Summary

Простой и недорогой Assay для измерения передвигаться в моделях мыши мышечной дистрофии

Published: December 29, 2017
doi:

Summary

Этот протокол описывает гибкий, лоу кост системы для измерения мыши передвигаться в открытом поле деятельности assay. Мы показывают, что 6-минутный передвигаться пробирного, основанными на этой системе обнаруживает снижение добровольного движения в многомерных выражений мышей и точно отличает улучшение мышц конкретных спасения этих животных.

Abstract

Измерения функциональных результатов в лечении мышечной дистрофии является важным аспектом доклинических испытаний. Assay неинвазивные и воспроизводимости результатов деятельности, который непосредственно аналогичных мер пациента передвигаться как тест 6-ти минутах ходьбы и связанных мобильности оценки является оценка добровольного передвигаться в моделях мыши. Многие общие методы для тестирования скорости мыши передвигаться и расстояние основаны на открытом поле тест, где свободное передвижение животных в арену измеряется временем. Один из основных недостатков этого подхода является что коммерческого программного обеспечения и оборудования для отслеживания движения с высоким разрешением дорого и может потребовать передачи мышей для специализированных объектов для тестирования. Здесь мы описываем лоу кост, основанные на видео системы для измерения передвигаться мышью, которая использует свободное и открытое программное обеспечение. Используя этот протокол, мы показываем что добровольные передвигаться в мышиной модели делеций null mdx для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) снизился относительно деятельности одичал тип мыши. В многомерных выражениях мышей, выражая utrophin трансген, эти дефициты активности не наблюдалось и общее пройденное неотличима от мышей дикого типа. Этот метод является эффективным для измерения изменений в добровольных передвигаться, связанные с дистрофическими патологии и предоставляет универсальная платформа, которая может быть легко адаптирована для настройки различных исследований.

Introduction

Надежных и воспроизводимых измерений функции мышц имеют решающее значение для оценки эффективности потенциальных терапий для ДМД. DMD является генетическим расстройством, вызванных мутациями в гене делеций приводит к прогрессивная мышечная слабость, потеря передвигаться, и возможного кардиореспираторной недостаточности. Наиболее широко используемых животных модель DMD является мышь делеций null многомерных выражений . Функциональных тестов появились как рутинных анализов для оценки прогрессирования заболевания в многомерных выражений мышью, а также аналогичных животных моделей другие дистрофий и миопатии. Часто используемые в vivo анализы включают измерения прочности сжатия передних конечностей, проволока, висит время, максимум rotarod, время до исчерпания во время беговой дорожки идущий и двигательной активности отслеживания. Там был значительные усилия в области стандартизации этих испытаний, с целью снижения изменчивости между доклинические исследования и увеличения трансляционная потенциал терапии, испытания на мышах1,2.

Одной из важных категорий доклинических испытаний является измерение добровольного движения, параметр, который часто изменяется в мышиных моделях мышечной дистрофии. Это обычно тестируется анализов, основанный на открытом поле мониторинг активности и может оценить горизонтальное (пешком) или вертикальными движениями (выращивание) течение минут или часов2,3,4. Ряд исследований показали добровольного движения должна быть изменена в многомерных выражений мышей, особенно после тренировки, и эти измерения показали быть чувствительным к наркотиков лечения и болезнь прогрессии. Одним из основных ограничений в выполнении этих анализов является потребность в специализированных, высокой стоимости оборудования. Здесь представлен метод лоу кост, который отслеживает мыши передвигаться с помощью легко доступных ресурсов.

6-ти минутах ходьбы находится метрика, широко используется в клинической оценки в качестве инструмента лиц с мышечной дистрофии Дюшенна5,6. Модификации этой меры были использованы для оценки результатов в животных моделях Дюшенна, включая mdx мышей7 и мышечная дистрофия (GRMD) Золотой ретривер собаки8. В этом исследовании мы фиксируем движения добровольных открытом поле в 6 минут, сразу же после вызов легкие упражнения. Расстояние передвигаться тогда была рассчитана с использованием бесплатно с открытым исходным кодом для измерения горизонтального движения с течением времени.

Основным преимуществом этого метода является, что животных можно протестированы в различных параметров без необходимости специализированного оборудования или высокой стоимости коммерческого программного обеспечения для анализа. Одним из важных аспектов этого анализа является, что она может быть выполнена в основных лабораторных условиях без необходимости перемещения или передачи мышей из виварий специализированного основного объекта. Протокол видео слежения, описанный здесь хорошо подходит для оценки передвигаться за относительно короткий период времени и может обнаруживать активность различия между мышей дикого типа и многомерных выражений , а также раскрыть функциональные улучшения в спасательной модель DMD.

Protocol

Описанные здесь методы были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в Калифорнийском университете, Лос-Анджелес. Одичал тип (C57BL/6J) и многомерных выражений мышей (C57Bl/10ScSn фон) были приобретены у коммерческого источника. MDX: utrophin-Tg мышей были подарок…

Representative Results

Вариации в открытом поле анализа было показано, быть эффективным методом для тестирования прогрессирования заболевания в моделях мышечной дистрофии. Здесь мы демонстрируем универсальный видео отслеживания метод для анализа движения двумерных мыши, с помощью легко ?…

Discussion

Assay открытое поле обеспечивает эффективную и неинвазивный способ проверить моторную функцию в моделях мыши заболевания мышц, и вариации этот assay может служить ценным конечной меры для доклинических исследований. Одним из основных ограничений с этим типом пробирного является высокой с…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья [R01 AR048179 и R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033 и F32 AR069469to E.M.G] и мышечной дистрофии ассоциации США [274143 и 416364 к R.C.W.].

Materials

Video camera Apple Inc. ME553LL/A For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent)
Kinovea software (version 0.8.15) Kinovea Association Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (version 10.0.6) Apple Inc. Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional)
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) Rubbermaid # 1778013 Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) US Acrylic, LLC Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
C57BL/6J Jackson Laboratory #000664 Male 6 month mice
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) Jackson Laboratory #001801 Male 6 month mice
mdx: utrophin-Tg (fiona) Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies Male 6 month mice

References

  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

Play Video

Cite This Article
Gibbs, E. M., Crosbie-Watson, R. H. A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy. J. Vis. Exp. (130), e56772, doi:10.3791/56772 (2017).

View Video