Summary
Este protocolo describe un sistema flexible y de bajo costo para la medición de ambulación de ratón en un ensayo de actividad de campo abierto. Mostramos que un paseo de 6 minutos el análisis basado en este sistema detecta una disminución del movimiento voluntario en ratones mdx y distingue con precisión mejora en un rescate de músculo-específica de estos animales.
Abstract
Medición de los resultados funcionales en el tratamiento de la distrofia muscular es un aspecto esencial de la prueba preclínica. La evaluación de la actividad voluntaria en modelos de ratón es un ensayo de actividad no invasiva y reproducible que es directamente análoga a las medidas del paciente deambulación como la prueba de caminata de 6 minutos y relacionados con partituras de movilidad. Muchos métodos comunes para las pruebas de velocidad de deambulación de ratón y la distancia se basan en la prueba de campo abierto, donde la libre circulación de los animales dentro de una arena se mide con el tiempo. Una desventaja importante de este enfoque es que el software comercial y equipo para el seguimiento de movimiento de alta resolución es caro y requiera transferencia de ratones a instalaciones especializadas para la prueba. Aquí, describimos un sistema de bajo costo, basado en video para medir la ambulación de ratón que utiliza software libre y código abierto. Mediante este protocolo, demostramos eso deambulación voluntaria en el modelo de ratón mdx de la distrofina es nulo por distrofia muscular de Duchenne (DMD) está disminuida en relación con la actividad de tipo ratón. En mdx ratones expresan el transgén utrophin, estos déficits de actividad no se observan y la distancia total recorrida es indistinguible de los ratones de tipo salvaje. Este método es eficaz para medir cambios en deambulación voluntaria asociada a patología distrófica y proporciona una plataforma versátil que puede adaptarse fácilmente a la configuración de diversas investigaciones.
Introduction
Mediciones fiables y reproducibles de la función muscular son fundamentales para evaluar la eficacia de las terapias potenciales para DMD. DMD es un trastorno genético causado por mutaciones en el gene del dystrophin, conduce a una debilidad muscular progresiva, pérdida de la ambulación y eventual insuficiencia cardiorrespiratoria. El modelo animal más ampliamente utilizado de la DMD es el ratón mdx de la distrofina es nulo. Una batería de pruebas funcionales han surgido como ensayos de rutina para evaluar la progresión de la enfermedad en el ratón mdx así como en modelos animales similares de otras distrofias y miopatías. Comúnmente usado en vivo ensayos incluyen mediciones de fuerza de agarre del forelimb, alambre colgante tiempo, máximo de rotarod, hasta la extenuación durante la actividad de ejecución y el motor de caminadora seguimiento. Ha habido un esfuerzo sustancial en el campo para estandarizar las pruebas, con el objetivo de reducir la variabilidad entre estudios preclínicos y aumentando las posibilidades de traslación de la terapéutica probada en ratones de1,2.
Una categoría importante de ensayos preclínicos es la medida del movimiento voluntario, un parámetro que se altera con frecuencia en modelos murinos de la distrofia muscular. Esto generalmente es probada por ensayos basados en el monitoreo de actividades de campo abierto y puede evaluar horizontal (a pie) o movimientos verticales (cría) en un transcurso de minutos u horas2,3,4. Varios estudios han demostrado movimiento voluntario a modificarse en ratones mdx , especialmente después del ejercicio, y estas medidas han demostrado ser sensibles a la progresión de enfermedad y tratamiento de drogas. Una limitación importante en la realización de estos ensayos es la necesidad de equipos especializados, de alto costo. Aquí, se presenta un método de bajo costo que paseo de ratón utilizando los recursos disponibles.
La distancia de caminata de 6 minutos es una medida comúnmente utilizada como una herramienta de evaluación clínica en los individuos con distrofia muscular de Duchenne5,6. Modificaciones de esta medida se han utilizado para evaluar los resultados en modelos animales de Duchenne, de ratones mdx 7 como la distrofia muscular (GRMD) de golden retriever perros8. En este estudio, se registra movimiento voluntario campo abierto en 6 minutos inmediatamente después de un reto de ejercicio suave. Distancia de deambulación entonces se calculó utilizando software libre de código abierto para medir movimiento horizontal en el tiempo.
La principal ventaja de este método es que animales pueden probarse en una variedad de ajustes sin necesidad de equipo especializado o alto costo comercial del software para el análisis. Un aspecto importante de este análisis es que puede realizarse en un entorno de laboratorio básicos sin necesidad de mover o transferir ratones de vivero a una instalación base especializado. El protocolo de seguimiento de video descrito aquí es muy adecuado para la evaluación de la deambulación durante períodos relativamente cortos puede detectar diferencias de actividad entre ratones de tipo salvaje y mdx , como revelan mejoría funcional en un rescate modelo de DMD.
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Protocol
Los métodos descritos aquí fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Los Ángeles. Tipo salvaje (C57BL/6J) y ratones mdx (C57Bl/10ScSn fondo) fueron compradas de una fuente comercial. MDX: ratones utrophin-Tg fueron un regalo de James Ervasti, con permiso de Kay Davies y se mantuvieron en el fondo de mdx . Paseo ensayos fueron realizados en ratones machos a los 6 meses de edad. Ratones se mantuvieron en el vivero de Ciencias de la vida de Terasaki siguiendo las pautas establecidas por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Universidad de California, Los Ángeles (aprobación #2000-029-43) y aprobación de estos estudios fue otorgada por el Garantía de Bienestar Animal de UCLA (homologación Nº A3196-01).
1. preparación de la cámara
- Realizar recolección de datos en un cuarto tranquilo, de temperatura controlada en un tiempo constante de día9. Realizar los ensayos cegados al genotipo y al tratamiento del ratón sometido a prueba.
- Adaptarse a cualquier sistema de cámara de campo abierto para este análisis.
Nota: En este estudio, utilizamos una cámara de grabación de bajo costo y fácilmente transportable de un basurero grande. La arena del campo abierto es una bandeja en una jaula o plataforma elevada. - Coloque la cámara sobre una malla de alambre por encima de la cámara para grabar a través de la arena completa.
- Limpiar la cámara de grabación con desinfectante antes de cada ensayo.
2. poner el protocolo y recopilación de datos
- Opcionalmente, inmediatamente antes de la grabación de la actividad, desafiar a cada ratón con un protocolo de activación muscular.
Nota: Esto es opcional pero se recomienda en experimentos con ratones mdx .- Permitir que el ratón para agarrar la barra de tracción de un medidor de fuerza digital y tire suavemente hacia atrás hasta que se suelte la palanca de tracción. Repita este procedimiento cinco veces por juicio.
- Tensión de pico registro (N) para cada ensayo.
Nota: Además de servir como un reto de ejercicio para el análisis de la deambulación, la fuerza ejercida por el animal durante este ensayo de fuerza de agarre puede utilizarse como una medida de resultado funcional adicional2,10. - Realizar cinco ensayos total para cada ratón con 1 min de descanso entre cada ensayo.
- Inmediatamente después de la prueba de fuerza de agarre u otro protocolo de ejercicios, colocar el ratón en la cámara de la actividad.
- Iniciar la grabación del video del movimiento del ratón en el ámbito de la cámara. Permitir que el ratón para explorar libremente durante 6 minutos.
- Detener la grabación en el minuto 6 y retomar el ratón de su jaula casera.
3. vídeo análisis
- Opcionalmente, preparar el vídeo para el análisis mediante la reducción de la velocidad de fotogramas. Con el fin de reducir la velocidad de fotogramas para el análisis de seguimiento, utilice el siguiente protocolo en un software (por ejemplo, iMovie o programa similar) de edición de vídeo para diezmar la tasa de fotogramas de vídeo por un factor de 2.
Nota: Dependiendo de la longitud y velocidad de fotogramas del vídeo, puede ser útil reducir la tasa de fotogramas de vídeo antes del análisis. En este estudio, el video fue grabado a 30 cuadros/s (6 min de grabación, total aproximadamente 10.800 Marcos).- Cargar el video en el software.
- En el menú de 'Speed', seleccione ' velocidad: rápido ' y ajustar la velocidad a 2 x.
- Exportar el vídeo diezmado en formato. MP4 para el seguimiento de análisis.
- Abrir el vídeo para el análisis en el programa de software. Ajustar la calibración para la grabación mediante la herramienta de línea de video. Trace una línea a lo largo de un lado de la cámara. Haga clic derecho sobre la línea y seleccionar "Calibrate medida..." Introduzca el tamaño real del lado de cámara en centímetros.
- Para empezar el seguimiento semiautomático de la posición del ratón, haga clic en el cursor 'move'.
A partir del marco inicial en el vídeo, haga clic derecho sobre el punto de hacer un seguimiento; el punto de seguimiento está marcado con un círculo azul.
Nota: En el presente estudio, la posición de cada animal fue localizada trazando la base de la cola. - Avanzar el cuadro haciendo clic en la flecha derecha del teclado; el punto de seguimiento debe mover automáticamente basado en la posición de la base de la cola.
- Si la posición de seguimiento no está alineada con el punto de interés en un determinado marco, alinear manualmente el círculo azul a la base de la cola.
Nota: Dependiendo de la calidad del vídeo y la velocidad del ratón, el seguimiento puede requerir niveles variables de entrada del usuario para mantener la alineación con el punto de interés. La ruta del ratón debe avanzar a través del curso del vídeo.
- Si la posición de seguimiento no está alineada con el punto de interés en un determinado marco, alinear manualmente el círculo azul a la base de la cola.
- Al seguimiento del video completo es completo, guardar la superposición video y localización. Exportar los datos posicionales del trazado al seleccionar "Exportar a hoja de cálculo".
4. Análisis de datos
- Abra los datos posicionales en un programa de hoja de cálculo. El software de análisis de movimiento informa de que la X, Y coordinar la posición del ratón en cada fotograma.
- Para calcular la distancia recorrida por el marco, utilice la siguiente ecuación (donde es la posición en el marco de una x1, y1 y marco dos es x2, y2):
Nota: Distancia acumulada con el tiempo se puede calcular mediante la adición de la distancia recorrida entre cada fotograma.
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Representative Results
Variaciones de la prueba de campo abierto han demostrado ser un método eficaz para comprobar la progresión de la enfermedad en modelos de distrofia muscular. Aquí, demostramos un video versátil seguimiento método para el análisis de movimiento del ratón bidimensional usando equipos de grabación disponible y software de código abierto (figura 1A–B). En concordancia con los resultados registrados de ensayos similares, nos muestran que ratones mdx desafiaron con un protocolo de ejercicio inmediatamente antes de la prueba muestran significativamente menos movimiento voluntario en una tarea de campo abierto de 6 minutos que los ratones de tipo salvaje (figura 1 , Figura 2). Siguiendo el ejercicio leve de un desafío de fuerza de agarre, los ratones mdx típicamente siendo todavía para los primeros minutos del Protocolo de la deambulación, con un modesto aumento en movimiento por minuto 4 a 5 (Figura 3A). Cuando se prueba el tipo salvaje y mdx animales sin un reto de ejercicio, no se detectaron en la distancia total recorrida (figura 2).
Esto es consistente con los informes de otros grupos buscando a similar análisis de movimiento, con unexercised mdx no mostrando ninguna diferencia o disminuciones pequeñas en comparación con ratones wild type. Además evaluamos ratones transgénicos que expresaban altos niveles de utrophin para probar la sensibilidad de nuestro análisis (mdx: utr-tg, línea de Fiona)11,12. El mdx: utr-tg es un modelo robusto rescate del fenotipo mdx con algunas características distróficas. Tras ejercicio, los ratones mdx expresaban utrophin eran indistinguibles de tipo silvestre, con ninguna diferencia significativa en la distancia total recorrida (figura 3B) o en cualquiera del tiempo acumulado de puntos de medida (Figura 3A).
Seguimiento en video se basa en la variabilidad de fotograma a fotograma, medida por cualquier observador manual puntuación o por detección de software automatizado. Software de análisis de movimiento libre y de código abierto permite la detección semiautomática de movimiento animal, en el que movimientos no detectados o sobrestimados pueden manualmente corregir como el rastro de la actividad se genera. Para minimizar el procesamiento de datos en este ensayo, disminuirá los videos originales de la grabación 30 fps a 15 fps. Para determinar el efecto de disminuir la frecuencia de muestreo, mide el total de distancia recorrida de 1 minuto de vídeo de velocidad de fotograma completo y entonces, en comparación con las mediciones de distancia derivadas de versiones disminuirá el conjunto de datos (Figura 4A). Se encontró que reducir la velocidad de fotogramas a la mitad (destrucción por 2) disminuyó la distancia medida en un 5.0%, y reducir la velocidad de fotogramas tan baja como 7,5 fps retuvo casi el 90% de la distancia original calculado (89.2% de distancia de vídeo 30 fps). La exactitud de la distancia medida dejados bruscamente después de este punto, aunque datasets incluso muy diezmado aún de cerca había aproximado el camino de los animales (Figura 4B). Estas observaciones destacan la importancia de considerar la velocidad de fotogramas y señal de procesamiento en la evaluación de la actividad animal y demuestran que puede mantenerse alta resolución espacial en datos video disminuirá.
Figura 1: representación abrir huellas campo de la distancia de paseo de 6 minutos. (A) montaje de cámara de grabación de actividad utilizado en este estudio. Medidor de agarre fue utilizado antes del reto de ejercicio para análisis y luego deambulación libre fue registrado en la plataforma de campo abierto. (B) imagen compuesta de 6 min de video grabación con análisis de trazo en movimiento software de seguimiento. (C) superposición de dos rastros representativos (gris, peso, n = 1; mdx, rojo, n = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto del ejercicio sobre paseo de mdx . distancias de paseo de 6 minutos se registraron a los 6 meses de edad con o sin ejercicio previo (no ejercido mdx n = 5, WT n = 4; ejercido mdx n = 5, WT n = 5). Ninguna diferencia significativa fue observada entre el peso y el mdx cuando unexercised, pero una diferencia significativa se observó en ratones ejercitados antes del ensayo (no ejercicio: WT 1077.0± 106,4 cm, ± mdx 971.0 cm 36,16; después del ejercicio: WT 770.2 ± 30,75 cm, mdx 127.8 ± 36,16 cm). Representan datos significa ± SEM. estadísticas calculadas utilizando dos vías ANOVA seguido de Tukey de la prueba de comparación múltiple (*p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001 y ***p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión transgénica de utrophin mejora la deambulación en ratones mdx . se registraron distancias paseo de 6 minutos a los 6 meses de edad utilizando una cámara de actividades de campo abierto (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) la distancia acumulada recorrida por minuto. No se detectó ninguna diferencia significativa entre el peso y el mdx: utr-tg en cualquier momento. Estadísticas calculadas utilizando dos vías ANOVA seguido por Tukey's prueba de comparación múltiple (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 y ***p < 0.0001). (B) Total abierto campo distancia recorrida durante 6 minutos (770.2 WT ± 30,75 cm, ± mdx 127.8 36,16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33,54 cm). Representan datos significa ± SEM. estadísticas calculadas usando ANOVA unidireccional seguida de Tukey de la prueba de comparación múltiple (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 y ***p < 0.0001).Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: efecto de la frecuencia de muestreo en deambulación seguimiento. En un ratón de tipo salvaje, 1 minuto de distancia de deambulación fue registrado y había seguido usando el movimiento que sigue el software en la velocidad de fotograma completa (30,0 fps, fotogramas total 1.819). Se determinó la posición bidimensional del ratón en cada fotograma, y estos datos fueron diezmados luego para simular el seguimiento en video de tarifa de marco inferior (30, 22.5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1,5 y 0,75 fps). Distancia Total (A) calculada a partir de coordenadas en cada conjunto de datos disminuirá. Las líneas punteadas muestran valores dentro del 5% de la distancia calculada de fotograma completo tasa de vídeo. Datos en este estudio se obtuvieron de video diezmada a 15 fps (flecha roja). (B) superposición de rastros comparando el marco completo tipo rastreo con 1,5 fps (arriba) y 15 fps (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo de campo abierto proporciona una manera eficaz y no invasivo para probar la función de motor en modelos de ratón de la enfermedad del músculo, y las variaciones de este ensayo pueden servir como una medida de extremo valor para los estudios preclínicos. Una limitación importante con este tipo de análisis es la accesibilidad limitada y alto costo de los sistemas de monitoreo de actividad. En este estudio, se demuestra un sistema de bajo costo para el análisis de la actividad de campo abierto que pueden generar resultados similares a equipo y software comercial existente. Este sistema puede ser utilizado dentro de vivaria donde se encuentran ratones, eliminando la necesidad de traslado de animales a las instalaciones de la base. La versatilidad de este ensayo también permite el uso de vídeo en una amplia variedad de investigación y entornos educativos, incluyendo cursos de pregrado laboratorio enfocados en el comportamiento y fisiología animal.
En este estudio, encontramos que las diferencias en el movimiento voluntario entre ratones de tipo salvaje y mdx pueden ser fácilmente detectada siguiente exacerbación por el ejercicio. Esta diferencia robusta ha sido reportada por otros grupos mirando resultados de actividad similares, incluyendo ensayos de campo abierto una hora de duración y ensayos de cría durante la noche. Mientras que no observamos diferencia en deambulación voluntaria unexercised salvaje-tipo ratones mdx , esto es consistente con los resultados de otros grupos13. Algunos investigadores han reportado una modesta diferencia en distancia de deambulación voluntaria unexercised salvaje-tipo y de ratones mdx 7, mientras que otros reportan ninguna diferencia13. Nuestros resultados apoyan el uso de la activación muscular antes de la prueba para detectar de manera fiable una diferencia estadísticamente significativa en la actividad de mdx .
En este estudio, presentamos a ratones con un ambiente de novela de campo abierto. Utilizando este nuevo protocolo, observamos muy poca variabilidad dentro de grupos. Sin embargo, cuando los ratones se colocan en un ambiente no familiar, tienden a han elevado la actividad14. Si los mismos animales deben probarse a través de varias sesiones, animales deben ser habituados a la cámara de grabación y experimentan el protocolo completo de la prueba varias veces antes de grabar los datos.
Una consideración importante en la evaluación de datos de ensayos de campo abierto es que es muy sensible al comportamiento animal y condiciones emocionales, especialmente ansiedad-como comportamiento. Es posible que el mdx puede tener una respuesta de comportamiento diferente al ambiente nuevo que los animales de control de tipo salvaje. Sin embargo, además probamos un rescate músculo-específica, la mdx: ratón utr-Tg, que expresa utrophin bajo un promotor músculo-específica. Estos ratones realizan así como de tipo salvaje animales, sugiriendo que las diferencias conductuales en ratones mdx no están conduciendo los cambios en actividad voluntaria.
Ensayos de campo abierto son ampliamente utilizados en paradigmas conductuales, así como en estudios de la función motora, y hay una gran variedad de parámetros que pueden ser registradas de sistemas de monitoreo de actividad. Algunas de estas medidas comúnmente utilizadas en software de análisis de la actividad comercial incluyen la detección automatizada de comportamientos específicos, convertir frecuencias, movimiento vertical y preferencias para regiones específicas de interés. Para el análisis de distancia de paseo de 6 minutos utilizado en este estudio, la salida es en gran parte limitada a la distancia y la velocidad de deambulación horizontal.
Además, debido a la entrada del usuario para seguimiento semiautomático en este protocolo, este análisis probablemente no sería idóneo para la actividad de seguimiento por períodos más largos de tiempo o medición de múltiples animales en paralelo. En este estudio, encontramos que un usuario entrenado podría procesar y extraer datos de videos de aproximadamente 15-30 min por la grabación. Si bien esto representa sólo una carga de tiempo moderado para los experimentos en pequeña escala, este nivel de análisis rápidamente sería prohibitivo para los estudios que en general muestra conjuntos durante un largo periodo de tiempo. Mientras más completamente automatizado sistemas de seguimiento comercial típicamente cuestan más de 20.000 USD, estas soluciones pueden ser más - y tiempo-rentable para los laboratorios donde se evalúan frecuentemente deambulación. Sin embargo, para el laboratorio y entornos educativos que prueba sólo un número pequeño de animales, la configuración simple y reproducibilidad de este ensayo proporciona una valiosa herramienta para evaluar el comportamiento motor.
Los tipos de análisis de datos disponibles son una consideración importante en la determinación de ensayos de punto final apropiado para un estudio clínico previo. Cuando éramos capaces de detectar constantemente las diferencias entre los tres genotipos con distancia de paseo de 6 minutos (tipo salvaje y mdx mdx: utr-tg), un análisis más complejo de la actividad a largo plazo puede ser deseable cuando se mira en el sutil cambios en el movimiento voluntario. Sin embargo, la accesibilidad y la sencillez de esta configuración de bajo costo hacen una prueba funcional útil y altamente relevante para los estudios preclínicos en el modelo de ratón mdx .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud [AR048179 R01 y R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 y F32 AR069469to E.M.G] y los E.e.u.u. de la Asociación de la Distrofia Muscular [274143 y 416364 a casos].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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