljøet. Avhengig av hvilken stimulans og celle skjer disse endringene raskt og på alle mulige genet regulering. Viser alle molekylære prosesser i cellen svarer til en bestemt type stimulans/narkotika er en av de vanskeligste oppgavene i molekylærbiologi. Her beskriver vi en protokoll som samtidig analyse av flere lag av genet. Vi sammenligner, spesielt transkripsjon faktor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sekvenser (ChIP-seq)), de novo transkripsjon (4-thiouridine-sekvenser (4sU-seq)), mRNA behandling, og omsetning samt oversettelse (ribosom profilering). Ved å kombinere disse metodene, er det mulig å vise en detaljert og genom hele løpet av handlingen.

Sekvensering nylig transkribere RNA anbefales spesielt når analyserer raskt tilpasse eller endre systemer, siden dette viser transcriptional aktiviteten til alle gener i løpet av 4sU eksponering (uavhengig av om de er opp- eller downregulated). Kombinasjon bruk av totale RNA-seq og ribosom profilering gir i tillegg beregningen av RNA omsetning og oversettelse priser. Bioinformatic analyse av høy gjennomstrømming sekvensering resultater gir mange midler for analyse og tolkning av dataene. Genererte data kan også spore co-transcriptional og alternativ skjøting, bare for å nevne noen mulige utfall.

Kombinert tilnærming beskrevet her kan brukes for ulike modell organismer eller celletyper, inkludert primær celler. Videre vi tilbyr detaljert protokoller for hver metode brukes, inkludert kvalitetskontroll, og diskutere potensielle problemer og fallgruver.

Introduction

De siste årene, har RNA-sekvenser (RNA-seq) blitt det standard verktøyet for å analysere alle uttrykt RNAs i en celle eller en organisme1. For å forstå hele prosessen med celler tilpasse svar på en bestemt stimulans/narkotika, er det imidlertid nødvendig å fullt ut bestemme alle underliggende prosesser, alt fra mRNA transkripsjon til behandling, omsetning og oversettelse. Kortvarige endringer i RNA transkripsjon kan neppe måles ved totalt RNAseq, siden endringer av totalt avhengig av faktorer f.eks RNA halv-liv og transcriptional aktivitet, som er en dårlig mal for reflekterer tilpasningen av celler miljømessige effekter2,3. Faktisk en rekke nye sekvensering teknikker er utviklet at en analyse av de ulike trinnene i prosessen genet regulering4 sammen på riktig måte. Denne protokollen beskriver hvordan kombinere noen ganske enkelt gjeldende sekvensering teknikker som tillater sporing regulering av viktige lag av mRNA i en komparativ måte. For å analysere transcriptional aktivitet, en rekke metoder har blitt beskrevet, som Cap-analyse av gene expression (bur)5, innfødt forlengelse transkripsjon sekvensering (NET-seq)6og genom hele kjernefysiske løpe (GRO-seq)7 , 8, samt bromouridine-sekvenser (Bru-seq) og 4-thiouridine-sekvenser (4sU-seq), som bruker metabolitter som er innlemmet i nylig transkribert RNA9,10, bare for å nevne noen. Mens bur identifiserer startwebstedet eksakt transkripsjon, NET-seq og GRO-seq levere informasjon om lesing retninger og 4sU-seq (som er metoden som er beskrevet her) oppdager bare nylig transkribert RNA. Men 4sU-seq er svært sensitive, og kan brukes i ulike tidsrammer måle kvantitative transcriptional aktivitet i aktivt å endre celler, samt kvantitative endringer i mRNA behandling (som skjer innen minutter)9, 11,12. Videre er 4sU-seq ideelt for å kombinere med RNA-seq beregne RNA Omsetningshastigheten for gener9. Transkripsjon av mRNA utføres av RNA Polymerase II (RNAPII), som igjen blir påvirket av en rekke faktorer, som transkripsjonsfaktorer, histone modifikasjoner og generell aktivatorer/repressors som kan også være en del av den transcriptional komplekse. For å teste hvor mange genet/Promotor/enhancer regioner er bundet av en faktor, er ChIP-seq utviklet, som er nå standard metode for dette formålet på grunn av mange kommersielt tilgjengelig antistoffer13. Men selv om ChIPseq gir klar informasjon på hvor regulere faktorer bind, reflekterer den ikke hvis det faktisk fører til endringer i transkripsjon14. Utføre ChIP-seq med 4sU-seq er derfor en ideell kombinasjon for slike biologiske spørsmål. Regulering av genuttrykk kan også oppstå på et senere tidspunkt, siden mRNA og protein ikke nødvendigvis samsvarer15,16, indikerer potensielt betydelige regulering på translasjonsforskning eller post-translasjonell nivå, avhengig av konteksten. Året 2011 ribosom profilering hadde vært først sammen med RNA-seq og er nå metoden for valg å kvantifisere endringene som skjer raskt i protein, siden det er fortsatt noen følsomhet grenser med massespektrometri17. Faktisk oversettelse priser fra slike metoder har blitt vist å levere et relativt godt anslag av endringer i protein nivå (minst målt for langsiktige endringer) og tillate en enda mer detaljert visning på prosessen med oversettelse, f.eks den fastsettelse av starten side og alternativ oversettelse rammer17. Kombinasjon bruk av alle fire metoder kan brukes i steady state, mellom ulike celletyper, eller i en tid-føljetong eksperimentere en raskt skiftende celle11. Dette gir en genomet-bred oversikt over endringer i transkripsjon faktor binding påvirke RNA transkripsjon, behandling og oversettelse.

Protocol

Alle metoder er i samsvar og overholdelse av Helmholtz Zentrum München institusjonelle, statlige og føderale retningslinjer.

1. forberedelse

  1. Lage en detaljert plan for eksperimentell inkludert en tidsplan, når legge 4sU til celle kultur medium og når å høste celler for hver metode. Avhengig av biologiske spørsmålet, nøye vurdere tidspunkt for eksempeltegningen, 4sU-merking tid og konsentrasjon (tabell 1).
    Merk: Kontrollere virkningen av 4sU på cellen levedyktighet og stress respons på forhånd (se "Bekreft optimale 4sU-merking forhold" i representant resultater og figur 1). Det anbefales å foreløpig teste hver metode med minst en prøve. Kontroller om kvaliteten og mengde RNA/DNA er tilstrekkelig for dyp sekvensering (se dedikert deler av protokollen), og praksis rask men milde håndtering av cellene under eksperimentet.
  2. Beregne antall celler nødvendig for hvert punkt i hver metode (se tabell 2 for en grov estimering ved primær T-celler). Også vurdere sekvensering færre prøver av totale RNA enn bare 4sU RNA (f.eksbare for tiden punkt oversettelse priser eller RNA omsetning priser skal beregnes). For å bekrefte og kontrollere betydningen av resultatene (anbefales), kan du opprette minst én biologiske replikere.
    Merk: Viktigere, alle metoder og påfølgende tidspunkt, prøver må være fra samme start utvalg av celler. Minst én dedikert forsker for hver metode anbefales.
  3. Forbered alt nødvendig på forhånd (f.eks, aliquoted 4sU, gapestokk, pattedyr lyseringsbuffer og 1% formaldehyd). Etter tillegg av 4sU, unngå å utsette cellene til lys, da dette kan føre til crosslinking av 4sU-merket til mobilnettet proteiner18.
  4. Samle alle celler av interesse i én kolbe like før behandling (figur 2). Telle celler (f.eksmed en hemocytometer) og bruke det nødvendige beløpet for ubehandlet kontroll av hver metode (ikke glem å også merke kontrollen ubehandlet for 4sU-seq med 4sU). Behandle gjenværende celler og umiddelbart delt antall celler for hvert punkt og metode. Håndtere celler så raskt som mulig for å minimere stress på grunn av endringer i temperatur og CO2 -nivåer.
    Merk: For eksempel prøvene er tatt 1 h, 2 h, og 3t etter behandling, så en fjerdedel av cellene brukes for ubehandlet kontroll, og tre fjerdedeler brukes for behandlet kontrollen.

2. 4sU-merking

Merk: Denne protokollen er endret fra Rädle, et al. 19 se deres protokoll for ytterligere informasjon angående metabolske merking med 4sU. For alle metodene og påfølgende tidspunkt, må prøver begynne fra samme start utvalg av celler.

  1. Start av merking
    1. Tine aliquoted 4sU like før bruk. Legge til 4sU på hvert tidspunkt direkte til mediet som inneholder cellene rundt (se tabell 2 for anbefalt T celle tall, minst 60 µg RNA per punkt), bland forsiktig, og plassere tilbake i inkubator. Kast gjenværende 4sU (ikke refreeze).
    2. På slutten av merking, samle celler (f.eks, celle skraper) og sentrifuge 330 x g for 5 min på 4 ° C i polypropylen rør (som motstå høy g krefter). Sug opp middels og legge reagens RNA isolering (≥1 mL per 3 x 106 celler, se materialer for anbefaling å bruke) til hver tube. Fullt resuspend pellets (≥1 mL per 3 x 106 celler), ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT) og fryse samples ved 20 ° C. Eksempler kan lagres på 20 ° C i minst en måned.
      Forsiktig: Reagenser brukes for RNA isolasjon er ekstremt farlig når komme i kontakt med hud og øyne. Håndtere disse med omsorg og vurdere sikkerhetsinstruksjonene.
  2. RNA forberedelse bruke endret RNA isolasjon protokollen
    1. Legg 0,2 mL kloroform per 1 mL reagens RNA isolering, og bland godt av risting for 15 s. Fortsett som nevnt i metabolske merking protokollen (trinn 1-12, 2. RNA forberedelse bruke endret trizol protocol) fra Rädle et al. 19
    2. Måle RNA konsentrasjon (se Tabell for materiale), i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk denne RNA for totalt RNA-seq også (se trinn 3. Totalt RNA-seq) eller lagre-80 ° c i minst 1 måned.
  3. Thiol-spesifikk Biotinylation av nylig transkribere RNA
    1. Start med 30-80 µg av totale mobilnettet. 60 µg RNA skal gi tilstrekkelig mengder nylig transkribere RNA.
    2. Forberede merking reaksjon. Pipetter i følgende rekkefølge (per µg RNA): 1 µL 10 x Biotinylation Buffer, 7 µL RNA (inneholder 1 µg RNA fortynnet i nuclease-fri H2O), og 2 µL biotin-HPDP (1 mg/mL). Legg biotin-HPDP siste og bland umiddelbart av pipettering. Pakk rør med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys. Se diskusjonen for en alternativ å biotin-HPDP. Ruge på RT 1.5 h med rotasjon.
    3. Sentrifuger riktig 2 mL rør (se Tabell for materiale) på 15.000 x g for 2 min. Pipetter alle biotinylated RNA i pre spunnet 2 mL tube, legge til en lik mengde kloroform og bland kraftig. Inkuber for 2-3 min til faser begynner å skille og bobler begynner å forsvinne.
    4. Sentrifuger 15.000 x g i 15 min på 4 ° C. Nøye overføre den øvre vandige fasen til en ny tube.
    5. Gjenta 2.3.3. og 2.3.4. en gang. Legge til 10% av volumet av NaCl (5 M) og en lik mengde isopropanol i den vandige fasen. Sentrifuge 20.000 x g for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    6. Legge til en like volum nylagde 75% etanol. Sentrifuge på 20.000 x g. Forkast nedbryting, spin kort og fjerne de gjenværende etanol. Fullt resuspend i 30-100 µL H2O (bruk 1 µL H2O per 1 µg input RNA fra trinn 2.3.1) ved å blande pipette.
    7. Kontroller RNA integritet av electrophoretic analyse, eller ta en aliquot og kontroller senere.
  4. Separasjon av nylig transkribert (merket) og eksisterende (umerkede) RNA
    1. Fjern spinn perler (se Tabell for materiale) fra 4 ° C lagring og la den stå i minst 30 min å bringe dem til romtemperatur. Varme 4sU vask buffer (3 mL per prøve) til 65 ° C.
    2. Forberede 100 mM dithiothreitol (DTT) løsning. Veie DTT på en ultra tynn skala og legge til den nødvendige mengden av nuclease-fritt vann. Alltid forberede frisk. Bruk 200 µL per prøve.
    3. Varme biotinylated RNA prøver (1 µg/µL) til 65 ° C i 10 min denature og samme sted på is. Legge til 100 µL streptavidin perler biotinylated RNA og ruge på RT i 15 min med rotasjon.
    4. Plasser en riktig kolonne (se Tabell for materiale for anbefalinger) for hver smak til den magnetiske stå og pre equilibrate hver kolonne med 1 mL romtemperatur 4sU vask buffer.
      Merk: Dette vil ta ca 5-10 min. Hvis noen av kolonnene ikke starter drenering etter 5 min, kan du trykke forsiktig på toppen av kolonnen med hansker fingeren.
    5. Bruke en RNA/perler blanding på midten av hver kolonne. Kast gjennomflytsenhet, med mindre umerkede RNA må gjenopprettes. Hvis ja, samle gjennomflytsenhet og minst de første vasken. Utføre gjenoppretting av RNA som beskrevet av Rädle et al. (trinn 1-7, 7. Gjenoppretting av umerkede, ubundne)19.
    6. Vask tre ganger med 0.9 mL 4sU vask buffer (forvarmet til 65 ° C fra trinn 2.4.2.) og 0.9 mL RT 4sU vask buffer, henholdsvis.
    7. Bruk spinn perler for å gjenopprette nylig transkribere RNA. Pipetter 400 µL av godt spredt RT spinn perler i et rør per eksempel og sted under hver kolonne. Elute nylig transkribere RNA med 100 µL 100 mM DTT. Vent 3 min og utføre en andre elueringsrør med 100 µL 100 mM DTT. (Valgfritt: Utfør elueringsrør og gjenoppretting som beskrevet av Rädle et al.) 19
    8. Mix nylig transkribert RNA/perler grundig av pipette blande 10 ganger og fortsetter i henhold til produsentens retningslinje. Elute RNA i 11 µL nuclease-fri H2O.Quantify RNA bruker en egnet fluorometer (se Tabell for materiale). RNA kan lagres ved-80 ° C i minst en måned.
      Merk: Nylig transkribert RNA kan brukes til å forberede cDNA biblioteker for neste generasjons sekvensering (se Tabell for materiale for et forslag som Kit bruke) eller fremme nedstrøms analyser. 100 - 500 ng RNA er nok for de fleste biblioteket forberedelse kits (se diskusjon).

3. total RNA-Seq

  1. Ta direkte RNA fra 4sU merket RNA etter RNA forberedelse bruker endret reagensen for RNA isolasjon protokollen for totalt RNA-seq (se trinn 2.2.2.)
  2. For biblioteket forberedelse, fortynne en RNA aliquot til en siste konsentrasjon av 50-100 ng / µL. Bruk samme kit for biblioteket forberedelsen av nylig transkribere RNA. 100 - 500 ng RNA er nok for de fleste biblioteket forberedelse kits.

4. ribosom profilering

Merk: Alle metoder og påfølgende tidspunkt, prøver må være fra samme start utvalg av celler. For anbefalinger om hvilke kit å bruke, bruke Tabellen for materiale.

  1. Forberedelse og isolering av ribosom beskyttet fragmenter (RPFs):
    1. Bruk passende mengder av celler for hvert punkt (se tabell 2 for anbefalt T celle tall). Behandle tilhenger celler med gapestokk som beskrevet i produsentens protokollen.
      Forsiktig: Gapestokk er svært giftig og kan føre til mutasjoner. Unngå hudkontakt og innånding.
    2. Samle og basseng ikke - eller semi - adherent celler fra hver gang peker en polypropylen tube og justere siste konsentrasjonen til 1 x 106 celler per mL av celle-spesifikke medium (f.ekssupplert RPMI for T celler). Legge gapestokk med en siste konsentrasjon av 0,1 mg/mL, bland ved å snu polypropylen røret og ruge i 1 sentrifuge celler for 5 min på 330 x g på 4 ° C. Sug opp medium og vask celler med minst 10 mL PBS med gapestokk (siste konsentrasjon på 0,1 mg/mL).
    3. Sentrifuger celler for 5 min på 330 x g på 4 ° C. Sug opp middels og legge 100 µL pattedyr celle lyseringsbuffer per 10 x 106 celler. Blande av pipettering og utvise gjennom en steril 22 25-gauge nål til lyse cellene helt.
    4. Overføre cellen lysate slik forkjøles 1,5 mL. Inkuber i 10 min på is med periodiske inversjon. Sentrifuge for 10 min 20 000 x g på 4 ° C å avklare den lysate. Overføre nedbryting slik forkjøles 1,5 mL.
    5. Forberede en 1:10 fortynning av den lysate med nuclease-fritt vann og post en260lesing bruker et spektrofotometer. Bruke nuclease-fritt vann som en tom og en 1:10 fortynning av pattedyr celle lyseringsbuffer som standard. Beregne A260/mL konsentrasjonen av lysate etter denne formelen:
      (En260 celle lysate - en260 pattedyr lyseringsbuffer) x 10 fortynningsfaktoren = en260/mL
    6. Opprett 200 µL dele den lysate på is og fortsette med nuclease behandling.
      Merk: Du kan også forberede en 100 µL aliquot totale RNA, Legg 10 µL av 10% SDS og bland. Lagre på 4 ° C og fortsette med 4.3.2. Anbefales å bruke totalt RNA fra 4sU-merket RNA (se trinn 3. Totalt RNA-seq).
  2. Ribosom footprinting
    1. Utføre nuclease behandling umiddelbart uten frysing av lysate. Legge til 7,5 enheter av nuclease (inkludert i anbefalte kit) for hver A260 av lysate. For eksempel: 80 A260/mL lysate x 0,2 mL lysate x 7,5 U/A260nuclease = 120 U nuclease.
      Merk: Sjarmere eventuelt nuclease for fordøyelsen som beskrevet av produsenten.
    2. Inkuber nuclease reaksjonen for 45 min på RT med mild miksing. Fryse 200 µL dele lysate med flytende nitrogen og lagre ved-80 ° C, eller stoppe reaksjonen nuclease ved å legge til 15 µL RNase hemmer hver 200 µL aliquot og fortsett med trinn 4.3.2.
  3. Rensing av RPFs
    1. Frigi en prøve av nuclease fordøyd RPFs og legge 15 µL RNase hemmer. Holde prøvene på is.
    2. Rense RPFs i henhold til produsentens protokollen (kolonne rensing anbefales) og måle RNA konsentrasjonen på et spektrofotometer.
  4. rRNA uttømming
    1. Bruke 5 µg av renset RPFs rRNA uttømming.
    2. Følg produsentens protokoll (trinn 1-2, primære rRNA uttømming) for rRNA uttømming. Mål RNA konsentrasjon av rRNA utarmet RPFs på et spektrofotometer.
  5. SIDEN rensing av RPFs
    1. Bruk 500 ng av rRNA utarmet RPFs for siden rensing.
    2. Forberede RNA kontroll, prøver og stige siden rensing. Mix 5 µL RNA kontroll og 5 µL denaturing gel lasting fargestoff i en 0,5 mL microcentrifuge tube. Bland 10 µL av hver RPF med 10 µL av denaturing gel lasting, henholdsvis. Forberede en stige aliquot (4 µL 20/100 stigen, 1 µL nuclease-fritt vann og 5 µL denaturing gel lasting fargestoff). Last hver populasjonsutvalg og kontroll for å hindre crosscontamination.
    3. Denature prøver og stige av rugende ved 95 ° C i 5 min og umiddelbart sted på is. Laste 20 µL av hvert utvalg (eventuelt laste 10 µL og fryse gjenværende samples ved 20 ° C) med 10 µL av forberedt ladder på en 12% eller 15% urea-polyakrylamid gel. Laste inn 10 µL av RNA kontroll. Kjøre gel til bromophenol blå bandet når bunnen av gel (180 V ~ 70 min) (Figur 3).
    4. Flekk gel i henhold til produsentens protokollen på 4 ° C. Bruk en mørk-feltet transilluminator som avgir blått lys å visualisere RNA. Avgiftsdirektoratet gel skiver for hver prøve tilsvarer ~ 28 og 30 nt i lengde. Ta RNA kontroll som referanse og skride.
      Merk: RPFs er knapt synlig. Avgiftsdirektoratet skiver på størrelsen angitt med kontrollen RNA - inneholder to oligos av 28 og 30 nt i lengde - selv om prøvene ikke er synlige.
    5. Punktere hull i bunnen av 0,5 mL microcentrifuge rør med en steril nål 20-gauge. Overfør hver gel skive til en separat tube og sted avkortet rør i en 1,5 mL tube. Sentrifuger i 2 minutter på 12.000 x g. Gjenta sentrifugering hvis gel skiver ikke er helt bryte inn i 1,5 mL røret.
    6. Elute RNA fra forstyrret gel skiver med 400 µL nuclease-fritt vann, 40 µL ammonium acetate (5 M) og 2 µL SDS (10%) hver overnatting på 4 ° C.
    7. Overføre til slurry til 1,5 mL filter rør (leveres med anbefalte kit) med 1 mL pipette tips (wide-fødte tips eller Self-Made 1 mL tips med cut slutten). Sentrifuge for 3 min 2000 x g å skille elut RNA fra gel sektorene. Pipetter forsiktig vandig løsning i en 1,5 mL tube. Tilsett 2 µL glykogen (leveres med anbefalte kit) og 700 µL 100% isopropanol og butikk på-20 ° C i minst 1 time.
    8. Sentrifuge på 4 ° C etter 20 min på 13000 x g. Forkast nedbryting. Vask pellets med pre kjølt nylagde 80% etanol ved 4 ° C i 10 min på 13.000 x g. Forkast nedbryting og air-dry. Resuspend hvert utvalg i 20 µL og kontrollen RNA i 8 µL nuclease-fritt vann. Lagre på 20 ° C om nødvendig.
  6. Fragmentering, slutten reparasjon, 3 adapter Ligation, omvendt transkripsjon
    1. Følg fremgangsmåten som beskrevet av produsentens protokollen (fragmentering og slutten reparasjon, 3 kort ligatur og omvendt transkripsjon).
  7. SIDEN rensing av cDNA
    1. Forberede prøver, RNA kontroll og stige siden rensing: Bland 10 µL av hver prøve og RNA kontroll med 10 µL denaturing gel lasting fargestoff, henholdsvis. Forberede en stige aliquot (4 µL 20/100 stigen, 1 µL nuclease-fritt vann, 5 µL denaturing gel lasting fargestoff). Last hver populasjonsutvalg og kontroll for å hindre crosscontamination.
    2. Denature prøver og stige av rugende ved 95 ° C i 5 min og umiddelbart sted på is. Laste 20 µL av hvert utvalg (eventuelt laste 10 µL og fryse gjenværende samples ved 20 ° C) med 10 µL av forberedt stige til en 10% polyakrylamid/7 - 8 M urea/TBE gel. Laste inn 10 µL av RNA kontroll. Løpe gel til bromophenol blå helt overfører av gel (180 V ~ 60 minutter).
    3. Flekk gel i henhold til produsentens protokollen på 4 ° C. Bruk en mørk-feltet transilluminator som avgir blått lys å visualisere RNA og avgiftsdirektoratet gel sektorene for hvert utvalg tilsvarer ~ 70-80 nt.
    4. Fortsett som beskrevet i trinn 4.5.5 - 4.5.8 og resuspend hver prøve i 10 µL nuclease-fritt vann.
  8. cDNA Circularization
    1. Klargjør nok circularization master blandingen for alle reaksjoner ved å kombinere følgende reagensene hvert utvalg på is: 4.0 µL Circularization reaksjonen blanding, 2.0 µL ATP, 2.0 µL MnCl2og 2.0 µL Ligase.
    2. Legge til 10 µL av master mix hvert utvalg. Bland forsiktig og sentrifuge kort. Inkuber eksempler på 60 ° C i 2 h. umiddelbart sted eksempler på is.
  9. PCR forsterkning
    1. Følg produsentens protokoll (trinn 1-3, PCR forsterkning) for PCR forsterkning. Bruk 4 µL av circularized cDNA for forsterkning med 9 PCR sykluser for primær T-celler, for å oppnå best resultat.
    2. Rense biblioteker og sjekk deres størrelse-distribusjonen, ifølge produsentens protokollen (trinn 4-8, PCR forsterkning). Forventet forsterket biblioteket er 140-160 bp (se Figur 4).
    3. Sekvensering biblioteker, se produsentens protokollen og sekvensering anlegget for videre veiledning.

5. chIP-Seq

Merk: Denne protokollen er endret fra Blecher-Gonen, et al. 14 se deres protokoll for mer informasjon om ChIP-seq. For alle metodene og påfølgende tidspunkt, må prøver være fra samme start utvalg av celler.

  1. Crosslinking og høsting cellene
    1. Krysskobling riktig antall celler (se tabell 2 for anbefalt T celle tall) for hvert tidspunkt med en siste konsentrasjon av 1% formaldehyd i en cellspecific medium (f.ekssupplert RPMI for T celler) for 10 min ved romtemperatur med milde rocking. Stoppe crosslinking reaksjonen ved tilsetning av glysin til en siste konsentrasjon av 0.125 M.
    2. Sentrifuger celler på 330 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting og vask cellene i iskalde PBS. Gjenta trinn 5.1.2 to ganger og fryse celle pellets på-80 ° C. Frosset pellets kan lagres i minst 6 måneder.
  2. Cellen Lysis og Sonication
    Merk: Under alle cellen lyse og sonication trinnene, prøver holdes på isen eller i 4 ° C å minimere krysskobling reversering og protein fornedrelse.
    1. Resuspend celle pellets i 1 mL iskald celle lyseringsbuffer med fersk lagt proteasehemmere isolere kjerner (Legg fosfatase hemmere valgfritt). Inkuber i 10 min på is og sentrifuge 2600 x g for 5 min på 4 ° C.
    2. Sug opp nedbryting og resuspend kjerner pellet i 1 mL iskald kjerner lyseringsbuffer med fersk lagt proteasehemmere (alternativt: Legg fosfatase hemmere). Inkuber i 10 min på is. Sonicate cellene for å generere en betyr DNA størrelse brøkdel av 0.2 - 1.0 kb (se figur 5).
      Merk: Sonication betingelser må optimaliseres i henhold cellen og videre forhold (f.eks, celle nummer, volum og buffer). Primær T-celler bør sonication for 20-25 sykluser (se materialer detaljert beskrivelse).
    3. Ta en 20-50 µL aliquot skråstilte chromatin og varme i 10 min på 95 ° C og 1000 rpm risting for å utføre en Hurtig bakover krysskobling og kontrollere chromatin størrelse. Legg til 2-5 µL proteinasen K og ruge etter 20 min på 56 ° C og 1000 rpm risting. Utføre varme inaktivering for 10 min på 95 ° C og 1000 rpm risting. Rense chromatin med en passende kit (se Tabell for materiale). Sjekk chromatin størrelsen på en 1% agarose gel og bruk 100 bp pluss markør.
    4. Sentrifuge skråstilte chromatin med en gjennomsnittlig DNA størrelse brøkdel av 0.2 - 1.0 kb for 10 min på 20.000 x g og 4 ° C for å pellets uløselig chromatin og rusk. Overføre nedbryting til en ny tube og holde på isen.
    5. Beholde 5-10% av sonicated chromatin som inndata. Fryse på 20 ° C (brukt i trinn 5.5.2).
  3. Par mot perler
    1. Par 10 µg antistoff (f.eksanti-RNA Pol II; anti-Luton H3K36me3) i 220 µL PBS (0,5% BSA og 0,5% mellom 20) til 80 µL superparamagnetiske perler kombinert protein G (se Tabell for materiale) minst 1t ved romtemperatur med rotasjon.
    2. Plass rør på en magnet. Vent til alle perler er bundet til magneten og fjerne nedbryting. Ytterligere blokk med 6 µL sonicated laks sperm DNA i PBS (0,5% BSA og 0,5% mellom 20) i 30 min ved romtemperatur med rotasjon.
    3. Plass rør på en magnet. Vent til alle perler er bundet til magneten og fjerne klart nedbryting. Vask perler med ChIP IP buffer tre ganger.
  4. Chromatin Immunoprecipitation
    1. Fortynn chromatin 1 mL totalt volum i kjerner lyseringsbuffer med fersk lagt proteasehemmere (eventuelt legge fosfatase hemmere). Legge til ChIP IP buffer med fersk lagt proteasehemmere (eventuelt legge fosfatase hemmere) til et endelig antall 3 mL. Holde på isen eller i 4 ° C, mens antistoff er koplet til perler.
    2. Legg utvannet chromatin til antistoffer kombinert perler fra trinn 5.3.3 og ruge over natten ved 4 ° C med mild rotasjon.
    3. Vask med følgende bufferne (1 mL hver, se Tabellen for materiale) i romtemperatur i 5 min med rotasjon, plassere rør tilbake på magneten og fjerne nedbryting: vask Buffer jeg vaske bufferen II, vaske bufferen III og 2 x TE pH 8.0 henholdsvis.
    4. Forkast nedbryting og air-dry for ~ 5 min.
  5. Omvendt crosslinking
    1. Fjern prøver fra magneten. Legg 50 µL elueringsbufferen og bland av pipettering å elute protein-DNA komplekser fra perler.
    2. Ta inn prøven (e) fra dette skritt. Legge til elueringsbufferen for å angi prøven (e) for et siste volum av 50 µL (å holde buffer sammensetningen ligner på ChIP prøvene) og med ChIP prøvene.
    3. Mix 3 µL elueringsbufferen og 2 µL av RNase (DNase gratis). Legg til 5 µL av miksen hvert utvalg og ruge i 30 min på 37 ° C.
    4. Mix 2.5 µL proteinasen K, 1 µL glykogen og 1,5 µL elueringsbufferen per prøve. Legg til 5 µL av miksen hvert utvalg (1 U proteinasen K og 20 µg glykogen per prøve) og ruge 2 h på 37 ° C.
    5. Inkuber prøvene på 65 ° C over natten (minst 4 h) med risting for å utføre omvendt crosslinking.
    6. Plassere rør på magnet for minst 30 s og overføre nedbryting slik ny. Eksempler kan være frosset om 20 ° C i opptil 12 måneder.
  6. DNA rensing
    1. Legge til 140 µL av godt spredt spinn perler 60 µL av prøven (2.3:1 ratio). Pipetter forsiktig opp og ned 25 ganger bland godt. Kontroller at væsken i hver tube er homogen. Inkuber ved romtemperatur for 2 min. rørene på magneten i 4 min, eller til alle perler er bundet til magneten og forkaste nedbryting.
    2. La rørene på magneten og legge 200 µL av nylagde 70% etanol. Inkuber rør for 30 s uten å forstyrre perler. Gjenta dette trinnet igjen forkaste nedbryting. Sug opp etanol helt og la den spinn perler air-dry for 4 min.
      Merk: Ufullstendig etanol fjerning kan alvorlig redusere DNA utvinning og gi. Tørr pellet bare til det er tørt. Over tørking av pellets kan redusere DNA utvinning og gi.
    3. Fjern rørene fra magneten og tilsett 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). Pipetter forsiktig hele volumet opp og ned 25 ganger bland godt. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur. Plasser rørene på magneten i 4 min og overføre nedbryting til en annen rør.
    4. Måle mengden av DNA med en egnet fluorometer (se Tabell for materiale).
    5. Kontroller ChIP var vellykket ved qPCR (fortynne 1 µL i 100 µl H2O og bruk 2-5 µL for qPCR). Bruk spesifikke primere for en positiv (kjent binding området protein rundt) og negative kontroll (f.eks, et gen som er stille og/eller ikke et mål av protein av interesse).
      Merk: Biblioteket forberedelse kan utføres med 2 ng ChIP DNA avhengig av kit (se Tabell for materiale for et forslag som kit å bruke).

Representative Results

4 sU merking: kontrollere optimalt 4 sU-merking betingelser (apoptose, kjernefysiske stress, cytoplasmatiske stress), tid og konsentrasjon: Høye nivåer av 4sU kan hemme produksjon og behandling av rRNA og indusere cytoplasmatiske samt kjernefysiske stress30. Derfor bør cellene rundt testes for 4sU-indusert stress samt apoptose. Western blot analyse anbefales for å visualisere p53 opphopning, som angir kjernefysiske stress, økende phospho-EIF2a nivåer som viser cytoplasmatiske stress og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse for apoptose. Høye nivåer og langvarig eksponering for 4sU eller medisiner som thapsigargin eller arsenite kan brukes å indusere mobilnettet stress. For å indusere apoptose eller celle død, celler ble behandlet med BH3I-1 (500 ng/µL) eller inkubert i 5 min på 95 ° C (varme sjokk). Annexin V/7-AAD flekker ble brukt til å bestemme apoptotisk (Annexin V) og døde (7-AAD) celler. Merking av in vitro generert primære Th1 celler for 0,5 h med 500 µM 4sU (siste konsentrasjon) eller 1 time med 200 µM 4sU induserer verken av mobilnettet trykk eller apoptose (figur 1) men føre til tilstrekkelig 4sU innlemmelse.

RNA merking tid kan også bli forkortet (≤5 min) som fører til en økning i kortvarige intronic sekvenser sammenlignet lenger merking ganger. For å visualisere co-transcriptional skjøting priser, må 4sU-merking ganger ikke overstige 30 min. For mer informasjon om 4sUlabeling, se Rädle et al. 19

Kvalitetskontroll: RNA integritet er av stor betydning ved behandling av RNA. Det er mest hensiktsmessig å sjekke RNA kvaliteten av 4sU-merket etter biotinylation av electrophoretical analyse (se Tabell for materiale). Vurdere å kontrollere isolert RNA fra trinn 2.2.2, særlig når benytter den for sekvensering av totalt. RNA integritet nummer (RIN) bør være ≥8 å sikre RNA integritet for ytterligere behandling (Figur 3).

Electrophoretical analyse kan også brukes til å kontrollere nylig transkribere RNA. Vær oppmerksom på at nylig transkribere RNA inneholder betydelig mindre modne rRNAs sammenlignet med totale RNA med typiske rRNA bandene blir mye mindre fremtredende.

Ribosom profilering: PCR forsterkning av cDNA biblioteket: cDNA forsterkning (trinn 4.9.1) er en avgjørende skritt å sikre god sekvensering resultater. Analysere forsterket biblioteker av electrophoretical analyse. Et godt utvalg av forsterket biblioteker viser en topp rundt 140-160 bp (figur 4A). Store mengder kortet dimers skal unngås (figur 4B) og eksemplene skal bli videre renset ved hjelp av siden rensing prosedyren i henhold til produsentens protokollen (siden rensing av PCR-produkter). Mal for mye eller for mange PCR sykluser kan føre over forsterkning preget av utseendet på høyere enn forventet molekylvekt band, smurt PCR produkter og kortet dimer produkter (figur 4C). For de fleste prøver vil 1-5 µL av circularized cDNA og 9 PCR sykluser for forsterkning vanligvis gi tilstrekkelig mengder riktig PCR-produkt.

ChIP: Chromatin klippe: Optimale klipping forhold må justeres for hver celle. Bestemme klipping forhold (f.eks, antall sykluser, høyt eller lavt strømforbruk) på forhånd. Bruk samme antall celler og samme volum for testformål, siden lavere celle tetthet øker klipping effektiviteten. Prøv å unngå over - eller under-klipping av chromatin. Store chromatin fragmenter kan dramatisk påvirke ChIP resultater ved tilstopping og over klipping kan ødelegge epitopes på protein av interesse, fører til en lavere bindende effektivitet av antistoffer. I dette eksperimentet, best resultater ble oppnådd når viktigste delen av det skråstilte chromatin var rundt 1000 bp eller litt lavere (figur 5A).

Bekrefter ChIP av qPCR: Før du starter ChIP, er det lurt å teste om brukte antistoffer er egnet for ChIP (hvis mulig, bruk ChIP klasse antistoffer) av ChIP-qPCR. Kontroller ChIP for sekvensering av qPCR før du starter biblioteket utarbeidelse (se trinn 5.6.5). Utforme primere som binder til et kjent målområde av protein av interesse. Hvis webområdet nøyaktige mål i et gen er ukjent, kan flere primer par brukes å avsøke det genet og assosierte regulatoriske. For RNAPII ChIP av Th1 celler Ifng, som er transcriptionally upregulated ved stimulering, og utgangen primere kan brukes som en positiv. Sox9 og insulin tjene som en negativ kontroll, siden disse genene ikke er uttrykt i Th1 celler (figur 5B). Husk å ikke bruke ekson-spenner primere, som vanligvis brukes for qPCR av mRNA. En IgG kontroll kan også brukes til å bevise spesifisitet av brukte antistoffer. Immunoprecipitated DNA kan måles med en egnet fluorometer (se Tabell for materiale). Mengder nonspecifically bundet DNA av kontrollen IgG bør betydelig lavere sammenlignet med hvor DNA bundet av antistoffer rundt.

Replikerer: bevis på biologisk betydning: Det anbefales sterkt å utføre kinetic eksperimentet for alle metoder fra samme pool av celler for å sikre at cellene har samme identitet for alle ubehandlede og behandlet utvalg (figur 2). Likevel er det anbefalt å ta små dele viktigste tidspunkt for hver metode å sammenligne prøver å en biologisk gjenskape (f.eksved qPCR, FACS analyse). Dette gir en grov estimering hvis behandlingen for begge gjentak var reproduserbare og du kan fortsette med sekvensering. Validering av replikat skal utføres ved hjelp av bioinformatical analyse. Reproduserbarhet resultater kan vurderes i sammenheng mellom FPKM verdier mellom gjentak og visualisert ved hjelp av scatter tomter (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Verifisering av optimale 4sU-merking forhold uten perturbing celle fysiologi (figur fra Davari et al. 11)
(A) oppdagelsen av celle apoptose av FACS analyse: In vitro generert Th0 celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av 4sU (angitt i parentes) for 0,5 h og 1 h 2 h, henholdsvis. BH3I-1 behandling ble brukt til å indusere apoptose bestemmes av Annexin V, mens varme støt (5 min på 95 ° C) ble brukt til å indusere celledød bestemmes av 7-AAD. (B) Western blot analyse for p53 av 4sU behandlet og aktivert T celler: prøver ble merket med 200 µM 4sU for den angitte tiden til aktivisering, bortsett fra 0,5 h tidspunktet som var merket med 500 µM 4sU. (C) Western blot analyse av phospho-EIF2a og totalt EIF2a i aktivert Th1 celler med samme merking vilkår som (B). Thapsigargin ble brukt som en positiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over en kinetisk oppsett spore genomet hele endringer
Denne ordningen viser oppsettet for kombinerer 4sU-seq totale RNA-seq, ribosom profilering og ChIP-seq å studere genomet-omfattende endringer på celle behandling. Basseng celler og sette det nødvendige antallet celler for ubehandlet kontroll. Behandle gjenværende celler og delt for hver metode og tid punkt. Etiketten ubehandlet/behandlet celler for 4sU-seq med 4sU som beskrevet. Tidspunkt og prøver for hver metode, avhengig av bestemte biologiske spørsmålet undersøkt. Ta prøver hvert punkt og metoden, og følg den dedikerte delen av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvalitetskontroll av 4sU-merket
Total RNA og biotinylated RNA fra aktivert Th1 celler ble analysert på en Bioanalyzer. 18s rRNA og 28S rRNA vises og RNA integritet nummer (RIN) er gitt av instrumentet å bestemme integriteten til RNA. RIN bør være ≥8 å sikre RNA integritet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bioanalyzer profiler av ribosom profilering biblioteker
(A) A godt bibliotek: eksemplet viser en topp i fjellkjeden forventede størrelsen (140-160 bp) og ingen ytterligere rensing er nødvendig. (B) dette eksemplet viser overdreven kortet dimer forsterket produktet (120 bp) i forhold til det ønskede produktet (140-160 bp). Dette biblioteket krever ytterligere rensing. (C) en over forsterket prøve: høyere enn forventet molekylvekt topper og smurte PCR-amplicons er synlig (angitt med piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Optimal chromatin størrelse etter klipping og verifisering av ChIP av qPCR
(A) Agarose gel bildet viser optimale fragment størrelsen på det skråstilte chromatin fra tre prøver som ble skåret for 25 sykluser på en sonicator og renset som beskrevet før i protokollen. (B) Q PCR resultatene av en total RNAPII ChIP (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) er representert som en prosentandel av inndata. Ifng og utgangen primere ble brukt som en positiv Sox9 og Insulin er negative kontroller (både gener ikke er uttrykt i aktivert Th1 celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning av biologiske replikerer (figur fra Davari et al. 11)
Representant spredningsdiagram sammenligne uttrykk verdier (FPKM) mellom replikerer nylig transkribert (4sU) RNA 4 h etter stimulering av aktivert Th1 celler. Den grønne linjen angir like FPKM verdier og rang sammenheng er angitt i hver tomt.

Varighet av merking (min) Anbefalte 4sU konsentrasjon (µM)
120 100 - 200
60 200 - 500
15 - 30 500 - 1000
< 10 500 - 2000

Tabell 1: Anbefalt 4sU konsentrasjoner (fra Rädle, et al. 19)
Utvalget av anbefalt 4sU konsentrasjoner er angitt for ulike tider av merking.

Metoden Celle nummer RNA beløp
4sU-merking ≥2 x 107 ≥60µg
Ribosom profilering ≥2 x107
ChIP-seq ≥2 x 107 - 3 x 107

Tabell 2: Nødvendige mengden av primær T-celler
Minimum av nødvendige primær T-celler for hver metode. Beløp kan være mindre når du bruker andre celletyper.

Discussion

Analysere hele prosessen med gene regulering er nødvendig å forstå mobilnettet tilpasninger som svar på en bestemt stimulans eller behandling. Kombinere totale RNA-seq, fører 4sU-seq ribosom profilering og ChIP-seq på ulike tidspunkt til en omfattende analyse av de viktigste prosessene av genet over tid. En dyp forståelse av biologiske prosesser er nødvendig å definere den eksperimentelle oppsett samt optimale tidspunkt.

Siden metoder å studere genet regulering forbedre raskt, kan disse protokollene tilpasses til raske endringer. Likevel gir de viktigste metoder for å studere grunnleggende genet regulatoriske mekanismer i enhver type celle. Her diskuterer vi noen av fallgruvene og fakta man må vurdere når du bruker disse metodene.

Celler: Cellene må være svært levedyktig, og hvis bruker primære isolert celler, renheten av celle populasjoner må garanteres (f.eksFACS analyse for primær T-celler). Enda litt stresset celler kan påvirke resultatene av disse svært sensitive sekvensering metoder og redusere mengden av nylig transkribert eller oversatt, og føre til uønsket readouts av stressrespons i sekvensering resultatene. Sentrifugering hastigheten nevnt i denne protokollen for pellets celler er optimalisert for primær T-celler. Således, justere hastigheten etter hvilken celle.

4 sU effekter på cellen fysiologi: I tillegg til de nevnte alternativene for å bekrefte minimal forstyrrelsene til mobilnettet fysiologi ved 4sU tillegg, kan ytterligere og/eller flere analyse utføres, spesielt når cellen tallene er begrenset. Effekter på celle spredning kan testes ved å kontrollere dobling tid av celler ved å bare telle med og uten etiketter celler. Nucleolar stress induksjon kunne også bli testet ved å analysere celle morfologi via immunofluorescence farging av nucleolin og kjerner. For å bekrefte effekten av 4sU, kunne endrede globale genuttrykk måles ved å samkjøre lese teller fra merket totale RNA til umerkede totale RNA.

Celle tall: I vitro generert T celler anbefaler vi starter med minst mengden av celler som er angitt i tabell 2. Velg tilstrekkelig antall per metoden i henhold til cellene. Siden T celler har mindre cytoplasma og RNA i forhold til andre celler, vil sannsynligvis lavere mengder av andre celler være tilstrekkelig. For ChIP-seq avhenger cellen tallene svært antistoffer brukt og hvilket uttrykk protein av interesse i cellene. Histone eller RNAPII ChIP, kan fewe celler brukes mens cellen tallene må økes når transkripsjonsfaktorer brukes, spesielt hvis de er uttrykt på lavt nivå.

4 sU-merking og RNA biotinylation: Når du bruker tilhenger celler, kan 4sU merking rettes som beskrevet av Rädle et al. 19 siden celler svært raskt innlemme 4sU, det kan legges direkte til mediet av suspensjon, tilhenger eller semi tilhenger celler.

Det anbefales å starte biotinylation med 60-80 µg av. Likevel lavere mengder av RNA kan brukes, selv om vi ikke teste for mindre enn 30 µg. legge til en coprecipitant (f.eksGlycoBlue) når fremskynde RNA hvis pellet er vanskelig å se. Duffy et al. har også vist at methylthiosulfonate-aktivert biotin (MTS-biotin) mer effektivt reagerer med 4sU-merket RNA enn HPDP-biotin31. Derfor kan det være verdt å vurdere bytte til MTS-biotin, spesielt for utvinning av små RNAs, som pleier å ha færre uridine rester (se biotinylation protokollen nevnt av Duffy et al.; se rensing av 4sU-merket, Eksperimentell prosedyrer).

For utvinningen av nylig transkribere RNA er det mulig å bruke spinn perler eller RNA opprydding perler av ditt valg. Alltid ta hensyn til at disse pakkene kan eller kan ikke rense for bestemte RNAs. For eksempel hvis du er interessert i miRNAs, vurdere å bruke bestemte kits for miRNA fangst og sekvenser.

Kvantifisering av nylig transkribere RNA: For å nøyaktig antall nylig transkribere RNA, måling skal utføres av en egnet fluorometer (se Tabell for materiale). Innen 1 h 4sU eksponering representerer nylig transkribere RNA ca 1-4% av totale. Nylig transkribere RNA på 1 h merket, aktivert T celler består av ~ 90-94% av rRNA11.

Ribosom profilering: Når etablering metoden, vi funnet ut at ved å bruke 1,5 x antall nuclease foreslått i den opprinnelige protokollen garanterer riktig fordøyelse. Også er uten bivirkninger rapportert for forhøyede mengder nuclease. Siden det er ganske vanskelig å overdigest RPFs mens de er del av RNA bundet av ribosomal proteiner, kan du fortsatt litt øke mengden å sjarmere optimale nuclease fordøyelsen.

Hvis mindre enn 500 ng av RPF ble gjenopprettet i trinn 4.4.2, gjenta rRNA uttømming og basseng renset RPFs med RNA Clean & konsentrator-5 kolonner. Alternativt laste to identiske eksempler på gel (trinn 4.5.3) og bassenget gel skiver under RNA elueringsrør fra gel (trinn 4.5.6).

Vi anbefaler kutte RPFs på en gel så tett som mulig til 28 og 30 nt bandene. Dette bidrar i å eliminere uønskede fragmenter fra rRNAs og tRNAs, som senere blir en del av biblioteket og redusere sekvensering leser for din RPFs.

Det anbefales også å unngå UV lys under gel rensing. Dette kan skape kutt i RNA fragmenter, samt pyrimidine dimers, som til slutt kan påvirke biblioteket forberedelse og sekvensering resultater.

Bibliotek forberedelse og sekvensering av data: Ribosom profilering protokollen kan generere et cDNA bibliotek egnet for sekvenser. Prøver generert av 4sU-merking kan direkte brukes for biblioteket forberedelser med alle aktuelle RNA sekvensering kit. Siden nylig transkribere RNA, særlig når benytter kort merking ganger, ikke kan være polyadenylated, skal ingen poly-et utvalg utføres. I stedet anbefaler vi sterkt rRNA uttømming å hindre redusere sekvensering dybde for det faktiske eksemplet. Bruke T-celler, vi startet med 400 ng av nylig transkribert og total (avhengig av settet, se materialer), utført rRNA uttømming og redusert sykluser for PCR forsterkning å minimere PCR bias. Biblioteket forberedelse kan utføres med mindre utgangsmaterialet. Kontoen for biblioteket kompleksitet antall PCR sykluser skal optimaliseres.

For ChIP-seq finnes også mange kits tilgjengelig for biblioteket forberedelse. I våre hender biblioteket forberedelse jobbet godt starter med 2 ng ChIP DNA (se materialer for et forslag som kit å bruke). Husk å sjekke indekser for fargebalansen i sekvenser. Vi anbefaler en sekvensering dybdeskarphet ≥40 x 106 leser hver for 4sU-seq, totalt RNA-seq, og ChIP-seq prøver og ≥80 x 106 leser for ribosom profilering prøver. Sekvensering dybden avhenger prøven og nedstrøms bioinformatikk analysen og bør vurderes nøye. Analysere intronic leser for cotranscriptional skjøting, 100 må bp sammen-end sekvensering velges.

Sekvensering skjevhet: Sekvensering har blitt gullstandarden når globale endringer i transkripsjon, oversettelse eller transkripsjon faktor bindende. I de siste årene, eksisterende metoder ble presset til sine grenser eller nye teknikker ble utviklet for sekvensering stadig mindre Start mengder RNA. Dette krever forsterkning av cDNA, som introduserer støy eller bias. Nylig ble unike molekylær identifikatorer (UMIs) utviklet for å identifisere eksperimentelt duplikater introdusert av PCR. Nylig ble det vist at UMIs bare mildt forbedre sekvensering makt og falske funnrate differensial gene expression32. Imidlertid vurdere å bruke unike molekylær identifikatorer (UMIs) for alle sekvensering bibliotekene å kontroll for biblioteket kompleksitet, spesielt når du starter med lave mengder RNA og ved mange PCR sykluser.

Buffer og lager løsninger: Alle bufferne for 4sU-seq og ribosom profilering må være forberedt under strenge RNase-fri vilkår bruker nuclease-fritt vann. Det anbefales å kjøpe pre-laget nuclease-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumsitrat og vann. For å sikre nuclease-gratis forhold, kan en RNase decontaminating løsning brukes til å rense Pipetter eller overflater. Alle bufferne for ChIP-seq må være minst DNase-fri og kan lagres ved romtemperatur. Alltid legge proteasehemmere og eventuelt fosfatase hemmere rett før bruk og holde på isen.

Bioinformatics: Analyse av alle sekvensering data (dvs., ChIP-seq, RNA-seq og ribsosome profilering) omfatter kvalitetskontroll (f.eksved hjelp av FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), kortet trimming (f.eksmed cutadapt20) etterfulgt av tilordning til referanse genomet til cellene under studien. RNA-seq data (totalt og 4sU-seq), samt ribosom profildata, er en skjøtes RNA-seq-tilordning nødvendig, for eksempel ContextMap 221. For ChIP-seq data unspliced justeringer er bruke BWA-MEM22 tilstrekkelig. Genuttrykk kan beregnes med RPKM modell (leser per Kilobase av Exon per Million fragmenter tilordnet)1, etter bestemme lese teller per genet ved hjelp av et program, f.eks featureCounts23. For topp ringer fra ChIP-seq data, mange programmer er tilgjengelige, f.eks, Mac24 eller perle25. Videre kan nedstrøms analyser utføres i R26, spesielt ved hjelp av verktøy levert av Bioconductor prosjektet27.

Her er en stor utfordring i å integrere 4sU- og totalt RNA nivåer og translasjonsforskning aktivitet fra ribosom profilering normalisering. En klassisk tilnærming til dette problemet er å normalisere for rengjøring gener. For å redusere støy på grunn av tilfeldige svingninger for enkelte rengjøring gener, anbefales det å bruke ikke bare noen rengjøring gener men median nivåer for et større sett, f.eks den > 3000 rengjøring gener utarbeidet av Eisenberg og Levanon28 . Priser (f.eksforutsatt en RNA half-life 5 h)29for beregning av RNA Omsetningshastigheten fra prosenter av 4sU-til totalt RNA, normalisering er basert på median omsetning. Men siden dette forutsetter ingen generelle endringer for rengjøring gener, anbefaler vi bruke analyse tilnærminger uavhengig av normalisering, f.ekskorrelasjon-baserte klynger av en gang-serie med forskjellige datatyper av gener med forskjellige atferd i transkripsjon og oversettelse under aktiveringen. En detaljert beskrivelse på bioinformatical integrering av forskjellige datatyper referere vi til den opprinnelige publikasjon11.

Analyse av omsetning priser og data integrering: En nylig utgitte33 sammenligne halv-liv etter en multiplex gen kontroll (MGC) globale metoder kan vise at halveringstid korrelert beste med de man får av metabolske merking metoder i forhold til andre metoder (f.eks, de generelle hemming av transkripsjon av narkotika). Det bør imidlertid nevnes at forskjellene mellom half-life beregninger kan oppstå og har vært beskrevet 15,34. Vi står for de fleste problemer og forskjellene som er innført av stressrespons på grunn av langvarig 4sU eksponering. Derfor er det uunnværlig å ekskludere stressrespons introdusert av 4sU-merking. Videre validere Omsetningshastigheten, anbefaler vi bruk av MGCs.

I tillegg kunne et datasett generert her også brukes for en mer integrerende data analyse (f.eks, regulering av lenge ikke-koding RNAs)35,36.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lars Dölken for råd å etablere 4sU merkingsteknikker for primær T-celler; Elisabeth Graf og Thomas Schwarzmayr for kritiske hjelp i biblioteket generasjoner og sekvensering; Dirk Eick og Andrew Flatley for å gi RNAPII og T-celle antistoffer; N. Henriette Uhlenhaut og Franziska Greulich for hjelp i biblioteket forberedelse til ChIP-seq; Caroline C. Friedel ble støttet av tilskudd FR2938/7-1 og CRC 1123 (Z2) fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher ble støttet av stipendet GL 870/1-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) og tysk Center for Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Tags

Genetikk problemet 133 4-thiouridine ribosom profilering ChIP-seq RNA-seq nylig transkribert RNA genomet-bred RNA behandling skjøting cotranscriptional skjøting oversettelse rente omløpshastighet transkripsjon faktor bindende
Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C.… More

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter