Summary
Denne protokol beskriver en fleksibel, billig system til måling af musen ambulation i en åben mark aktivitet assay. Vi viser, at en 6-minutters ambulation analysen baseret på dette system registrerer et fald i frivillig bevægelse i mdx mus og præcist adskiller forbedring i en muskel-specifikke redning af disse dyr.
Abstract
Måling af funktionelle resultater i behandlingen af muskelsvind er et vigtigt aspekt af prækliniske forsøg. Vurdering af frivillige ambulation i musemodeller er en non-invasiv og reproducerbare aktivitet assay, der direkte svarer til foranstaltninger i patient ambulation såsom 6-minutters gang test og relaterede mobilitet scores. Mange fælles metoder til afprøvning af mus ambulation hastighed og afstand er baseret på open field test, hvor et dyr frie bevægelighed inden for en arena er målt over tid. En stor ulempe ved denne tilgang er at kommercielle software og udstyr til høj opløsning bevægelsessporing er dyre og kan kræve overførsel mus til specialiserede faciliteter til test. Her, beskriver vi en lavpris-, video-baseret system til at måle mus ambulation, der udnytter gratis og open-source software. Ved hjælp af denne protokol, vise vi at frivillige ambulation i dystrofin-null mdx musemodel for Duchennes muskeldystrofi (DMD) er faldet i forhold til wild-type mus aktivitet. I mdx mus at udtrykke utrophin transgen, disse aktivitet underskud overholdes ikke, og den samlede afstand rejste er umulig at skelne fra wild-type mus. Denne metode er effektiv til at måle ændringer i frivillig ambulation tilknyttet dystrofe patologi, og giver en alsidig platform, som let kan tilpasses til forskellige forskningsfora.
Introduction
Pålidelig og reproducerbar måling af muskelfunktion er kritisk for at vurdere effekten af potentielle terapier for DMD. DMD er en genetisk sygdom forårsaget af mutationer i dystrophin genet, fører til progressiv muskelsvaghed, tab af ambulation og eventuel kardiorespiratorisk svigt. Den mest udbredte dyremodel af DMD er dystrofin-null mdx musen. Et batteri af funktionelle tests er dukket op som rutine assays til evaluering af sygdomsprogression i mdx musen så godt som i lignende dyremodeller for andre dystrophies og myopatier. Almindeligt anvendte i vivo assays omfatter målinger af forelimb gribestyrke, wire hængende tid, rotarod maksimum, tid til udmattelse under løbebånd kører, og motoriske aktivitet sporing. Der har været en væsentlig indsats i feltet for at standardisere disse prøver, med mål at reducere variabiliteten mellem prækliniske undersøgelser og øge translationel potentialet i therapeutics testet i mus1,2.
En vigtig kategori af prækliniske forsøg er måling af frivillig bevægelse, en parameter, der ofte ændres i murine modeller af muskelsvind. Dette er normalt testet af assays baseret på åben mark Aktivitetsovervågning, og kan evaluere enten vandret (til fods) eller lodret (opdræt) bevægelser i løbet af minutter eller timer2,3,4. En række undersøgelser har vist frivillig bevægelse ændres i mdx mus, især efter træning, og disse målinger har vist sig at være følsomme over for narkotika behandling og sygdom progression. En stor begrænsning i udførelsen af disse assays er behov for specialiseret, høje omkostninger udstyr. Her, præsenteres en billig metode, der sporer mus ambulation ved hjælp af let tilgængelige ressourcer.
6 minutters gang afstand er en metrikværdi, der almindeligvis anvendes som et værktøj til klinisk vurdering i personer med Duchennes muskeldystrofi5,6. Ændringer af denne foranstaltning har været anvendt til at vurdere resultater i dyremodeller af Duchenne, herunder mdx mus7 og golden retriever muskeldystrofi (GRMD) hunde8. I denne undersøgelse registrerer vi frivillige friland bevægelse i de 6 minutter umiddelbart efter en mild øvelse udfordring. Ambulation afstand blev derefter beregnet ved hjælp af gratis open source-software til at måle vandret bevægelse over tid.
Den største fordel ved denne metode er, at dyr kan blive testet i en række indstillinger uden behov for specialudstyr eller høje omkostninger kommerciel software til analyse. Et vigtigt aspekt af denne analyse er, at det kan udføres i en grundlæggende laboratorium indstilling uden at flytte eller overføre mus ud af vivarium til en specialiseret core facilitet. Video-tracking protokollen beskrevet her kan er velegnet til vurdering af ambulation over relativt kort tid-perioder og opdage aktivitet forskelle mellem wild-type og mdx mus, samt afsløre funktionelle forbedringer i en redning model af DMD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De metoder, der beskrives her blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of California, Los Angeles. Wild-type (C57BL/6J) og mdx mus (C57Bl/10ScSn baggrund) blev købt fra en kommerciel kilde. MDX: utrophin-Tg mus var en gave fra James Ervasti, med tilladelse fra Kay Davies, og blev opretholdt på mdx -baggrund. Ambulation assays blev udført på mandlige mus på 6 måneder. Mus blev opretholdt i den Terasaki Life Sciences Vivarium efter retningslinjer fastsat af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget på University of California, Los Angeles (godkendelse #2000-029-43) og godkendelse af disse undersøgelser blev ydet i den UCLA Animal Welfare Assurance (godkendelse #A3196-01).
1. forberedelse af salen
- Udføre dataindsamling i et stille, temperatur kontrolleret rum på en konsekvent tid af dagen9. Udføre test blændet genotype og behandling af musen bliver testet.
- Tilpasse eventuelle friland kammer system for denne analyse.
Bemærk: I denne undersøgelse bruger vi en billig og let at transportere optagelse kammer bygget fra en stor papirkurven bin. Feltet åben arena er en bakke på et bur eller lignende ophøjet platform. - Anbring kameraet på et trådnet over i salen til at registrere på tværs af den fulde arena.
- Ren optagelse kammer med desinfektionsmiddel før hvert forsøg.
2. før udøve protokol og dataindsamling
- Du kan eventuelt umiddelbart før aktivitet optagelse, udfordre hver mus med en muskel aktivering protokol.
Bemærk: Dette er valgfrit, men anbefales i eksperimenter, der involverer mdx mus.- Tillad mus til grip pull bar af en digital kraft gauge og træk forsigtigt tilbage, indtil linjen pull er frigivet. Gentag denne procedure fem gange pr. forsøg.
- Optag peak spænding (N) for hvert forsøg.
Bemærk: Ud over at fungere som en øvelse udfordring for ambulation assay, den kraft, der udøves af dyret under denne greb styrke analyse kan bruges som en ekstra funktionelle resultat foranstaltning2,10. - Udføre fem samlede forsøg for hvert mus med 1 min. hvile mellem hvert forsøg.
- Umiddelbart efter greb styrke assay eller andre motion protokol, placere musen i salen, aktivitet.
- Starte videooptagelse af bevægelsen af musen i arenaen kammer. Tillad mus til frit udforske for 6 min.
- Stop optagelse på 6 min og returnere musen til sit hjem bur.
3. video analyse
- Eventuelt forberede video analyse ved at reducere billedhastigheden. For at reducere rammehastigheden for sporing analyse, skal du bruge følgende protokol i videoredigeringsprogrammer (fx, iMovie eller lignende program) for at decimere video framerate med en faktor på 2.
Bemærk: Afhængig af længde og frame rate af videoen, kan det være nyttigt at reducere video framerate inden analyse. I denne undersøgelse, er videoen optaget på 30 rammer/s (6 min optagelse, omkring 10.800 rammer samlede).- Indlæse videoen i softwaren.
- Under menuen 'Hastighed' vælge ' hastighed: hurtigt ' og indstille hastigheden til 2 x.
- Eksportere den decimeret video i .mp4-filformatet til sporing af analyse.
- Åbn video analyse i programmet. Indstille kalibrering for videooptagelse ved hjælp af stregværktøjet. Tegn en streg langs den ene side af salen. Højreklik på linjen, og vælg "Calibrate foranstaltning..." Angiv den faktiske størrelse af kammer side i centimeter.
- Til at begynde semi-automatiske sporing af positionen mus, klik på 'Flyt' markøren.
Startende fra den første frame i videoen, Højreklik på punktet kan spores; punktet, sporing er markeret med en blå cirkel.
Bemærk: I den nuværende undersøgelse, var placeringen af hvert dyr bane ved at spore base af halen. - Forhånd rammen ved at klikke på den højre pil på tastaturet; sporing punkt bør automatisk flytte baseret på placeringen af hale base.
- Hvis sporing holdning ikke er afstemt med punktet af interesse i et givet billede, manuelt justere den blå cirkel i bunden af halen.
Bemærk: Afhængigt af kvaliteten af videoen og hastigheden af musen, tracking kan kræve variable niveauer af brugerinput til at opretholde tilpasning til punktet af interesse. Stien til musen bør rykke frem gennem løbet af videoen.
- Hvis sporing holdning ikke er afstemt med punktet af interesse i et givet billede, manuelt justere den blå cirkel i bunden af halen.
- Når sporing af den fulde video er komplet, gemme video og opsporing overlejringen. Eksportere vektoriseringen positionelle data ved at vælge "Eksporter til regneark".
4. dataanalyse
- Åbn den positionelle data i et regnearksprogram. Bevægelighed analyse software rapporter de X, Y koordinere position med musen i hver ramme.
- Brug følgende ligning til at beregne afstand, som ramme, (hvor position i ramme, en er x1, y1 og ramme to er x2, y2):
Bemærk: Akkumuleret distance med tiden kan beregnes ved at tilføje den afstand mellem hvert billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Variationer i feltet åben analysen har vist sig at være en effektiv metode til at teste sygdomsprogression i modeller af muskelsvind. Her viser vi en alsidig video sporing metode til analyse af to-dimensionel musen bevægelse ved hjælp af let tilgængelige kontrolapparatet og open source software (figur 1A-B). Konsekvent med resultater er rapporteret fra lignende assays, vi viser, at mdx mus udfordret med en øvelse protokollen umiddelbart før test viser betydeligt mindre frivillig bevægelse i en 6-minutters friland opgave end wild-type mus (figur 1 c , Figur 2). Efter den milde anstrengelse greb styrke udfordring, mdx mus typisk forbliver stadig for de første par minutter af ambulation-protokollen med en beskeden stigning i bevægelsen af minut 4 til 5 (figur 3A). Når du tester vildtype og mdx dyr uden en øvelse udfordring, opdaget vi ingen forskel i samlede afstand rejste (figur 2).
Dette er i overensstemmelse med rapporter fra andre grupper ser på lignende bevægelse assays, med uudnyttede mdx viser ingen forskel eller lille fald i forhold til wild-type mus. Vi desuden evalueres Transgene mus udtrykker høje niveauer af utrophin for at teste vores assay følsomhed (mdx: utr-tg, Fiona linje)11,12. Mdx: utr-tg er en robust rescue model af mdx fænotype med par dystrofe funktioner. Efter motion, mdx mus at udtrykke utrophin var umulig at skelne fra wild-type, med ingen signifikant forskel i den samlede afstand (figur 3B) eller på nogen af de akkumulerede tid peger målte (figur 3A).
Video-baseret sporing afhængig ramme til ramme variabilitet, målt ved enten manuel observatør scoring eller automatiseret software opdagelse. Gratis og open source bevægelse analyse software giver mulighed for semi-Automatiseret påvisning af dyrs flytning, hvor uopdaget eller overvurderede bevægelser kan manuelt rettes som aktivitet spor er genereret. At minimere databehandling i denne analyse, vi nedsamples de oprindelige videoer fra de optagne 30 fps til 15 fps. For at bestemme virkningen af faldende samplingfrekvens, vi målte samlet afstand rejste fra 1 min af fuld frame rate video og derefter sammenlignet afstandsmålinger stammer fra nedsamples versioner af datasæt (figur 4A). Vi fandt, at reducere framerate af halvdelen (decimering af 2) faldt den målte afstand af 5,0%, og at reducere den framerate så lavt som 7,5 fps bevaret næsten 90% af den oprindelige afstand beregnet (89.2% af afstanden fra 30 fps video). Nøjagtigheden af målte afstand faldt kraftigt efter dette punkt, selvom selv stærkt decimeret datasæt stadig tæt tilnærmet sti af dyret (figur 4B). Disse observationer fremhæve betydningen af overvejer framerate og signalbehandling i vurderingen af dyrenes aktivitet, og vise, at høj rumlige opløsning kan opbevares i nedsamples video data.
Figur 1: repræsentative åbne felt spor af 6 minutters ambulation afstand. (A) Set-up for aktivitet recording afdeling anvendes i denne undersøgelse. Greb meter blev brugt til motion udfordring forudgående for at assay, så gratis ambulation blev indspillet på friland-platformen. (B) sammensat billede af 6 min videooptagelse med sporing analyse i bevægelse tracking software. (C) overlejring af to repræsentative spor (WT, grå, n = 1; mdx, rød, n = 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Effekt af motion på mdx ambulation. 6 minutters ambulation afstande blev indspillet i 6 måneder, med eller uden forudgående motion (ikke udøves MDX-n = 5, WT n = 4; udøves MDX-n = 5, WT n = 5). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem WT og mdx når uudnyttede, men en væsentlig forskel var set i mus udøves inden assay (ingen motion: WT 1077.0± 106.4 cm, mdx 971.0 ± 36.16 cm, post-øvelse: WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127.8 ± 36.16 cm). Data repræsenterer betyder ± SEM. statistik beregnes ved hjælp af to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's flere sammenligning test (*p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001 og ***p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Transgene udtryk for utrophin forbedrer ambulation i mdx mus. 6 minutters ambulation afstande blev indspillet i 6 måneder ved hjælp af en åben mark aktivitet kammer (WT n = 5, MDX-n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) Akkumuleret distance rejste med minut. Ingen signifikant forskel blev fundet mellem WT og mdx: utr-tg på ethvert tidspunkt. Statistikken beregnes ved hjælp af to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's flere sammenligning test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 og ***p < 0,0001). (B) samlede åbent felt afstand rejste over 6 min (WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127.8 ± 36.16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33.54 cm). Data repræsenterer betyder ± SEM. statistik beregnes ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's flere sammenligning test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 og ***p < 0,0001).Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: effekten af samplingfrekvens på ambulation sporing. I en wild-type mus, 1 min af ambulation afstand var registreres og spores ved hjælp af bevægelse tracking software på full framerate (30,0 fps, 1,819 samlede rammer). Musen todimensional placering i hver ramme blev fastsat, og disse data blev derefter decimeret for at simulere tracking i lavere frame rate video (30, 22,5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1,5 og 0,75 fps). (A) samlede afstand beregnet ud fra koordinater i hvert nedsamples datasæt. Stiplede linjer viser værdier inden for 5% af afstanden beregnes fra den full frame Vurder video. Oplysninger i denne undersøgelse blev indhentet fra video decimeret til 15 fps (rød pil). (B) overlay spor sammenligne fuld frame rate sporing med 1,5 fps (ovenfor) og 15 fps (nedenfor). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Friland-analysen giver en effektiv og ikke-invasiv måde at teste motorik i musemodeller for muskel sygdom, og variationer af denne analyse kan tjene som en værdifuld slutpunkt mål for prækliniske undersøgelser. En stor begrænsning med denne type af analysen er den høj pris og begrænset tilgængelighed af aktivitet overvågning systemer. I denne undersøgelse viser vi et billigt system til friland aktivitet analyse, der kan generere lignende resultater til eksisterende kommercielle software og udstyr. Dette system kan anvendes inden for vivaria hvor mus er opstaldet, eliminerer behovet for at overføre dyr til grundlæggende faciliteter. Alsidigheden af denne analyse giver også mulighed for brug af video sporing i en lang række forsknings- og undervisningsmiljøer, herunder bachelor laboratorium kurser med fokus på dyrenes fysiologi og adfærd.
I denne undersøgelse fandt vi, at forskelle i frivillig bevægelse mellem wild-type og MDX- mus kan være let fundet følgende forværring af motion. Denne robuste forskel er blevet indberettet af andre grupper ser på lignende aktivitet resultater, herunder timelange friland assays og natten opdræt assays. Mens vi observerede ingen forskel på frivillig ambulation uudnyttede vildtype og mdx mus, er dette i overensstemmelse med resultater fra andre grupper13. Nogle forskere har rapporteret en beskeden forskel i frivillig ambulation afstand mellem uudnyttede vildtype og mdx mus7, mens andre rapportere forskellen13. Vores resultater støtter brugen af muskel aktivering inden prøvningen for at pålideligt registrere en statistisk signifikant forskel i mdx aktivitet.
I denne undersøgelse præsenterede vi mus med en roman friland miljø. Brug af denne nye miljø protokol, observeret vi meget lidt variation inden for grupper. Men når mus er placeret i et uvant miljø, de har tendens til at have øget aktivitet14. Hvis de samme dyr, der skal testes på tværs af flere sessioner, dyr bør være vant til optagelse kammer og gennemgå den fulde testprotokol flere gange før registrering af data.
En vigtig overvejelse at evaluere data fra friland assays er, at det er meget følsom over for dyrs adfærd og følelsesmæssige forhold, især angst-lignende adfærd. Det er muligt at mdx kan have en anden adfærdsmæssige reaktion på roman miljøet end vildtype kontroldyr. Men vi desuden testet en muskel-specifikke redning, mdx: utr-Tg mus, der udtrykker utrophin en muskel-specifikke promotor. Disse mus udføres samt wild-type dyr, hvilket tyder på, at eventuelle adfærdsmæssige forskelle i mdx mus ikke kører ændringerne i frivillig ambulation.
Feltet åben assays er meget udbredt i adfærdsmæssige paradigmer såvel som i undersøgelser af motorik, og der er en række parametre, der kan optages fra aktivitet overvågningssystemer. Nogle af disse målinger, der er almindeligt anvendt i kommercielle aktivitet analyse software omfatter Automatiseret påvisning af specifik adfærd, drej frekvenser, lodret bevægelse og præferencer for specifikke områder af interesse. For 6 minutters ambulation afstand analysen anvendes i denne undersøgelse, er output stort set begrænset til afstand og hastighed af horisontale ambulation.
Derudover som følge af det brugerinput, der kræves til semi-automatiske registrering i denne protokol, vil denne analyse sandsynligvis ikke være velegnet til aktivitet overvågning i længere perioder eller måle flere dyr i parallel. I denne undersøgelse fandt vi at en trænet bruger kunne behandle og udtrække data fra videoer i ca. 15-30 min. pr. optagelse. Mens dette repræsenterer kun en moderat tid byrde for små eksperimenter, ville dette niveau af analyse hurtigt bliver uoverkommelig for undersøgelser, der ser på store prøve sæt over en længere periode. Mens mere fuldt automatiseret kommercielle sporingssystemer typisk koste mere end 20.000 USD, kan disse løsninger være mere omkostninger og tid-effektive for laboratorier hvor ambulation ofte testes. Til laboratorie- og undervisningsmiljøer, der kun teste mindre antal dyr, giver simpelt set-up og reproducerbarhed af denne analyse imidlertid et værdifuldt redskab til vurdering af motor adfærd.
Typer af data analyser tilgængelige er en vigtig overvejelse at fastsætte passende slutpunkt assays til en præ-klinisk undersøgelse. Mens vi var i stand til konsekvent opdage forskelle mellem tre genotyper bruger 6 minutters ambulation afstand (vildtype, mdxog mdx: utr-tg), en mere kompleks analyse af langsigtede aktiviteter kan være ønskeligt, når man ser på subtile ændringer i frivillig bevægelse. Dog, tilgængelighed og enkelhed af denne billige set-up gøre det en nyttig og meget relevante funktionelle test for prækliniske undersøgelser i mdx musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health [R01 AR048179 og R01 HL126204 til R.C.W, T32 AR059033 og F32 AR069469to E.M.G] og muskelsvind Association USA [274143 og 416364 til R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
