Summary
Здесь мы представляем протокол в массовое производство сайленсинга генов мышиных НК-клеток с помощью свободной подачи дифференциации системы для механистический исследование в пробирке и в естественных условиях.
Abstract
Природные убийца (НК) клетки принадлежат к врожденной иммунной системы и первой линии борьбы против рака иммунной защиты; Однако они подавляются в микроокружения опухоли и основной механизм по-прежнему во многом неизвестным. Отсутствие последовательной и надежным источником НК-клеток ограничивает ход исследований NK клеток иммунитета. Здесь мы приводим в vitro систему, которая может обеспечить высокое качество и количество костного мозга-производные мышиных NK клеток при условии подачи бесплатно. Что еще более важно мы также продемонстрировать, что малых интерферирующих РНК опосредованной генов успешно тормозит созревание клеток NK E4bp4-зависимых с помощью этой системы. Таким образом этот роман в vitro NK клеток дифференциации системы это решение биоматериала для исследования иммунитета.
Introduction
Прогрессии рака в значительной степени зависит от опухоли микроокружения1,2, включая хост производные immunocytes, например, НК-клеток. Несколько исследований показали, что клетки внутриопухолевых негативно коррелируется с3,прогрессии опухоли4. Кроме того клинические исследования показали, что НК клеточной терапии приемных возможная стратегия для рака5,6,,78,9. NK на основе ячеек Рак иммунотерапия недавно была предложена в качестве терапевтического вариант для солидных опухолей, но существуют проблемы из-за секрецию цитокинов иммуносупрессивных и Даунрегуляция активации лигандами в микроокружения твердых опухолей 10,11. Преобразование фактор роста β (TGF-β) было предложено играть подавляющих роль в канцерогенеза, но парадоксально раковые клетки также производят TGF-β1 поддержать опухоли развития12,13,14 , 15. Фонд TGF-β сигнализации можно подавить цитолитических активности НК-клеток через вниз регулирует отзывчивость интерферона и CD16-опосредованной интерферона гамма (ИФН γ) производство в vitro16,17, 18.
Хотя нарушение TGF-β сигнализации в микроокружения опухоли может быть одним из возможных путей для устранения рака, полностью блокируя TGF-β сигнализации вызовет аутоиммунных заболеваний из-за его противовоспалительные функции, о чем свидетельствует разработка 19модели неблагоприятные побочные эффекты, включая внутрирастительного воспаления, сердечно-сосудистых дефектов и аутоиммунные заболевания в мыши. Таким образом понимание механизма работы TGF-β-опосредованной иммуносупрессия приведет к идентификации доступных терапевтических мишенью для лечения рака.
Для выяснения молекулярные события, необходимые для развития клеток NK, Williams et al. создал систему в пробирке для дифференциации мышиных костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток в NK клеток20. Эта система во многом облегчает механистический исследование развития НК клеток, включая выявление Роман прародителями NK клеток21. Однако, предшественники костного мозга следует культивировали в системе с поддержкой OP9 стромальные клетки как фидер слоя20,21, и этой неоднородной ячейки населения во многом ограничивает дальнейшее применение гена-срыве инструменты (например, малых интерферирующих РНК опосредованной генов) конкретно применительно к дифференциации НК-клеток.
Здесь мы описываем фидер бесплатная система, которая была разработана путем дальнейшего изменения системы в vitro Williams et al20. В нашей системе OP9 клетки стромы фидер не требуются, и вместо OP9, условно средних используется не затрагивая дифференциации NK клеток в пробиркеи это недавно привести нас к раскрыть, что способны содействовать прогрессии рака через TGF-β подавление развития НК E4bp4-зависимых клеток в микроокружения опухоли22. Эта новая система успешно обеспечивает фон, свободной метод для выяснения молекулярный механизм развития НК клеток при определенных условиях (например, высокая TGF-β1, сайленсинга генов малых интерферирующих РНК опосредованной, и т.д.) в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол для получения и дифференциации костного мозга-производные NK клеток (БМ-NK) основывается на ранее опубликованные методы20,21,22. Все процедуры с мышей были утверждены экспериментальные Комитет животных этики (AEEC) в китайском Университете Гонконга.
1. Подготовка условной средней OP9
- Культура линии клеток стромы мышиных OP9 в альфа MEM, содержащий 20% FBS, 100 ед/мл пенициллин G и стрептомицина 100 мкг/мл при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух/CO2 (95%: 5%).
- Подсчет количества ячеек с Горяева, затем семян 2 x 106 клеток OP9 для каждого 75 см2 культуры колбу с 15 мл среды. Культура для 48 ч.
- Когда культура достигает 80% слияния, мыть флакон с 10 мл PBS и добавляют 20 мл простого альфа MEM среды (без FBS и антибиотиков) за флакон.
- Собрать OP9 состояние среды от культуры колбу на 24 ч, очистить ячейки мусор с 0,25 мкм фильтром Полиэфирсульфон (PES) и сохранить на 4 ° C (использование в течение 2 недель).
2. изоляция клетки костного мозга мыши
- Усыпить 12-недельных C57BL/6J мышь с Пентобарбитал передозировки (100 мг/кг, внутрибрюшной инъекции). Подтвердить смерть отсутствие дыхания, а затем урожай бедренной кости с хирургического ножа режущего развязках между костями и удалите остальные мышцы с лезвием, нежный царапин.
- Место кости в центрифуге Тюбик 50 мл, содержащие охлажденные стерильные альфа MEM и затем выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета.
- Удалить альфа MEM среднего и промыть кости с 70% этанол 30 s.
- Вымойте кости с ледяной стерильные PBS дважды, чтобы очистить оставшиеся этанола.
- Передача в раствор, содержащий 5 мл ледяной PBS кости, и осторожно раздробляет кости с пестиком (не растирать их).
- Агитируйте кости осторожно, закрученной пестик для выпуска клеток костного мозга в PBS. Соберите содержащий клетки костного мозга PBS в новых центрифуг Тюбик 50 мл.
- Повторите шаг 2.6 для четыре раза, до тех пор, пока костных фрагментов стать горит белым цветом.
- Центрифуга для трубки на 465 g x 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
- Ресуспензируйте лепешка с 18 мл стерильной дистиллированной воды и дайте ему постоять 30 s для удаления красных кровяных клеток.
- Добавить 2 мл ледяной 10 X PBS для остановки реакции, затем фильтр смесь через сито ячейки 70 мкм, чтобы удалить лизированных красных кровяных клеток.
- Центрифуга для трубки на 465 g x 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с 20 мл ледяной PBS.
- Вымойте клетки, повторив шаг 2.11 во второй раз.
- Перевести ячейку Пелле на Петри блюдо стерильные с 10 мл OP9 условного среды с шагом 1,2 100-мм дополнены 20% FBS и смесь 0,5 нг/мл мышиных IL-7, 30 нг/мл мыши СКФ и 100 ед/мл мышиных flt3L.
- Инкубировать блюдо при 37 ° C с 5% CO2 на 2 ч. Передача неприсоединенной клетки в новый контейнер культуры на плотности тарелок 5 x 105 жизнеспособных клеток/мл (количество клеток Горяева с исключения Трипановый синий) с той же средней формулы как шаг 2.13 и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2.
- День 4 изменить состояние культуры OP9 условного средний дополнены 20% FBS и 2 000 ед/мл мышиных Ил-2.
- Обновите питательной среды каждые 3 дней; Зрелые клетки могут получены 7 день и квалифицированных как в разделе 4.
3. малых интерферирующих РНК опосредованной глушителя генной дифференциации НК-клеток
- Премикс управления (NC) малых интерферирующих РНК или чушь с агентом трансфекции согласно руководству продукта.
- Выполните шаг 3.1 в любой момент времени, начиная с дня 0.
- Добавьте 50 Нм siRNA или смеси НК клеток от шага 2.14.
- Повторите шаг 3.1 на каждый средней закуска (например, день 0, 4 и 7) до экспериментальной конечной точки.
4. анализ дифференцировки клеток NK с помощью проточной цитометрии
- В соответствующее время точке собирать подвеска дифференциации клеток и мыть с ледяной PBS.
- Закрепите клетки клетки фиксации буфера согласно руководство по продукции.
- Вымойте фиксированные ячейки с ледяной PBS и затем Ресуспензируйте 1 х 106 клеток в 100 мкл потока буфера пятнать цитометрии содержащий Cy3-конъюгированных анти мыши NKp46 и PE-конъюгированных антител CD244 анти мыши в коэффициенте разбавления 1: 100.
- Пятно образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Ресуспензируйте окрашенных образцов с 300 мкл PBS, а затем приобрести данных СУИМ и анализировать с Cytobank платформы20 (http://cytobank.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты получаются после описанных протокол. Всего костного подвеска клеток выращивали под фидер бесплатно дифференциации системы 11 дней; день 7, по сравнению с количество общего числа клеток в день 0 (рис. 1A) было отмечено значительное увеличение темпов распространения. Зрелые НК-клеток с высоким соотношением ядерной в цитоплазматической и морфология цитоплазме гранулы богатые были найдены 6 день в системе (рис. 1Б).
Для того, чтобы пролить свет регулирования эффект TGF-β1/Smad3 сигнализации в НК дифференцировки клеток, костного мозга, которые были transfected клеток с siRNA против мРНК E4bp4 (siE4bp4, который эффективно подавляет уровень мРНК E4bp4, как показано на рис. 2) или чушь контроль на день 0 и 4 день в фидер элементная свободной системы. Дифференцирования клетки были культивировали в системе с или без Smad3 ингибитор SIS3 на 6 дней. Анализ потока обнаружено что нокдаун E4bp4 основном подавлены созревания клеток NK как показано сокращение в CD244+ ve NKp46- ve незрелые клетки по сравнению с NC-transfected управления, тогда как ингибитирование активации TGF-β1/Smad3 значительно спасает малых интерферирующих РНК опосредованного подавления созревания клеток NK, по сравнению с siE4BP4-transfected группой (рис. 3).
Рисунок 1 . Изображение костного мозга, полученных NK клеток от системы свободной подачи. (A) рост кривой костного клетки проходят дифференцировки клеток NK в системе до 11 день, полученные путем подсчета клеток. ()B) Зрелые НК-клеток с высоким соотношением ядерной в цитоплазматической и цитоплазме гранулы богатые морфология появляются на день 6, как указано стрелками. Увеличение 200 x, шкалы бар 50 µm. данные представляют собой среднее ± SEM для 3 независимых экспериментов, ***p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Эффект подавления экспрессии гена малых интерферирующих РНК опосредованной на костный мозг клеток проходит дифференцировки клеток NK на день 6. Дифференцирования клетки были transfected с вздор контроля (НК) или siRNA, ориентация мышиных мРНК E4bp4 (siE4bp4) на день 0 и 4 день. ПЦР в реальном времени показывает, что уровень мРНК экспрессии E4bp4 на день 6 по сравнению с группой NC значительно сократилось в Си E4bp4 лечение НК-клеток. Данные представляют собой среднее ± SEM для 3 независимых экспериментов, **p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Глушителей из E4bp4 подавляет дифференциация мышиных NK клеток костного мозга, полученных образом TGF-β1/Smad3-зависимой. (A) потока cytometry анализ показывает, что нокдаун E4bp4 значительной степени уменьшается производство незрелых клеток NK (CD244+ ve NKp46-ve) на 6 день по сравнению с группой контроля (НК) чушь с помощью фидер свободной системы в пробирке , которые могут быть значительно спасены, подавляя TGF-β1/Smad3 активации с 1 мкм ингибитора SIS3 Smad3. (B) количественной оценке результатов анализа потока, ***p < 0.01 по сравнению с ЧПУ; ### p < 0.01 по сравнению с siE4BP4-transfected группой. Показываются репрезентативных данных 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 1. Строб стратегия для анализа потока NK клеток маркер выражения в целом дифференциации клеток на день 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящей работе мы описали новый метод для производства костного мозга-производные мышиных NK-клетки в пробирке. Клетки фидера в оригинальной системы21,22 успешно заменены условной средней OP9 клеток, которые во многом увеличена стабильность системы дифференциации. Кроме того система может производить высокого количества и чистоту Зрелые NK клеток в vitro , а также в vivo анализов, которые могут облегчить механистический исследования, а также трансляционного исследования НК-клеток в заболеваниях человека.
Описан метод был использован для исследования регулирующей роли TGF-β1 сигнализации в подавлении NK клеток во время развития рака23. Как там было никакого влияния от клетки фидера, являются значительной степени повысить эффективность малых интерферирующих РНК опосредованной генов нокдаун, а также ингибитора опосредованной ингибирование. Отсутствие подачи клеток OP9 позволяет нам четко продемонстрировать биологической функции Smad3 в E4BP4-опосредованной NK клеток развития, показывая нокдаун или ингибитированием целевых генов в vitro23.
Что еще более важно эта система может использоваться далее для производства большого количества генетически модифицированных мышиных НК-клеток для анализов в естественных условиях . Например мы подготовили по крайней мере 1 x 108 Зрелые НК-клеток из костного мозга клетки мыши по этой системе, и НК-клеток с определенного гена были проникнуты в опухоль подшипник NOD/SCID мыши модель продемонстрировать разницу в рак убийство эффекты в естественных условиях23. Действительно другие изменения может быть сделано на НК-клеток в этой системе, как Избыточная экспрессия гена вирусный опосредованной, окрашивания клеток, и т.д.
Следует, однако, отметить, что максимум 70% зрелых НК-клеток могут быть произведены из системы на 9 день (данные не показан), который похож на результат искусственного системы с OP9 стромальные показано Уильямс и др. 21 для преодоления этого ограничения, смешанные НК-клеток могут быть далее очищены с потоком сортировки машина, а также коммерческие NK клеток изоляции наборы для того, чтобы изолировать желаемого населения.
В заключение разработан новый метод для дифференциации НК-клеток из костного мозга мышиных клеток. Эта новая система может обеспечить возможность для получения высокой чистоты и количество зрелых НК-клеток для изучения иммунитета в заболеваниях человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано исследовательских грантов Совета Гонконга (ГФП 468513, CUHK3/ОФД/12R) и инноваций и технологий фонд Гонконга (СТС/227/15, ее ИЯФ/164/16, СТС-ИЯФ/242/16), прямые субсидии для исследования-CUHK (2016.035) и Гонконг ученый Программы.
H.-ю.л. разработан и под наблюдением все эксперименты и внесли вклад в подготовку рукописи. Ч-к.т. эксперименты, анализ данных и внесли вклад в подготовку рукописи. P.C.-Т. Т., Д.Ю-Ф.К, и.с.-C., H., Q.-М.В, и G.-ю.л. животных пробы и участвовал в подопытных животных. И.с., X.-правый, и K.-чл.КОРР способствовала подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
