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Developmental Biology

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानकीकृत और प्रतिलिपि Forebrain-प्रकार सेरेब्रल Organoids की पीढ़ी

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/56768
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, 2Central Institute of Mental Health, University of Heidelberg/Medical Faculty Mannheim, 3Hector Institute for Translational Brain Research (HITBR gGmbH)
* These authors contributed equally

Summary

सेरेब्रल organoids इन विट्रो मेंजल्दी मानव मस्तिष्क विकास की जांच करने के लिए एक नया मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस अनुच्छेद के लिए कुशलतापूर्वक महत्वपूर्ण लक्षण वर्णन और मांयता कदम सहित मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सजातीय पृष्ठीय forebrain-प्रकार organoids उत्पंन करने के लिए विस्तृत पद्धति प्रदान करता है ।

Abstract

मानव प्रांतस्था अत्यधिक विस्तार किया है और विशिष्ट कार्यात्मक क्षेत्रों के साथ एक जटिल संरचना दर्शाती है, उच्च मस्तिष्क समारोह प्रदान, अनुभूति के रूप में । मानव मस्तिष्क प्रांतस्था विकास के अध्ययन के प्रयास मॉडल प्रणालियों की उपलब्धता के द्वारा सीमित कर दिया गया है । मानव प्रणाली के लिए कुतर अध्ययनों से परिणाम का अनुवाद प्रजातियों के अंतर से प्रतिबंधित है और मानव प्राथमिक ऊतकों पर अध्ययन ऊतक की उपलब्धता की कमी के साथ ही नैतिक चिंताओं में बाधा उत्पन्न कर रहे हैं । मानव pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) प्रौद्योगिकी में हाल के विकास के तीन आयामी (3 डी) आत्म आयोजन organotypic संस्कृति प्रणाली है, जो एक निश्चित सीमा तक मानव-विशिष्ट विट्रो मेंमस्तिष्क विकास के लिए नकल की पीढ़ी में शामिल हैं । वर्तमान में, विभिंन प्रोटोकॉल या तो पूरे मस्तिष्क या मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट organoids की पीढ़ी के लिए उपलब्ध हैं । सजातीय और प्रतिलिपि forebrain की पीढ़ी के लिए विधि-प्रेरित पीएससी (iPSC), जो हम पहले से स्थापित है और यहां का वर्णन से organoids प्रकार पीएससी की आंतरिक क्षमता को जोड़ती है के प्रति निर्देशित विभेद के साथ स्वयं को संगठित पूर्वकाल neuroectodermal वंश और मैट्रिक्स embedding एक सतत neuroepithelium के गठन का समर्थन करने के लिए । अधिक विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल शामिल है: (1) iPSC समुच्चय की पीढ़ी, एक धाराप्रवाह monolayer संस्कृति के लिए iPSC कालोनियों के रूपांतरण सहित; (2) पूर्वकाल neuroectoderm की प्रेरण; (3) एक मैट्रिक्स पाड़ में neuroectodermal समुच्चय की embedding; (४) neuroectodermal समुच्चय से forebrain-प्रकार organoids की पीढ़ी; और (५) forebrain-प्रकार के organoids का निर्धारण और सत्यापन. जैसे, इस प्रोटोकॉल मानकीकृत और प्रतिलिपि iPSC की पीढ़ी के लिए एक आसानी से लागू प्रणाली प्रदान करता है-व्युत्पंन cortical ऊतक संरचनाओं में।

Introduction

मानव मस्तिष्क स्पष्ट रूप से सबसे जटिल अंगों में से एक है और सभी मानव बौद्धिक क्षमताओं के लिए जिंमेदार है । इस प्रकार, मानव की एक गहरी समझ विशेष मस्तिष्क विकास मानव संज्ञानात्मक क्षमताओं की समझ के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है । परंपरागत रूप से, ट्रांसजेनिक पशुओं के मस्तिष्क के विकास का अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में सेवा की । इन मॉडलों मस्तिष्क विकास के सिद्धांतों में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है । अब हम जानते है कि सभी स्तनधारियों में मस्तिष्क के विकास की एक आम सुविधा जनक प्रसार, neurogenesis, और ंयूरॉंस प्रवास की एक सटीक कोरियोग्राफी है । वहां रहे हैं, तथापि, मॉडल जीवों के दिमाग के बीच महत्वपूर्ण संरचनात्मक मतभेद, ऐसे कुतर और मनुष्यों के रूप में, विशेष रूप से neocortex में । प्राथमिक तंत्र है कि रहनुमा cortical विकास के लिए योगदान करने का प्रस्ताव किया गया है स्टेम और जनक कोशिकाओं के साथ ही बाहरी रेडियल glia कोशिकाओं (oRGCs) है, जो केवल बहुत ही कम कुतर में पाया जाता है की पीढ़ी के एक वृद्धि प्रसार कर रहे है1 ,2,3.

मॉडल मानव मस्तिष्क प्रांतस्था विकास के तरीके पीएससी की पीढ़ी-व्युत्पंन telencephalic जनक कोशिकाओं और monolayer संस्कृतियों के रूप में मस्तिष्क प्रांतस्था प्रक्षेपण न्यूरॉन्स शामिल हैं । ये मानकीकृत भेदभाव प्रोटोकॉल इस तरह के cortical neurogenesis4के टकसाली आदेश के रूप में मानव cortical विकास के कुछ पहलुओं को फिर से खेलना । वे, तथापि, कम गिरावट जब यह स्थानिक पैटर्न और morphogenesis के रूप में organogenesis के विकास की प्रक्रिया की recapitulation की बात आती है । स्टेम सेल जीवविज्ञान में और अधिक हाल की घटनाओं पीएससी है, जो के अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव कर रहे है से 3 डी organoid संस्कृतियों की स्थापना के लिए नेतृत्व में इन विट्रो मानव organogenesis । organotypic संरचनाओं, विभिंन organoids, जो गुर्दे, आंत, आंख, और मस्तिष्क के उन सहित अंगों के मुख्य संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को प्रतिबिंबित में स्वयं को पीएससी की क्षमता का उपयोग5स्थापित किया गया है । इस तरह के organoids कई अंग विशिष्ट सेलुलर उपप्रकार है, जो समूह के साथ और स्थानिक बहुत vivo5,6 मेंविकासशील अंगों के समान व्यवस्थित होते हैं । इसके अलावा, सेल संरचना, वंश संबंध, और जीन नेटवर्क के अध्ययन एकल सेल आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर पता चला कि मानव मस्तिष्क organoids ईमानदारी से मानव भ्रूण neocortex विकास के प्रमुख पहलुओं जैसे जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के रूप में दोहराऊंगा 7 , 8. एक बड़ी खामी है, जो उनके व्यापक आवेदन अब तक रोका गया था, तथापि, बड़े बैच के लिए बैच रूपांतरों और organoid-organoid विविधता9।

यहां, हम एक सरल और मानकीकृत forebrain प्रकार organoid संस्कृति प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रणाली की प्रमुख विशेषता यह है कि यह कुशलता से और reproducibly लगभग अनंय पृष्ठीय telencephalic पहचान के पीएससी व्युत्पंन organoids उत्पंन करता है । प्रोटोकॉल हमारे हाल के सेल रिपोर्ट पेपर10में प्रयुक्त विधियों पर आधारित है । यह cortical neuroepithelium के चुनिंदा प्रेरण के साथ iPSCs की स्वयं संगठन क्षमता को जोड़ती है और मजबूती से 3 सप्ताह के भीतर जल्दी पृष्ठीय telencephalic ऊतक के सजातीय संस्कृतियों उत्पंन कर सकते हैं। प्रोटोकॉल पहले रिपोर्ट SMAD संकेतन और Wnt निषेध रणनीति है कि गाइड पूर्वकाल neuroectodermal वंश11,मैट्रिक्स embedding, जो के साथ संयोजन में12 की दिशा में पीएससी के भेदभाव पर बनाता है बड़े और सतत neuroepithelial संरचनाओं के गठन को बढ़ावा देता है13. हम सफलतापूर्वक विभिंन iPSC लाइनों पर वर्णित विधि का इस्तेमाल किया है, प्रति व्यक्ति कई क्लोन के साथ । हमें पता चला है कि इस प्रणाली के बहाव अनुप्रयोगों जिसमें reproducibility और सजातीयता रोग मॉडलिंग जैसे प्रमुख महत्व के है के लिए उपयुक्त है । जब एक गंभीर cortical कुरूपता से पीड़ित रोगियों से व्युत्पंन iPSCs के लिए प्रोटोकॉल लागू करने, हम विट्रो में रोग की बीमारी की पहचान दोहराऊंगा करने में सक्षम थे और नए आणविक phenotypic के लिए अग्रणी तंत्र की पहचान करने के लिए परिवर्तन10। हमारा सुझाव है कि वर्णित organoid प्रोटोकॉल के बीच अंतर को बंद करने के लिए उपयोग किया जा सकता है गुटबंदी पीएससी-व्युत्पंन cortical monolayer संस्कृतियों और vivo में अध्ययन, और है कि यह एक विश्वसनीय और स्थिर सेल आधारित मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करने के लिए जल्दी अनुकरण मानव शरीर के बाहर स्वास्थ्य और रोग में मानव cortical विकास ।

Protocol

1. iPSC समुच्चय की पीढ़ी

  1. iPSC कालोनियों से एकल सेल monolayer संस्कृतियों की पीढ़ी
    1. एक तहखाने झिल्ली निकालने (BME) लेपित 6-अच्छी तरह से थाली तैयार करें । गल BME 4 ° c पर बर्फ पर 2-3 एच के लिए, यह ठंडा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम f12 (DMEM-F12; 1:50 कमजोर पड़ने) के साथ पतला, पतला BME समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ प्लेट कवर, और प्लेट रात 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. महाप्राण मध्यम और धोने बरकरार iPSC फॉस्फेट में ०.५ मिमी EDTA के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के कम 2 कुओं की कालोनियों (पंजाब) में दो बार ०.५ mm ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ 4 मिनट के लिए पंजाब के कमरे के तापमान पर (RT) कालोनियों मशीनिंग से पहले । महाप्राण EDTA समाधान और धीरे उंहें DMEM-F12 मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ पकवान के नीचे से धोने से कालोनियों अलग । उंहें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए और उंहें (आरटी पर १,२०० x जी पर 4 मिनट) के केंद्रापसारक द्वारा गोली ।
      नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fibroblasts से iPSCs का सफलतापूर्वक10उपयोग किया गया है ।
    3. महाप्राण supernatant और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए सेल-पृथक्करण रिएजेंट के ५०० µ एल के साथ iPSC कालोनियों की मशीन ।
    4. प्लास्टिक सेल निलंबन कई बार धीरे ऊपर और नीचे एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ एकल कोशिकाओं में शेष सेल समूहों को तोड़ने के लिए ।
    5. कक्ष-पृथक्करण रिएजेंट को पतला करने के लिए कक्ष निलंबन के लिए 4 मिलीलीटर DMEM-F12 जोड़ें ।
    6. १,२०० x g पर 4 मिनट के लिए RT पर कक्षों को स्पिन करना
    7. iPSC माध्यम के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड 5 µ एम वाई-२७६३२ और बीज कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से एक BME लेपित 6-अच्छी तरह से थाली के पूरक ।
      नोट: एकल-कक्ष monolayer iPSC संस्कृतियों के लिए सामग्रियों की तालिका में निर्दिष्ट iPSC माध्यम का उपयोग करें ।
    8. अगले दिन, ताजा iPSC मध्यम कमी के साथ मध्यम बदलें Y-२७६३२ । इस बिंदु से, संस्कृति कोशिकाओं को जारी रखने के लिए, मध्यम हर दिन बदल रहा है जब तक iPSCs १००% धाराप्रवाह हैं । सेल लाइन और शुरू कुओं के प्रवाह के आधार पर, यह 2-4 दिनों के बीच ले जाएगा ।
    9. एक बार धाराप्रवाह, iPSCs पारित । महाप्राण मध्यम और कोशिकाओं पर सेल-पृथक्करण रिएजेंट के ५०० µ एल लागू होते हैं ।
    10. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट रॉक ।
    11. अच्छी तरह से DMEM-F12 के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को धोने और उंहें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा । 5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए DMEM-F12 जोड़ें ।
    12. RT पर 4 मिनट के लिए १,२०० x g पर कक्ष नीचे स्पिन और supernatant महाप्राण ।
    13. बीज iPSC माध्यम में कोशिकाओं 5 µ एम वाई के साथ पूरक-२७६३२ एक 1:2 में 1:4 अनुपात करने के लिए एक BME लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट (2 मिलीलीटर/
    14. संस्कृति के लिए जारी 2-5 दिनों के लिए कोशिकाओं और परिवर्तन iPSC मध्यम कमी Y-२७६३२ हर दिन है । एक बार धाराप्रवाह, पारित iPSCs (कदम 1.1.4-1.1.8) ।
      नोट: संस्कृति को iPSC समुच्चय की पीढ़ी के लिए उपयोग करने के लिए उन कोशिकाओं को संस्कृति की स्थिति के अनुकूल करने की अनुमति देने से पहले iPSC माध्यम में एक monolayer के रूप में कम से iPSCs के रूप में 2 मार्ग के लिए ।
  2. monolayer iPSC संस्कृतियों का प्रयोग करें जब वे 70-90% iPSC समुच्चय की पीढ़ी के लिए धाराप्रवाह हैं ।
    नोट: iPSC एकल कोशिकाओं के रूप में संस्कृति की स्थिति के लिए अनुकूलित कम तनाव की संभावना है कि पृथक्करण और एकत्रीकरण प्रक्रिया के दौरान कोशिका मृत्यु की ओर जाता है । Monolayer iPSC संस्कृतियों विभेद का कोई सबूत के साथ ठेठ pluripotent आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने की जरूरत है । माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए एक नियमित आधार पर संस्कृतियों का परीक्षण । केवल माइकोप्लाज्मा मुक्त iPSC संस्कृतियों के साथ काम करते हैं ।
    1. एक 6-well प्लेट की एक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम महाप्राण और कोशिकाओं पर सेल-पृथक्करण रिएजेंट के ५०० µ एल लागू होते हैं ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट रॉक ।
    3. अच्छी तरह से DMEM-F12 के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को धोने और उंहें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा । 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए DMEM-F12 जोड़ें ।
    4. सेल की गिनती के लिए, सेल सस्पेंशन से 25 µ l लें और मृत कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए trypan ब्लू के 25 µ l के साथ मिलाएं । एक गिनती चैंबर का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं गिनती ।
    5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन से पर्याप्त कोशिकाओं (iPSC कुल प्रति ४,५०० कोशिकाओं) ले लीजिए ।
    6. RT पर 4 मिनट के लिए १,२०० x g पर कक्ष नीचे स्पिन और supernatant महाप्राण ।
    7. iPSC मध्यम के एक उपयुक्त मात्रा में कोशिकाओं reसस्पेंड ५० µ एम वाई के साथ पूरक-२७६३२ ४,५०० जीवित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रति १५० µ l.
      नोट: Y-२७६३२ (५० µ m) की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करना iPSCs के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है ।
    8. प्लेट १५० µ एल के प्रत्येक कुआं में एक कम लगाव ९६-अच्छी तरह से U-नीचे प्लेट और यह मशीन में ३७ ° c और 5% सह पर जगह2।
      नोट: iPSC समुच्चय पैदा करते समय 20 दिन में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए 6 organoids की आवश्यकता होती है (अनुभाग 5 देखें) पर विचार करें ।

2. पूर्वकाल Neuroectoderm की प्रेरण

  1. बारीकी से एक 4x या 10x पावर लेंस का उपयोग ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत हर दिन iPSC समुच्चय की आकृति विज्ञान परिवर्तन की निगरानी. 1 दिन पर निरीक्षण, स्पष्ट सीमाओं के साथ सेल समुच्चय । ३७ ° c और 5% CO2पर मशीन में संस्कृति iPSC समुच्चय के लिए जारी रखें ।
    नोट: मृत कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या/अच्छी तरह से सामांय है और organoid पीढ़ी को प्रभावित नहीं करेगा ।
  2. iPSC समुच्चय फ़ीड 2 दिन से शुरू करने और धीरे से हर दूसरे दिन के साथ जारी रखने के माध्यम से लगभग 2/3 नीचे में सेल समुच्चय परेशान बिना । iPSC मध्यम कमी Y-२७६३२ के एक अतिरिक्त १०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: 4-6 दिनों के भीतर सेल समुच्चय व्यास में 350-450 µm और चिकनी किनारों का प्रदर्शन किया जाएगा ।
  3. इस स्तर पर, एक कट १०० µ l पिपेट टिप के साथ सेल समुच्चय पूल एक कम अनुलग्नक 6 सेमी डिश में (अधिकतम 20 समुच्चय/cortical प्रेरण माध्यम में DMEM-F12 युक्त N2 अनुपूरक (1:200) के साथ, B27 अनुपूरक (1:100), ग्लूकोज (०.२ मिलीग्राम/एमएल), चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (cAMP; ०.१५ µ g/एमएल), ०.५% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 1% l-alanyl-l-glutamine, हेपरिन (10 µ g/ml), और यौगिकों LDN-१९३१८९ (१८० एनएम), A83-01 (५०० एनएम), और Wnt प्रतिक्रिया के अवरोधक-1 (IWR-1) (10 µ g/एमएल) । cortical प्रेरण मध्यम 3 दिनों के लिए उन्हें 6-cm डिश स्थानांतरित करने के बाद बदलकर सेल समुच्चय फ़ीड ।
  4. बारीकी से ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत cortical प्रेरण के दौरान रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी एक 4x बिजली लेंस का उपयोग कर ।
    नोट: cortical प्रेरण माध्यम में 4-5 दिनों के बाद, कोशिका समुच्चय के किनारों को सतह पर चमकाना शुरू करना चाहिए, neuroectodermal विभेद का संकेत है । इस स्तर पर, एक pseudostratified उपकला के रेडियल संगठन उभर रहे हैं. एक BME मैट्रिक्स में सेल समुच्चय एंबेड करने के लिए धारा 3 के लिए आगे बढ़ें ।

3. एक मैट्रिक्स पाड़ में Neuroectodermal समुच्चय की embedding

  1. 2-3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर गल BME Aliquot पतला BME पर्याप्त मात्रा में ।
  2. एंबेडिंग प्रक्रिया के लिए एक प्लास्टिक आयल फिल्म शीट तैयार करें । 4 सेमी x 4 सेमी बड़े टुकड़ों में बाँझ कैंची का उपयोग प्लास्टिक आयल फिल्म कट, १०० µ एल सुझावों के लिए एक खाली १०० µ एल टिप ट्रे पर प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा रखो, और एक दस्ताने उंगली से प्रेस ताकि प्लास्टिक आयल फिल्म शीट में छोटे डिम्पल (1 di बनाया जाता है mple/सेल कुल की जरूरत है) । ७०% इथेनॉल के साथ प्लास्टिक आयल फिल्म साफ और यूवी प्रकाश के साथ यह विकीर्ण (शक्ति: 15 वाट, तरंग दैर्ध्य: ४३५ एनएम) 30 मिनट के लिए बंद बाँझ बेंच के तहत ।
  3. प्रत्येक कक्ष समुच्चय को प्लास्टिक आयल फिल्म शीट के एक १०० µ एल कट टिप का उपयोग करते हुए 1.5-2 मिमी व्यास में खोलने के साथ स्थानांतरण । मामले में है कि दो सेल समुच्चय आपस में जुड़े हुए हैं, उंहें अलग नहीं है लेकिन उंहें एक साथ स्थानांतरित करने के लिए एक डिंपल ।
  4. धीरे से एक बिना खतना के १०० µ l पिपेट टिप का उपयोग कर सेल समुच्चय आसपास के माध्यम महाप्राण ।
    नोट: सावधान रहो टिप में सेल समुच्चय चूसना नहीं है, के रूप में यह समुच्चय को नुकसान होगा ।
  5. प्रत्येक कक्ष एग्रीगेट में ४० µ l को पतला BME का जोड़ें.
  6. BME एक बिना खतना के १०० µ l पिपेट टिप का उपयोग कर ड्रॉप के बीच में प्रत्येक कोशिका सकल स्थिति ।
    नोट: बहुत सावधान रहना पिपेट टिप के साथ विकासशील neuroepithelium नुकसान नहीं है ।
  7. ध्यान से प्लास्टिक आयल फिल्म शीट एक 10 सेमी पेट्री डिश में बाँझ संदंश का उपयोग कर हस्तांतरण (या एक और पर्याप्त सेल संस्कृति डिश) और 15-20 मिनट के लिए मशीन में पकवान जगह के लिए BME जमना अनुमति देते हैं ।
  8. इस बीच, cortical प्रेरण मध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त एक कम लगाव 6 सेमी डिश तैयार करते हैं ।
  9. BME के बहुलकीकरण के बाद, प्लास्टिक आयल फिल्म शीट से सेल समुच्चय युक्त बूंदों को हटा दें । बाँझ संदंश का उपयोग कर पर प्लास्टिक आयल फिल्म बारी और धीरे से थोड़ा झुका (के बारे में 30 डिग्री) कम लगाव 6 सेमी डिश में सेल समुच्चय निचोड़ जब तक बूंदों से प्लास्टिक आयल फिल्म शीट गिर जाते हैं । एक 6 सेमी डिश में 16 सेल समुच्चय की एक अधिकतम स्थानांतरण ।
  10. ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल समुच्चय की मशीन जारी रखें ।

4. Neuroectodermal समुच्चय से Forebrain-प्रकार Organoids की पीढ़ी

  1. एक BME मैट्रिक्स में embedding के बाद एक दिन, एक सेल संस्कृति मशीन में स्थापित 5 डिग्री और 14 rpm की एक झुका कोण के साथ एक कमाल सेल संस्कृति के बरतन पर organoid संस्कृति व्यंजन जगह है ।
  2. प्रतिदिन मॉनीटर organoids । सजातीय neuroepithelial पाश की तरह संरचनाएं धीरे BME मैट्रिक्स में embedding के बाद विकसित करना ।
  3. जब neuroepithelial लूप संरचनाओं दिखाई दे रहे हैं, N2 अनुपूरक (1:200), B27 अनुपूरक (1:100), ग्लूकोज (०.२ मिलीग्राम/एमएल), शिविर (०.१५ µ g/ml), ०.५% NEAA, 1% l-alanyl-l-glutamine के साथ DMEM-F12 युक्त माध्यम को organoid करने के लिए माध्यम बदलें, इंसुलिन (२.५ µ g/mL)
  4. बदलें organoid भेदभाव मध्यम हर 3-4 दिनों तक वांछित भेदभाव समय बिंदु तक पहुंच जाता है । फिर organoids फिक्स (खंड 5 देखें) ।
    नोट: कभी कभार, ऊतक पाश संरचनाओं के बिना ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतक की कलियों प्रदर्शन कर सकते हैं । हालांकि यह आदर्श नहीं है, यह cortical संरचनाओं के विकास को प्रभावित नहीं कर रहा है । organoids को organoid विभेदक माध्यम में ४० दिनों तक प्रसंस्कृत किया जा सकता है. विस्तारित संस्कृति अवधियों (40-100 दिन) के लिए organoid विभेदक मध्यम 1:50 BME के साथ पूरक किया जा सकता है ऊतक जटिलता को बढ़ाने के लिए और बीडीएनएफ और GDNF के साथ ंयूरॉन अस्तित्व और परिपक्वता की अनुमति14,15.

५. Forebrain-प्रकार के Organoids का निर्धारण और सत्यापन

  1. मान्यता के लिए, 20 दिन में 6 organoids लीजिए. mRNA अलगाव और पीसीआर विश्लेषण के लिए 3 organoids का प्रयोग करें । अतिरिक्त 3 organoids को 24-वेल प्लेट में ट्रांसफर करें जिसमें एक कट 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके 3-3.5 mm का उद्घाटन और अनुक्रमिक immunocytochemical विश्लेषण के लिए ।
  2. organoids को दो बार धोकर पंजाबियों को सावधानी से aspirating और 5-एमएल पिपेट का उपयोग करके नए सिरे से पंजाबियों के साथ प्रतिस्थापित करें । ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) (pH ७.४) में 15 मिनट के लिए organoids को ठीक करें ।
    सावधानी: खबरदार कि पीएफए एक जानी-मानी ह्यूमन यलो है । सभी काम एक रासायनिक धुएं नाइट्राइल दस्ताने पहने डाकू में किया जाना चाहिए । यह सुरक्षा चश्मा पहनने की सिफारिश की है । Formaldehyde कॉर्निया को अपरिवर्तनीय क्षति हो सकती है ।
  3. महाप्राण पीएफए ध्यान से और धो तीन बार 10 मिनट के लिए कमरे का तापमान पंजाब का उपयोग कर ।
  4. एक 30% सुक्रोज समाधान (wt/vol, पंजाब-आधारित) के साथ पंजाबियों की जगह है और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान को निर्जलीकरण के लिए organoids अनुमति देते हैं । Organoids आगे प्रसंस्करण तक 7 दिनों तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. एक दिन के निर्धारण के बाद, पूर्व trypan नीले लगभग 10 मिनट के लिए cryosectioning प्रक्रिया के दौरान organoids के दृश्य की अनुमति देने के लिए 1:50 से जोड़ने के द्वारा निर्जलित organoids दाग ।
  6. embedding मध्यम तैयार करें जिसमें 10% सुक्रोज, ७.५% जिलेटिन wt/पंजाबियों में vol, और यह तरल है जब तक ७५ ° c करने के लिए गर्म ।
  7. मध्यम embedding के साथ 30% सुक्रोज समाधान बदलें और 24-well प्लेट को एक हीटिंग प्लेट (६० ° c) पर 15 मिनट के लिए organoids equilibrate करने के लिए स्थानांतरित करें ।
  8. एंबेडिंग मीडिया की एक परत के साथ एंबेडिंग molds के नीचे कवर और उंहें बर्फ पर polymerize के लिए जगह है ।
  9. organoids को 24-well प्लेट से पॉलिमर एंबेडिंग माध्यम युक्त embedding मोल्ड करने के लिए स्थानांतरण, शीर्ष पर अतिरिक्त embedding मध्यम जोड़ें ताकि organoids कवर कर रहे हैं, और एक १००% इथेनॉल/सूखी बर्फ ठंड स्नान में जल्दी से मोल्ड जगह ( तापमान-30 से-५० डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए) सदमे-फ्रीज करने के लिए ंयूनतम 1 मिनट के लिए ।
  10. सूखी बर्फ पर अस्थाई रूप से संदंश के साथ मोल्ड प्लेस और या तो उंहें दुकान पर-८० ° c या सीधे cryosectioning के साथ आगे बढ़ना ।
  11. Cryosection 20 µm मोटाई पर organoids और खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों इकट्ठा, स्लाइड पर वर्गों के आदेश का ट्रैक रखते हुए (क्रमिक) । अनुभागों को कई घंटे के लिए स्लाइड पर शुष्क करने के लिए अनुमति दें, उंहें-८० ° c या सीधे प्रदर्शन immunocytochemical धुंधला पर भंडारण से पहले ।

Representative Results

मानकीकृत forebrain प्रकार organoid प्रोटोकॉल यहां वर्णित आम तौर पर खेती के 20 दिनों के भीतर मानव cortical से लगभग अनंय पृष्ठीय iPSCs पहचान की अत्यधिक समरूप organoid संस्कृतियों उत्पंन ( चित्रा 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल A) । यह प्रोटोकॉल के समय पाठ्यक्रम के दौरान कई गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करने की सिफारिश की है, यहां के रूप में परिभाषित: ' जाओ ' (भेदभाव की प्रक्रिया जारी) और ' नहीं ' जाओ (इष्टतम संस्कृतियों, यह बैच को समाप्त करने की सिफारिश की है) (चित्रा 1 ). यह भी उचित चित्र और नोट्स लेने के द्वारा प्रत्येक गुणवत्ता नियंत्रण कदम दस्तावेज़ के लिए सलाह दी जाती है ।

forebrain प्रकार organoids पैदा करने में पहला महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता वाले iPSC संस्कृतियों के साथ शुरू करने के लिए है । यह महत्वपूर्ण है कि iPSCs विभेदित कोशिकाओं के बड़े अंश शामिल नहीं है । केवल iPSC संस्कृतियों का उपयोग करें जो आरंभिक जनसंख्या (अंक 1b, C) पर विभेदित कोशिकाओं के सजातीय monolayer के रूप में मौजूद हों । इसके अलावा, यह iPSC एकत्रीकरण के लिए दिए गए सेल नंबर के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है । iPSC समुच्चय के पहले विस्तृत निरीक्षण 2 दिन पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इस स्तर पर, समुच्चय चिकनी किनारों के साथ कॉंपैक्ट सेल कलियों का गठन किया जाना चाहिए (' गो '), जबकि अनियमित प्रदर्शित समुच्चय या गुहाओं के साथ समुच्चय छोड़ दिया जाना चाहिए (' नहीं जाओ ') (आंकड़े 1 डी, ई) । अगले गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रोटोकॉल के 10 दिन में किया जाना चाहिए । इस समय बिंदु पर, सेल समुच्चय neuroectoderm की प्रेरण का प्रतिनिधित्व बाहरी सतह पर चिकनी और ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतक दिखाने चाहिए (' जाओ '), जबकि इस तरह के ऊतकों के अभाव को इंगित करता है-इष्टतम तंत्रिका प्रेरण (' नहीं जाओ ') (आंकड़े 1F, जी ). केवल उन समुच्चय है कि एक पारदर्शी सतह का प्रदर्शन (चित्रा 1F) BME मैट्रिक्स में एंबेडेड किया जाना चाहिए । एक बार एंबेडेड, cortical organoids सतत neuroepithelial पाश की तरह संरचनाओं का विकास होगा, जो जल्दी से विस्तार होगा । cortical प्रेरण की दक्षता का विश्लेषण 15 दिन और 20 दिन में की जांच करके कि क्या organoids विकसित की है ध्रुवीकरण तंत्रिका बाह्यत्वक के रूप में चित्रा 1एच, जंमू (' जाओ ') में प्रदर्शन किया । मामले में है कि organoids ऐसी neuroepithelial कलियों विकसित नहीं किया है (' नहीं-जाओ ' के रूप में चित्रा 1मैं, कश्मीर) में सचित्र, गंभीर समस्या निवारण के लिए प्रदर्शन किया गुणवत्ता नियंत्रण चरणों में संशोधन । जब कसकर प्रोटोकॉल का पालन, उच्च मानकीकृत organoid बैचों उत्पन्न किया जाएगा (आंकड़े 2a, बी), जो ≥ में ९०% सजातीयता दिखाएगा ध्रुवीय तंत्रिका बाह्यत्वक गठन के भीतर और बैचों में (चित्रा 2सी). एक आम गलती ध्रुवीय तंत्रिका बाह्यत्वक गठन के चर दक्षता के लिए अग्रणी iPSC एकत्रीकरण के लिए शुरू सेल संख्या में वृद्धि, या कम गुणवत्ता iPSC संस्कृतियों के साथ शुरू करने के लिए इस तरह के माइकोप्लाज्मा के रूप में दूषित संस्कृतियों या संस्कृतियों कि शामिल विभेदित कक्ष ।

उत्पंन organoids के पृष्ठीय telencephalic पहचान का एक विस्तृत सत्यापन 20 दिन में किया जाना चाहिए । कि अंत करने के लिए, 3 organoids तय किया जाना चाहिए और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । स्तरीकृत neuroepithelial लूप्स (चित्रा 3ए) तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर Sox2 एक्सप्रेस (चित्रा 3बी, डी), forebrain मार्करों Pax6 और Otx2 (आंकड़े 2 सी, ई), और पृष्ठीय cortical मार्कर Emx1 (चित्रा 3 च). इन cortical छोरों आगे एन-cadherin और ZO-1 के एक शिखर स्थानीयकरण की विशेषता है (आंकड़े 3 जी, एच), वेंट्रिकुलर जोन रेडियल glia सेल (vRGC)-व्युत्पंन microtubule, जो शिखर से ऊपर संरचनाओं के बेसल साइड तक फैला है ( चित्र 3 मैं), और शिखर phosphorylated vimentin (पी-vimentin, चित्रा 3जे) के लिए सकारात्मक दाग है कि कोशिकाओं विभाजन स्थित है । कोशिका मृत्यु organoid संरचनाओं के अंदर मौजूद हो सकता है । केंद्रीय apoptosis सामांय है और cortical ऊतक के विकास को प्रभावित नहीं करता है । इसके अतिरिक्त, 3 organoids जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा प्रोटोकॉल की सजातीयता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । Forebrain-प्रकार organoids पृष्ठीय Forebrain मार्करों (FoxG1, Otx2, Emx1) की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए, जबकि midbrain की अभिव्यक्ति (FoxA2, Pax5) और hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) मार्करों detectable नहीं है (चित्रा 3कश्मीर).

गुणवत्ता नियंत्रित organoids के बैचों शिखर रेडियल glial कोशिकाओं के विभाजन विमान के विश्लेषण की तरह विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कि अंत करने के लिए, हम डबल पी-Vimentin और Tpx2 (चित्रा 3जे) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दाग प्रदर्शन का सुझाव देते हैं । पी-Vimentin का बँटवारा के दौरान CDK1 द्वारा phosphorylated जाता है और नाभिक में स्थित होता है, इस प्रकार mitotic चरण१६में सभी नाभिक को अंकन करते हैं. Tpx2 एक microtubule जुड़े प्रोटीन है कि mitotic धुरी और शिखर के दौरान परमाणु प्रवासन17,18के दौरान प्रक्रियाओं कल्पना कर सकते हैं । इन मार्करों का प्रयोग, vRGC विभाजन के तीन पहलुओं के सिद्धांत में विश्लेषण किया जा सकता है: (I) चाहे कोशिका विभाजन शिखर पक्ष में जगह लेता है, (II) क्या विभाजन विमान ऊर्ध्वाधर गठबंधन है (सममित कोशिका विभाजन का संकेत), क्षैतिज, या परोक्ष ( शिखर सतह के लिए असममित कोशिका विभाजन का संकेत है, और (III) क्या microtubule आयोजन केंद्रों सामान्य रूप से गठन कर रहे हैं.

Organoids और भी अधिक जटिल संगठित और स्तरीकृत cortical ऊतक संरचनाओं में विभेदित किया जा सकता है । दिन के भीतर Cortical संरचनाओं ३५ ± 2 organoids एक वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZ) से बना रहे हैं-, एक आंतरिक और बाहरी subventricular क्षेत्र (SVZ), साथ ही एक Cortical प्लेट (सीपी)-जैसे क्षेत्र । भीतर VZ और भीतरी और बाहरी SVZ, vRGCs, मध्यवर्ती progenitors (आईपीएस), और कोशिकाओं की याद ताजा oRGCs की पहचान की जा सकती है । इसके अलावा, एक स्तरित प्रांतस्था के प्रारंभिक गठन गहरे cortical न्यूरॉन्स व्यक्त Tbr1 और Ctip2 के अंदर और ऊपरी cortical न्यूरॉन्स Satb2 व्यक्त करने के साथ-साथ सीपी की तरह क्षेत्र में मनाया जा सकता है, साथ ही बाहरी क्षेत्रों में Reelin-एक्सप्रेस कोशिकाओं10.

Figure 1
चित्र 1 : organoid प्रोटोकॉल और ' ' जाओ ' ' और ' नहीं ' के मानदंड के चित्रण का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । (A) प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध ओवरव्यू । CI मध्यम: cortical प्रेरण माध्यम; सीडी: cortical विभेद मध्यम । (ख-ग) एक इष्टतम ९०% धाराप्रवाह iPSC monolayer संस्कृति की छवि (ख) और एक गैर उपयुक्त iPSC संस्कृति का प्रदर्शन भेदभाव (ग) । (घ-ङ) आकार में एक iPSC कुल इष्टतम, कोशिका घनत्व, और सतह उपस्थिति (डी) और दो ' नो ' जाओ सेल या तो सेल पुर्जों गुहाओं (ई, ऊपरी समग्र) या अनियमित किनारों (ई, कम कुल) का प्रदर्शन दो दिन कक्ष एकत्रीकरण के बाद । (च-छ) सेल समेकित पारदर्शी और चिकनी किनारों का प्रदर्शन (एफ) और सेल ऑप्टिकल समाशोधन (जी) की कमी समुच्चय । पीली लाइन रुचि के क्षेत्र की कल्पना कर रही है । (H-K) सतत neuroepithelial छोरों के साथ एक इष्टतम organoid (एच, जे) और एक organoid कि रेडियल संगठित neuroectoderm (मैं, कश्मीर) दिन 15 और 20 दिन, क्रमशः में छवि विकसित करने में विफल रहा. स्केल बार्स, B-C ५०० µm; D-K २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : forebrain-प्रकार organoid प्रोटोकॉल की एकरूपता और reproducibility. (क-ख) प्रतिनिधि उज्ज्वल-organoids के क्षेत्र छवियां 15 दिन में एक बैच से (A) और 26 दिन (B) । (ग) 20 दिन में organoids का मात्रात्मक विश्लेषण । Organoids जो बाहरी सतह पर एक neuroepithelium, चमकदार क्षेत्र में पहचानने योग्य एक स्पष्ट सीमा और रेडियल सेलुलर वास्तुकला के सबूत के साथ ऑप्टिकली स्पष्ट सतही ऊतक के रूप में प्रदर्शन कर रहे थे मात्रा (n = 3 प्रति iPSC लाइन से कम 16 Organoids के साथ प्रति प्रयोग). स्केल बार्स, A-B: ५०० µm. त्रुटि बार्स ± एसडी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : 20 दिन में forebrain-प्रकार organoids की मांयता । (ए-जे) organoids के Immunocytochemical लक्षण वर्णन । Organoids कई neuroepithelial छोरों में व्यवस्थित (A, counterstained with DAPI) । स्तरीकृत neuroepithelial छोरों के भीतर संगठित कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर Sox2 (बी, डी) एक्सप्रेस, forebrain मार्करों Pax6 (सी, डी) और Otx2 (ई), साथ ही पृष्ठीय forebrain मार्कर Emx1 (एफ) । Cortical पाश संरचनाओं एन के संचय के साथ सबसे शिखर पक्ष में एक ठीक अनुयाई जंक्शन बेल्ट का प्रदर्शन-cadherin (जी) और zona occludens प्रोटीन 1 (ZO-1; ज). वेंट्रिकुलर RGCs ' microtubule नेटवर्क (acetylated α द्वारा सना हुआ-tubulin, एसी टब) शिखर से पाश संरचनाओं (मैं) के बेसल पक्ष को विस्तार । p-vimentin (p-विम) को व्यक्त करने वाली Proliferating कोशिकाएं शिखर सतह पर स्थित होती हैं । Mitotic धुरी Tpx2 द्वारा दाग रहे हैं । एक ऊर्ध्वाधर और एक क्षैतिज विभाजन विमान के प्रतिनिधि उच्च आवर्धन छवि (J) दाईं ओर दिखाए जाते हैं । (K) RT-क्षेत्र के लिए पीसीआर विश्लेषण-2 अलग iPSC लाइनों से व्युत्पंन organoids के दो स्वतंत्र सेट के दिन 20 में विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों । FB: भ्रूण मस्तिष्क नियंत्रण; AB: वयस्क मस्तिष्क नियंत्रण । स्केल बार्स, A-D २०० µm; ई-I 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Epitope कमजोर
Sox2 1-300
Pax6 1-500
Otx2 1-500
Emx1 1-50
एन-cadherin 1-500
ZO-1 1-100
पी-Vimentin 1-1000
Tpx2 1-500
Acetylated α-tubulin 1-500
Alexa488 विरोधी ms 1-1000
Alexa488 विरोधी आरबी 1-1000
Alexa555 विरोधी ms 1-1000
Alexa555 विरोधी आरबी 1-1000

तालिका 1:20 दिन में organoids की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एंटीबॉडी ।

प्राइमरी अनुक्रम
आगे Otx2 tgcaggggttcttctgtgat
Otx2 उलटे agggtcagagcaattgacca
आगे FoxG1 ccctcccatttctgtacgttt
FoxG1 उलटे ctggcggctcttagagat
आगे Emx1 agacgcaggtgaaggtgtgg
Emx1 उलटे caggcaggcaggctctcc
आगे FoxA2 ccaccaccaaccccacaaaatg
FoxA2 उलटे tgcaacaccgtctccccaaagt
आगे Pax5 aggatgccgctgatggagtac
Pax5 उलटे tggaggagtgaatcagcttgg
आगे HoxB2 tttagccgttcgcttagagg
HoxB2 उलटे cggatagctggagacaggag
आगे HoxA4 ttcagcaaaatgccctctct
HoxA4 उलटे taggccagctccacagttct
आगे HoxB4 acacccgctaacaaatgagg
HoxB4 उलटे gcacgaaagatgagggagag
आगे HoxB6 gaactgaggagcggactcac
HoxB6 उलटे ctgggatcagggagtcttca
आगे 18s ttccttggaccggcgcaag
18s उलटे gccgcatcgccggtcgg

तालिका 2: प्राइमर और जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए प्राइमर दृश्यों ।

Discussion

वे प्रासंगिक प्रजातियों पृष्ठभूमि और एक ऊतक संदर्भ में कोशिकाओं के जटिल 3 डी व्यवस्था प्रदान करने के रूप में मस्तिष्क organoids इन विट्रो में मानव मस्तिष्क विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । उस के साथ, वे गैर मानव पशु मॉडल और गुटबंदी मानव दो आयामी monolayer सेल संस्कृति तकनीक के बीच अंतर पुल । उनके आवेदन कर रहे हैं, तथापि, reproducibility की कमी के द्वारा बाधा9। हमने एक forebrain-प्रकार organoid प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो नमूनों को अपनी सुविधा के साथ-साथ iPSC की क्षमता को संयोजित करके बड़े नमूना-से-नमूना परिवर्तनशीलता पर काबू पा लिया है. विशेष रूप से, iPSCs स्व-संगठन को बढ़ावा देने के लिए समेकित किया गया और बाद में TGF-ß/SMAD एक बीएमपी (LDN-१९३१८९) और एक TGF-β प्रकार मैं रिसेप्टर अवरोधक (A83-01) के लिए संस्कृतियों को उजागर करके पृष्ठीय प्रांतस्था भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए संकेतन । इसके अतिरिक्त, एक यौगिक बाधा Wnt मार्ग (IWR) posteriorization को रोकने के लिए लागू किया गया था । ' आंतरिक ' के विपरीत सेरेब्रल organoid प्रोटोकॉल19, जो स्वयं पर आधारित है बाह्य नियंत्रण के बिना नहीं बल्कि विषम मस्तिष्क organoids को जंम देने और बड़े बैच विविधताओं का प्रदर्शन कर रहे है (ध्रुवीकरण की क्षमता से मापा तंत्रिका बाह्यत्वक गठन15), यहां वर्णित प्रोटोकॉल reproducibly सजातीय forebrain मानव iPSCs से विशिष्ट organoids उत्पंन करता है ।

इन forebrain-type organoids neurodevelopmental अध्ययन, जीन समारोह अध्ययन सहित विकासवादी अध्ययन, रोग मॉडलिंग और, संभावित, दवा परीक्षण और चिकित्सीय प्रयोजनों के रूप में आवेदन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, मानव cortical विकास के प्रारंभिक पहलुओं की जांच करने के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल है । हम vRGC व्यवहार के मानव-विशिष्ट पहलुओं की जांच करने के लिए forebrain प्रकार organoids इस्तेमाल किया उदाहरण के लिए है । अधिक विशेष रूप से, pathophysiological lissencephaly के एक गंभीर रूप, एक मानव cortical कुरूपता cortical तह के निकट अनुपस्थिति द्वारा विशेषता के साथ जुड़े परिवर्तन, संबोधित किया गया था । इस रोग के केवल कुछ पहलुओं चूहों में मॉडलिंग की जा सकती है के रूप में माउस मस्तिष्क स्वाभाविक रूप से lissencephalic है । जब lissencephaly रोगी के लिए organoid प्रणाली लागू-iPSCs व्युत्पंन, हम मज़बूती से मानव रोग के विशिष्ट पहलुओं दोहराऊंगा सकता है और अंतर्निहित तंत्र की पहचान । अधिक विशेष रूप से, हम प्रदर्शन कर सकते है कि रोगी व्युत्पंन organoids सममित से एक स्विच की वजह से आकार में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाने के लिए vRGCs के असममित कोशिका विभाजन । इस स्विच vRGCs ' microtubule नेटवर्क, VZ आला और कोशिका आसंजन अणुओं की बदल अभिव्यक्ति की वास्तुकला का विघटन, एन के एक बिगड़ा सक्रियण के लिए अग्रणी के संगठन में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ था-cadherin/β-catenin संकेतन अक्ष10। के नोट: β-catenin-vRGC विभाजन मोड के निर्भर विनियमन चूहों में β-catenin के व्यक्त रूप में मानव-विशिष्ट होने का सुझाव दिया गया था स्पर्श प्रांतस्था विस्तार करने के लिए सुराग और बाद में cortical तह20. इस प्रकार, हमारे डेटा पर प्रकाश डाला गया है कि forebrain प्रकार organoid प्रणाली एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है एक quantifiable तरीके से मानव-प्रारंभिक cortical विकास इन विट्रो मेंविशिष्ट पहलुओं में अध्ययन ।

भविष्य के लिए एक बड़ी चुनौती के लिए विस्तारित समय अवधि के पार organoids की एकरूपता बनाए रखने के लिए और अधिक परिपक्व ंयूरॉन phenotypes प्राप्त करने के लिए है । यह एक या निंनलिखित के अधिक से महसूस किया जा सकता है: संवर्धन एक प्रतिक्रियात्मक प्रणाली14में organoids, अस्थाई पाड़ों15लागू करने, तंत्रिका विकास, या न्यूरॉन अस्तित्व कारकों के साथ भेदभाव मध्यम पूरक । अंत में, मस्तिष्क की जटिलता में एक नियंत्रित वृद्धि अलग क्षेत्रीय पहचान21,22के सेरेब्रल organoids के साथ forebrain प्रकार organoids से इनकार करके प्राप्त किया जा सकता है ।

एक साथ ले लिया, forebrain प्रकार organoid प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक आसानी से लागू और विश्वसनीय उपकरण जल्दी cortical संरचनाओं की पीढ़ी के लिए इन विट्रो मेंप्रदान करता है । प्रोटोकॉल कई iPSC लाइनों के पार उच्च सजातीय जल्दी cortical ऊतक को जंम देता है और मज़बूती से व्यक्तिगत विशिष्ट cortical ऊतक उत्पंन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस प्रकार, प्रणाली अनुप्रयोगों है कि सजातीयता और रोग मॉडलिंग के रूप में reproducibility की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को इनोवेशन साइंस एंड रिसर्च ऑफ नार्थ रैन-Westphalia (जूनियर रिसर्च ग्रुप) द्वारा और युग-नेट न्यूरॉन, JTC २०१५ Neurodevelopmental विकारों, स्टेम-एमसीडी के द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 StemGent 130-106-274 500 nM
B27 Supplement Gibco 17504-044 1 to 100
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) Gibco A14132-02
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) Sigma-Aldrich A9501 0.15 µg/mL
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) Gibco 12605028
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal Karl Hecht 40449001
D-Glucose Carl Roth HN06.3 0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamin Gibco 11320033
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) Sakura Finetek 4565
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6511 0.5 mM 
Gelantin Sigma-Aldrich G1890
Heparin Sigma-Aldrich H3149-25KU 10 ug/mL
Inhibitor of WNT response (IWR-1) Enzo Life Science BML-WN103-0005 10 ug/mL
Insulin Sigma-Aldrich 91077C 2.5 µg/mL
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) Cell Guidance Systems MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) Gibco 35050038 1%
Low-adhesion 6 cm plates Labomedic 2081646L
Low-adhesion 10 cm plates Labomedic 2081646O
LDN-193189 Miltenyi Biotec 130-104-171 180 nM
N2 Supplement Gibco 17502-048 1 to 200
Non-essential amino acids Gibco 11140035 0.50%
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 4.00%
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Plastic paraffin film (Parafilm) BRAND GMBH + CO KG 701606
ROCK inhibitor Y-27632 Cell Guidance Systems SM02-100 5 µM or 50 µM
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tubes 15 mL Corning Life Sciences 734-0451 
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific 4951PLUS4
Tissue culture 6 well plate Falcon 734-0019
Tissue culture 24 well plate Falcon 734-0949
Trypan blue stain Gibco 15250-061
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 Amsbio AMS.51011610
Antibodies
Sox2 R&D Systems MAB2018
Pax6 Covance PRB-278P-100
Otx2 R&D Systems ab9566
Emx1 Sigma HPA006421
N-cadherin BD 610921
ZO-1 Life Tech 61-7300
P-Vimentin Biozol D076-3
Tpx2 Novus Biologicals NB500-179
Acetylated α-tubulin  NEB/CS 5335
Alexa488 anti ms Invitrogen A11001
Alexa488 anti rb Invitrogen A11008
Alexa555 anti ms Invitrogen A21424
Alexa555 anti rb Invitrogen A21429

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References

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मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानकीकृत और प्रतिलिपि Forebrain-प्रकार सेरेब्रल Organoids की पीढ़ी
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Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56768, doi:10.3791/56768 (2018).

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