Summary
Cerebral organoids representerar nya modellsystem att undersöka tidiga mänskliga hjärnans utveckling i vitro. Denna artikel tillhandahåller detaljerade metoden för att effektivt generera homogen dorsala framhjärnan-typ organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller inklusive kritiska karakterisering och validering steg.
Abstract
Mänskliga hjärnbarken är starkt expanderad och uppvisar en komplex struktur med specifika funktionsområden, som ger högre hjärnfunktion, såsom kognition. Ansträngningar att studera mänskliga hjärnbarken utveckling har varit begränsad av tillgången på modellsystem. Att översätta resultaten från gnagare till det mänskliga systemet begränsas av arter skillnader och studier på mänskliga primära vävnader hämmas av en brist på vävnad tillgänglighet samt etiska frågor. Senaste utvecklingen i mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) teknik inkluderar generationen av tredimensionella (3D) självorganiserande organotypic kultur system som efterliknar till en viss utsträckning mänskliga-specifika hjärna utveckling i vitro. För närvarande, det finns olika protokoll för generering av antingen hela hjärnan eller hjärnregionen specifika organoids. Metoden för generering av homogena och reproducerbara framhjärnan-typ organoids från inducerad PSC (iPSC), som vi tidigare har fastställts och beskriver här, kombinerar PSC inneboende förmåga att själv ordna med guidade differentiering mot den främre neuroektodermala härstamning och matrix inbäddning för att stödja bildandet av en kontinuerlig neuroepithelium. Mer specifikt innebär detta protokoll: (1) generering av iPSC aggregat, inklusive konvertering av iPSC kolonier till en konfluenta enskiktslager kultur; (2) induktion av främre neuroectoderm; (3) för inbäddning av neuroektodermala aggregat i en matris byggnadsställning; (4) generation av framhjärnan-typ organoids från neuroektodermala aggregat; och (5) för fixering och validering av framhjärnan-typ organoids. Som sådan, ger det här protokollet en lätt tillämpliga systemet för generering av standardiserade och reproducerbara iPSC-derived kortikal vävnad strukturer i vitro.
Introduction
Den mänskliga hjärnan är helt klart en av de mest komplexa organ och ansvarar för alla människors intellektuella förmågor. Således, en djupare förståelse av mänskliga-specifika hjärnans utveckling är en avgörande förutsättning för att förstå människans kognitiva förmågor. Traditionellt, transgena djur serveras som modellorganismer att studera hjärnans utveckling. Dessa modeller föreskrivs grundläggande insikt i principerna för hjärnans utveckling. Vi vet nu att gemensamt för hjärnans utveckling hos alla däggdjur är en exakt koreografi av stamceller spridning, neurogenes och neuronala migration. Det finns, dock betydande strukturella skillnader mellan hjärnor modellorganismer, såsom gnagare och människor, särskilt i hjärnbarken. De primära mekanismer som har föreslagits bidra till primater kortikala evolution är en ökad spridning av stamceller och stamceller celler samt generering av yttre radiella gliaceller (oRGCs), som mycket sällan återfinns i gnagare1 ,2,3.
Metoder att mänskliga hjärnbarken modellutveckling inkluderar generationen av PSC-derived telencephalic stamceller och hjärnbarken projektion nervceller som enskiktslager kulturer. Dessa standardiserade differentiering protokoll repris vissa aspekter av mänskliga kortikala utveckling såsom den stereotypa temporal beställer av kortikala neurogenes4. De, faller dock kort när det kommer till sammanfattningen av utvecklingsprocesser för organogenes såsom rumsliga mönster och morfogenes. Senaste utvecklingen i stamcellsbiologi ledde till etableringen av 3D organoid kulturer från PSC, som revolutionerar forskningen av in vitro- mänskliga organogenes. Utnyttja de gemensamma kontaktpunkterna förmåga att själv ordna i organotypic strukturer, har olika organoids, som avspeglar viktiga strukturella och funktionella egenskaper hos organ inklusive njurar, tarm, ögat och hjärnan varit etablerade5. Sådant organoids innehåller flera organ-specifika cellulära subtyper, som gruppera och rumsligt organisera mycket liknar utveckla organ i vivo5,6. Dessutom avslöjade cell sammansättning, härstamning relation och gen nätverk studier med encelliga RNA-sekvensering att mänskliga cerebral organoids troget recapitulate viktiga aspekter av mänskliga foster neocortex utveckling såsom gen uttryck program 7 , 8. en stor nackdel, som hindrade deras breda program hittills, var dock de stora sats till sats variationer och organoid-till-organoid heterogenitet9.
Här, ger vi ett detaljerat protokoll för en enkel och standardiserad framhjärnan-typ organoid kultur system. Det viktigaste inslaget i detta system är att det effektivt och reproducibly genererar PSC-derived organoids nästan exklusivt dorsala telencephalic identitet. Protokollet är baserat på de metoder som används i vår senaste Cell Reports papper10. Det kombinerar iPSCs självorganisering kapacitet med selektiv induktion av kortikal neuroepithelium och robust kan generera homogen kulturer tidig dorsala telencephalic vävnad inom 3 veckor. Protokollet bygger på tidigare rapporterade SMAD signalering och Wnt hämning strategi som vägleder differentiering av PSC mot den främre neuroektodermala härstamning11,12 i kombination med matrix inbäddning, som främjar bildandet av stora och kontinuerlig neuroepithelial strukturer13. Vi har framgångsrikt använt den beskrivna metoden på olika iPSC linjer, med flera kloner per individ. Vi visade att detta system är lämpligt för nedströms tillämpningar där reproducerbarhet och homogenitet är av större betydelse såsom sjukdom modellering. När tillämpa protokollet till iPSCs härrör från patienter som lider av en svår kortikala missbildning, kunde vi att recapitulate patologiska kännetecken för sjukdomen i in vitro- och identifiera nya molekylära mekanismer som leder till den fenotypiska ändrar10. Vi föreslår att protokollet beskrivs organoid kan utnyttjas för att överbrygga klyftan mellan reduktionistiska PSC-derived kortikala enskiktslager kulturer och in-vivo studier, och att det utgör en tillförlitlig och stabil cell-baserad modellsystem att simulera tidigt mänskliga kortikala utveckling vid hälsa och sjukdom utanför den mänskliga kroppen.
Protocol
1. generering av iPSC aggregat
- Generation av encelliga enskiktslager kulturer från iPSC kolonier
- Förbereda en basalmembranet extrakt (BME) belagd 6-bra platta. Tina BME på isen vid 4 ° C i 2-3 h, späd med kallt Dulbeccos modifierade Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 utspädning), täcka plattan med 1 mL/väl av den utspädda lösningen BME och lagra plattan över natten vid 4 ° C.
- Sug ut mediet och tvätta intakt iPSC kolonier av minst 2 brunnar i en 6-well platta med 0,5 mM EDTA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger innan ruvning kolonier med 0,5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i PBS för 4 min i rumstemperatur (RT). Aspirera EDTA-lösning och försiktigt lossa kolonierna genom att tvätta dem från botten av skålen med 5 mL DMEM-F12 medium. Samla dem i en 15 mL tub och pellet dem genom centrifugering (4 min vid 1200 x g vid RT).
Obs: iPSCs omprogrammeras från kommersiellt tillgängliga fibroblaster har varit framgångsrikt använt10. - Aspirera supernatanten och inkubera iPSC kolonierna med 500 µL av cell-dissociation reagens under 6 minuter vid 37 ° C.
- Pipettera cellsuspensionen flera gånger försiktigt upp och ned med 1 mL pipett att bryta återstående cell kluster i enstaka celler.
- Lägga till 4 mL DMEM-F12 cellsuspensionen att späda cell-dissociation reagensen.
- Snurra cellerna ner på 1,200 x g för 4 min på RT.
- Att resuspendera cellerna i 2 mL av iPSC medium kompletteras med 5 µM Y-27632 och utsäde celler i en brunn BME belagda 6-bra platta.
Obs: Använda iPSC mediet anges i Tabell av material för en enskild cell enskiktslager iPSC kulturer. - Nästa dag, ersätta mediet med färska iPSC medium saknar Y-27632. Från denna punkt, fortsätta att odla cellerna, ändra mediet varje dag tills iPSCs är 100% konfluenta. Beroende på cellinje och konfluens av börjar brunnarna tar detta mellan 2-4 dagar.
- En gång konfluenta, passagen iPSCs. Aspirera medium och tillsätt 500 µL cell-dissociation reagens på cellerna.
- Inkubera cellerna för 5-10 min vid 37 ° C. Skaka försiktigt på plattan för att lossa cellerna.
- Tvätta cellerna från brunnen med 2 mL DMEM-F12 och samla dem i en 15 mL tub. Lägga till DMEM-F12 för en total volym på 5 mL.
- Snurra ner cellerna vid 1200 x g i 4 min på RT och Aspirera supernatanten.
- Utsäde cellerna i iPSC medium kompletteras med 5 µM Y-27632 i en 1:2 1:4-förhållande på en BME belagda 6-väl plattan (2 mL per brunn av medium).
- Fortsätta att odla cellerna i 2-5 dagar och ändra iPSC medium saknar Y-27632 varje dag. En gång konfluenta, passage iPSCs (steg 1.1.4-1.1.8).
Obs: Kultur iPSCs för minst 2 passager som en enskiktslager i iPSC medlet anges i Tabell av material innan du använder dem för generering av iPSC aggregat så att cellerna att anpassa sig till de kulturen.
- Använd enskiktslager iPSC kulturer när de är 70-90% konfluenta för generering av iPSC aggregat.
Obs: iPSC anpassas till rådande kultur som enstaka celler är mindre benägna att betona att leder till celldöd under förfarandet för dissociation och aggregering. Enskiktslager iPSC kulturer behöver Visa typiska pluripotenta morfologi utan tecken på differentiering. Testa kulturerna regelbundet för mycoplasma kontaminering. Fungerar bara med mycoplasma-fri iPSC kulturer.- Sug ut odlingssubstratet från en brunn 6-well platta och tillsätt 500 µL cell-dissociation reagens på cellerna.
- Inkubera cellerna för 5-10 min vid 37 ° C. Skaka försiktigt på plattan för att lossa cellerna.
- Tvätta cellerna från brunnen med 2 mL DMEM-F12 och samla dem i en 15 mL tub. Lägga till DMEM-F12 för en total volym på 10 mL.
- För cell inventering, ta 25 µL från cellsuspensionen och blanda det med 25 µL av trypan blå Markera döda celler. Räkna de levande celler använder en räknande kammare.
- Samla tillräckligt med celler (4 500 celler per iPSC aggregerade) från cellsuspensionen i en 15 mL tub.
- Snurra ner cellerna vid 1200 x g i 4 min på RT och Aspirera supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i en lämplig volym av iPSC medium kompletteras med 50 µM Y-27632 att få 4 500 levande celler per 150 µL.
Obs: Med en hög koncentration av Y-27632 (50 µM) är avgörande för överlevnaden av iPSCs. - Tallrik 150 µL i varje väl av en låg-attachment 96 brunnar U-botten tallrik och placera den i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: När du genererar iPSC aggregat, anser att minst 6 organoids behövs för kvalitetskontroll vid dag 20 (se avsnitt 5).
2. induktion av främre Neuroectoderm
- Noga övervaka morfologi förändringar av iPSC aggregaten varje dag under mikroskopet vävnadsodling med en 4 X eller 10 X power linsen. Observera dag 1, cell aggregat med tydliga gränser. Fortsätta att kultur iPSC aggregat i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Ett visst antal döda celler per brunn är normalt och påverkar inte organoid generation. - Foder iPSC aggregaten från dag 2 och fortsätter med varannan dag av försiktigt aspirera cirka 2/3 av medium utan att störa cell aggregaten längst ned. Lägga till en ytterligare 100 µL av iPSC medium saknar Y-27632.
Obs: Inom 4-6 dagar cell aggregaten blir 350-450 µm i diameter och uppvisar jämna kanter. - I detta skede aggregerar pool cellen med en cut 100 µL pipettspetsen i en låg-bilaga 6 cm skål (högst 20 aggregat/maträtt) i kortikala induktion medium innehållande DMEM-F12 med N2 tillägg (1: 200), B27 tillägg (1: 100), glukos (0,2 mg/mL), cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP, 0,15 µg/mL), 0,5% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1% L-alanyl-L-glutamin, heparin (10 µg/mL) och föreningarna LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), och hämmare av Wnt svar-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Flöde cell aggregaten genom att ändra det kortikala induktion mediet 3 dagar efter att överföra dem till 6 cm skålen.
- Noga övervaka morfologiska förändringar under kortikala induktion under mikroskopet vävnadsodling med ett 4 X power objektiv.
Obs: Efter 4-5 dagar i kortikala induktion medium, ska kanterna av cell aggregaten börja lysa upp på ytan, som anger neuroektodermala differentiering. I detta skede framträder radiella organisationen av en pseudostratified epitel. Fortsätt till avsnitt 3 bädda in cell aggregaten i en BME matris.
3. inbäddning av neuroektodermala aggregerar i en matris byggnadsställning
- Tina BME på isen vid 4 ° C i 2-3 h. alikvotens outspädd BME i tillräckliga mängder.
- Förbereda ett plast paraffin filma ark för inbäddning förfarandet. Skär plast paraffin filma med steril sax i 4 x 4 cm stora bitar, sätta en bit plast paraffin filma över en tom 100 µL tip bricka 100 µL tips, och tryck med en behandskade fingrar så att små gropar i bladet plast paraffin film skapas (1 di mpel deponicell sammanlagda behövs). Rengör plast paraffin filma med 70% etanol och bestråla det med UV-ljus (power: 15 watt, våglängd: 435 nm) under stängda sterila bänken i 30 min.
- Överföra varje cell aggregat till en grop av plast paraffin filma arket med en 100 µL skuren spets med 1,5-2 mm i diameter. I fall att två cell aggregat är smält, separera inte dem men överföra dem samman till en grop.
- Aspirera försiktigt det medium som omger cellen aggregaten med en oklippt 100 µL pipettspetsen.
Obs: Var noga med att inte suga cellen aggregaten i spetsen, eftersom detta kan skada aggregaten. - Tillsätt 40 µL outspädd BME i varje cell aggregat.
- Position varje cell som är samlade i mitten på BME släppa med en oklippt 100 µL pipettspetsen.
Obs: Var mycket noga med att inte skada den framkallande neuroepithelium med pipettspetsen. - Försiktigt överföra plast paraffin filma arket med steril pincett i en 10 cm petriskål (eller en annan tillräcklig cell kultur maträtt) och placera skålen i inkubatorn för 15-20 min till tillåta BME att stelna.
- Under tiden Förbered en låg-bilaga 6 cm maträtt innehållande 5 mL av kortikala induktion medium.
- Efter polymerisation av BME, ta bort droppar som innehåller cell aggregaten från plast paraffin filma arket. Stänga av plast paraffin film över med steril pincett och kläm försiktigt cell aggregaten i den något lutande (cirka 30 °) låg-bilaga 6 cm skålen tills dropparna falla av plast paraffin filma arket. Överföra högst 16 cell aggregat i en 6 cm skålen.
- Fortsätta att Inkubera cell aggregaten vid 37 ° C.
4. generering av framhjärnan-typ Organoids från neuroektodermala aggregat
- En dag efter inbäddning i en BME matris, placera organoid kultur rätter på en gungande cell kultur shaker med en lutande vinkel på 5 ° och 14 rpm, installerad i en cell kultur inkubator.
- Övervaka organoids varje dag. Homogena neuroepithelial loop-liknande strukturer utvecklas successivt efter inbäddning i BME matris.
- När neuroepithelial loop strukturer är synliga, ändra mediet till organoid differentiering medium innehållande DMEM-F12 med N2 tillägg (1: 200), B27 tillägg (1: 100), glukos (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 µg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanyl-L-glutamin, insulin (2,5 µg/mL)
- Ersätta organoid differentiering medium var 3-4 dagar tills den önska differentiering tidpunkten är nådd. Sedan fixa organoids (se avsnitt 5).
Obs: Vävnaden kan ibland uppvisa knoppar av optiskt genomskinlig vävnad utan loop strukturer. Även om detta inte är idealiskt, är detta inte påverkar utvecklingen av kortikala strukturer. Organoids kan vara odlade i organoid differentiering medium för upp till 40 dagar. För utökade kultur perioder (40-100 dagar) organoid differentiering mediet kan kompletteras med 1:50 BME att öka vävnad komplexitet och med BDNF och GDNF att tillåta neuronal överlevnad och mognad14,15.
5. fixering och validering av framhjärnan-typ Organoids
- För validering, samla in 6 organoids på dagen 20. Använd 3 organoids för mRNA isolering och PCR-analyser. Överföra de ytterligare 3 organoids till en 24-well platta som innehåller PBS med en skära 1 mL pipettspetsen med en öppning på 3-3,5 mm för fixering och sekventiell immunocytochemical analyser.
- Tvätta organoids två gånger genom noggrant aspirera PBS och ersätta den med färska PBS med 5 mL pipett. Fixa organoids i 15 min i kallt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (pH 7,4).
Varning: Akta att PFA är en känd cancerorsak. Allt arbete måste göras i kemiska dragskåp med nitrilhandskar. Det rekommenderas att bära skyddsglasögon. Formaldehyd kan orsaka irreversibla skador på hornhinnan. - Aspirera på PFA noga och tvätta tre gånger med hjälp av rumstemperatur PBS i 10 min.
- Ersätta PBS med en 30% sackaroslösning (wt/vol, PBS-baserade) och lagra proverna vid 4 ° C att tillåta organoids att torka. Organoids kan lagras i upp till 7 dagar tills vidare bearbetning.
- En dag efter fixering, fläcken före den uttorkade organoids genom att lägga till trypan blå på ungefär 1:50 för 10 min att tillåta visualisering av organoids under förfarandet kryosnitt.
- Förbereda inbäddning mediet som innehåller 10% sackaros, 7,5% gelatin wt/vol i PBS, och värm den till 75 ° C tills det är flytande.
- Ersätta 30% sackaroslösning med inbäddning medium och överföra 24-väl plattan på värme plåt (60 ° C) i 15 min temperera organoids.
- Täcka botten av inbäddning formarna med ett lager av inbäddning media och placera dem på isen att polymerisera.
- Överföring av organoids från 24-väl plattan att bädda in formar som innehåller polymeriserat inbäddning medium, lägga till ytterligare inbäddning medium på toppen så att organoids täcks och placera formen snabbt i en 100% etanol/torr-is frysning () bad temperaturen bör vara mellan -30 till-50 ° C) för minst 1 min till chock-frysa.
- Placera formen med tången på torris tillfälligt och antingen förvara dem vid-80 ° C eller direkt gå vidare med kryosnitt.
- Cryosection organoids på 20 µm tjocklek och samla avsnitten på objektglas, hålla koll storleksordningen sektioner i bilderna (sekventiell upptag). Tillåta sektioner torka på bilder i flera timmar, innan du lagrar dem vid-80 ° C eller direkt utför immunocytochemical färgning.
Representative Results
Standardiserad framhjärnan-typ organoid protokollet beskrivs här vanligtvis genererar mycket homogen organoid kulturer av nästan uteslutande dorsala kortikala identitet från iPSCs mänskliga inom 20 dagar från odling (protokoll som beskrivs i figur 1 A). Det rekommenderas att utföra flera åtgärder för kvalitetskontroll under tidsförloppet för protokollet, definieras här som: 'gå' (fortsätta differentiering) och ”no-go” (suboptimala kulturer, det rekommenderas att avsluta partiet) (figur 1 ). Det är också klokt att dokumentera varje kvalitetskontroll steg väl genom att ta bilder och anteckningar.
Ett första viktigt steg i att generera framhjärnan-typ organoids är att börja med hög kvalitet iPSC kulturer. Det är viktigt att iPSCs inte innehåller större fraktioner av differentierade celler. Bara använda iPSC kulturer som presenterar som en homogen enskiktslager av odifferentierade celler vid start befolkningen (siffror 1B, C). Det är dessutom viktigt att starta med viss cell nummer för iPSC aggregering. Den första ingående inspektionen av iPSC aggregaten bör utföras på dag 2. I detta skede bör aggregaten har bildat kompakt cell knoppar med jämna kanter ('gå') oregelbundna visasende aggregat eller aggregat med håligheter bör kasseras ('no-go') (siffrorna 1 d, E). Nästa kvalitetskontroll steg bör utföras på dag 10 i protokollet. Vid denna tidpunkt, cell aggregaten ska Visa slät och optiskt genomskinlig vävnad på utsidan som representerar induktion av neuroectoderm ('gå') avsaknad av sådan vävnad visar suboptimala neurala induktion (”no-go”) (siffror 1F, G ). Endast de aggregat som uppvisar en genomskinlig yta (figur 1F) ska bäddas in BME matrisen. När inbäddade, kommer den kortikala organoids utveckla kontinuerlig neuroepithelial loop-liknande strukturer, som kommer att expandera snabbt. Analysera effektiviteten i kortikala induktion på dag 15 och dag 20 genom att undersöka om organoids har utvecklade polariserade neurala ektoderm som framgår i figur 1H, J ('gå'). I fall att organoids inte har utvecklat sådana neuroepithelial knoppar (”no-go” som illustreras i figur 1I, K), kritiskt revidera utförd kvalitetskontroll stegen för felsökning. När tätt efter de protokoll, högt standardiserade organoid partier kommer att genereras (siffror 2A, B), som visar ≥ 90% homogenitet i polariserade neurala ektoderm bildandet inom och över batchar (figur 2C). Ett vanligt misstag som leder till varierande effektivitet av polariserade neurala ektoderm bildande är att öka cellen startnummer för iPSC aggregering eller till att börja med låg kvalitet iPSC kulturer såsom mycoplasma förorenade kulturer eller kulturer som innehåller differentierade celler.
En detaljerad validering av den genererade organoids dorsala telencephalic identitet bör utföras på dagen 20. Därför bör 3 organoids vara fast och som används för immunofluorescens analyser. Stratifierat neuroepithelial slingor (figur 3A) express neurala stamceller markören Sox2 (figur 3B, D), framhjärnan markörerna Pax6 och Otx2 (siffrorna 3 c, E), och den dorsala kortikala markören Emx1 (figur 3 F). dessa kortikal loopar kännetecknas vidare av en apikal lokalisering av N-cadherin och ZO-1 (siffrorna 3 g, H), ventrikulär zon radiella glia cell (vRGC)-härledda mikrotubuli, som sträcker sig från den apikala de strukturer (basal sida Figur 3 jag), och apikala ligger delande celler som fläcken positivt för fosforyleras vimentin (p-Vimentin, figur 3J). Celldöd kan finnas inuti organoid strukturer. Centrala apoptos är normalt och påverkar inte utvecklingen av kortikal vävnad. 3 organoids bör dessutom användas att bedöma enhetligheten av protokollet av genen uttryck analyser. Framhjärnan-typ organoids Visa uttryck av dorsala framhjärnan markörer (FoxG1, Otx2, Emx1), medan uttryck av mellanhjärnan (FoxA2, Pax5) och hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) markörerna är inte påvisas (figur 3K).
Partier av kvalitetskontrollerade organoids kan användas för olika tillämpningar som analyserna av division planet av apikala radiella gliaceller. Därför föreslår vi att utföra dubbel färgning med antikroppar mot p-Vimentin och Tpx2 (figur 3J). P-Vimentin är fosforyleras av CDK1 under Mitos och ligger i kärnan, således märkning alla atomkärnor i mitotiska fas16. Tpx2 är en mikrotubulära associerade protein som kan visualisera den mitotiska spindeln och de apikala processerna under interkinetic nukleära migration17,18. Använder dessa markörer, tre aspekter av vRGC uppdelning kan i princip analyseras: (I) huruvida cell division sker på den apikala sidan, (II) huruvida division planet är justerad lodrätt (indikerande symmetriska celldelning), horisontell, eller sned ( tyder asymmetrisk celldelning) till apikala ytan och (III) huruvida mikrotubulära organisera centers bildas normalt.
Organoids kan också ytterligare differentieras till komplexare organiserade och stratifierat kortikal vävnad strukturer. Kortikala strukturer inom dag 35 ± 2 organoids består av en ventrikulär zon (VZ)-, en inre och yttre subventrikulära zonen (SVZ), samt en kortikala plattan (CP) - området. Inom VZ och de inre och yttre SVZ, kan vRGCs, mellanliggande stamfäder (IPs) och celler som påminner om oRGCs identifieras. Dessutom inledande bildandet av en skiktad cortex kan observeras i området CP-liknande med djupt kortikala nervceller att uttrycka Tbr1 och Ctip2 inuti och övre kortikala nervceller att uttrycka Satb2, liksom Reelin-uttryckande celler i yttre regioner10.
Figur 1 : Schematisk översikt av organoid protocol och illustration av 'gå' och ”no-go” kriterier. (A) Schematisk översikt av protokollet. CI medium: kortikala induktion medium; CD: kortikala differentiering medium. (B–C) Bilden av en optimal 90% konfluenta iPSC enskiktslager kultur (B) och en icke-lämplig iPSC kultur uppvisar differentiering (C). (D–E) En iPSC sammanvägning optimal i storlek, cell densiteten, och yta utseende (D) och två ”no-go” cell aggregat uppvisar antingen cell reservdelar hålrum (E, övre aggregat) eller oregelbundna kanter (E, lägre aggregat) två dagar följande cell aggregering. (F–G) Cell aggregat uppvisar genomskinlig och släta kanter (F) och cell aggregat saknar optisk clearing (G). Den gula linjen är visualisera området av intresse. (H–K) En optimal organoid med kontinuerlig neuroepithelial öglor (H, J) och en organoid som misslyckats att utveckla radiellt ordnade neuroectoderm (I, K) avbildas på dag 15 och dag 20, respektive. Skala barer, B-C 500 µm; D-K 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Homogenitet och reproducerbarhet av protokollet framhjärnan-typ organoid. (A–B) Representativa ljusa fält bilder av organoids från ett parti på dag 15 (A) och dag 26 (B). (C) kvantitativa analyser av organoids på dagen 20. Organoids som visas på den yttre ytan en neuroepithelium, igenkännligt i ljusa fält som optiskt klart ytlig vävnad med en tydlig gräns- och bevis för radiella cellulära arkitekturen kvantifierades (n = 3 per iPSC rad med minst 16 organoids per experiment). Skala barer, A-B: 500 µm. fel barer ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Validering av framhjärnan-typ organoids på dagen 20. (A–J) Immunocytochemical karakterisering av organoids. Organoids organisera i flera neuroepithelial slingor (A, counterstained med DAPI). Stratifierad organiserade celler inom neuroepithelial loopar express neurala stamceller markören Sox2 (B, D), framhjärnan markörerna Pax6 (C, D) och Otx2 (E), samt den dorsala framhjärnan markören Emx1 (F). Kortikala loop strukturer uppvisade en fin vidhäftande junction bälte på de apikala sida med ansamling av N-cadherin (G) och zona occludens protein 1 (ZO-1; H). ventrikulära RGCs' mikrotubulära nätverk (målat av acetylerade α-tubulin, Ac-Tub) sträcker sig från den apikala till basala sidan av loop strukturer (jag). Prolifererande celler som uttrycker p-vimentin (p-Vim) är belägna på den apikala ytan. Mitotiska spindlar färgas av Tpx2. representativa högre förstoring bilden av en vertikal och en horisontell uppdelning planet visas till höger (J). (K) RT-PCR analys för de region-specifika transkriptionsfaktorerna dag 20 av två oberoende organoids härrör från 2 olika iPSC linjer. FB: fostrets hjärna kontroll; AB: vuxna hjärnan kontroll. Skala barer, A-D 200 µm; E-jag 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Epitop | Utspädning |
| Sox2 | 1 - 300 |
| Pax6 | 1 - 500 |
| Otx2 | 1 - 500 |
| Emx1 | 1 - 50 |
| N-cadherin | 1 - 500 |
| ZO-1 | 1 - 100 |
| P-Vimentin | 1 - 1000 |
| Tpx2 | 1 - 500 |
| Acetylerade α-tubulin | 1 - 500 |
| Alexa488 anti ms | 1 - 1000 |
| Alexa488 anti rb | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti ms | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti rb | 1 - 1000 |
Tabell 1: Antikroppar för kvalitetskontroll av organoids på dagen 20.
| Primer | Sekvens |
| Otx2 fram | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 omvänd | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 framåt | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 omvänd | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 fram | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 omvänd | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 fram | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 omvänd | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 framåt | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 omvänd | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 fram | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 omvänd | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 fram | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 omvänd | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 fram | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 omvänd | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 fram | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 omvänd | ctgggatcagggagtcttca |
| 18s framåt | ttccttggaccggcgcaag |
| 18s omvänd | gccgcatcgccggtcgg |
Tabell 2: Primer och primer sekvenser för gen uttryck profil.
Discussion
Hjärnan organoids utgör ett kraftfullt verktyg för att studera hjärnans utveckling i vitro som ger relevanta arter bakgrunden och det komplexa 3D arrangemanget av celler i en vävnad sammanhang. Med det överbrygga de klyftan mellan icke-mänskliga djur modeller och reduktionistisk mänskliga tvådimensionell enskiktslager cell kultur tekniker. Sina program, dock hämmas av bristande reproducerbarhet9. Vi har utvecklat ett framhjärnan-typ organoid protokoll, som övervinner de stora prov till prov variationen genom att kombinera iPSC självorganiserande kapacitet med deras föredragandens till mönstring faktorer. Specifikt, iPSCs var samman för att främja självorganisering och därefter hämmar TGF-ß/SMAD signalering att främja dorsala cortex differentiering genom att utsätta kulturerna till en BMP (LDN-193189) och en TGF-β typ I receptor hämmare (A83-01). Dessutom tillämpades en förening att hämma Wnt vägen (IWR) för att förhindra posteriorization. I motsats till 'inneboende' cerebral organoid protokoll19, som baseras på självmontering utan extern kontroll ger upphov till ganska heterogena hjärnan organoids och uppvisar stor batch variationer (mätt med effektivitetsvinsterna av polariserade neurala ektoderm bildandet15), det protokoll som beskrivs här reproducibly genererar homogen framhjärnan-specifika organoids från iPSCs mänskliga.
Dessa framhjärnan-typ organoids kan användas för en mängd applikationer såsom nervsystemets studier, evolutionära studier inklusive gen funktion studier, sjukdom modellering, och eventuellt läkemedel testning och terapeutiska ändamål. Protokollet är dock mest lämplig att studera tidiga aspekter av mänskliga kortikala utveckling. Till exempel har vi använt den framhjärnan-typ organoids för att undersöka mänskliga-specifika aspekter av vRGC beteende. Mer specifikt, patofysiologiska förändringar i samband med en allvarlig form av Lissencefali, en mänskliga kortikala missbildning som kännetecknas av en nära avsaknad av kortikal vikning, åtgärdades. Endast vissa aspekter av denna sjukdom kan modelleras i möss som mus hjärnan är naturligt lissencephalic. När gäller Lissencefali patientderiverade iPSCs organoid systemet, kunde vi tillförlitligt recapitulate mänskliga-specifika aspekter av sjukdomen och identifiera bakomliggande mekanismer. Mer specifikt, kunde vi visa att patientderiverade organoids visar en betydande minskning i storlek som orsakas av en switch från symmetriska till asymmetrisk celldelning av vRGCs. Denna växel var förknippad med förändringar i organisationen av vRGCs' mikrotubulära nätverket, en störning av arkitekturen av den VZ nischen och förändrat uttryck av Celladhesionmolekylar, leder till en försämrad aktivering av den N-cadherin/β-catenin signalering axel10. Notera: β-catenin-beroende reglering av vRGC uppdelning lägen föreslogs vara mänskliga-specifika eftersom överuttryck av β-catenin hos möss leder till tangentiella cortex expansion och därefter kortikala fällbara20. Således markera vår data att framhjärnan-typ organoid systemet representerar ett lovande verktyg för att studera i ett kvantifierbart sätt de mänskliga-specifika aspekterna av tidig kortikala utveckling i vitro.
En stor utmaning för framtiden är att upprätthålla enhetligheten av organoids över längre period för att uppnå mer mogen neuronala fenotyper. Detta kan förverkligas genom en eller flera av följande: odling av organoids i en bioreaktor system14, tillämpa flytande ställningar15, komplettera det differentiering mediet med neurala tillväxt eller neuronal överlevnad faktorer. Slutligen kan en kontrollerad ökning av hjärnans komplexitet uppnås genom att smälta den framhjärnan-typ organoids med cerebral organoids olika regionala identitet21,22.
Sammantaget erbjuder framhjärnan-typ organoid protokollet presenteras här ett enkelt tillämpliga och tillförlitligt verktyg för generering av tidig kortikala strukturer in vitro. Protokollet ger upphov till mycket homogen tidiga kortikal vävnad över flera iPSC linjer och kan utnyttjas för att på ett tillförlitligt sätt generera individ-specifika kortikal vävnad. Systemet är således särskilt lämplig för applikationer som kräver en hög grad av homogenitet och reproducerbarhet såsom sjukdom modellering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av ministeriet för Innovation vetenskap och forskning av norr Rhine-Westphalia (Junior forskningsgrupp) och av ERA-NET NEURON, JTC 2015 kind, STEM-MCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
