Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.
Abstract
Natural killer (NK) células pertencem ao sistema imunitário inato e são uma primeira linha de defesa imunológica contra o cancro; no entanto, eles são suprimidos no microambiente do tumor e o mecanismo subjacente ainda é desconhecido. A falta de uma fonte confiável e consistente de células NK limita o progresso da investigação da imunidade de célula NK. Aqui, nós relatamos um sistema em vitro que pode fornecer alta qualidade e quantidade de medula óssea-derivado murino células NK sob uma condição livre de alimentador. Mais importante, demonstramos também que com êxito silenciamento de genes mediada por siRNA inibe a maturação de células NK E4bp4 dependentes usando este sistema. Assim, esta célula NK romance em vitro diferenciar o sistema é uma solução de biomaterial para pesquisa de imunidade.
Introduction
Progressão de câncer é largamente dependente do tumor microambiente1,2, incluindo o anfitrião-derivado de immunocytes, por exemplo, as células NK. Vários estudos demonstraram que as células NK intratumoral são negativamente correlacionadas com a progressão de tumor3,4. Além disso, estudos clínicos mostraram que a terapia com células NK adotiva é uma estratégia possível para câncer5,6,7,8,9. Imunoterapia baseada em célula NK recentemente foi sugerida como uma opção terapêutica para tumores sólidos, mas os desafios Existem devido a secreção de citocinas imunossupressoras e downregulation de ativação de ligantes no microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) tem sido sugerido um papel na carcinogênese supressiva, mas paradoxalmente as células cancerosas também produzem TGF-β1 para apoiar o tumor desenvolvimento12,13,14 , 15. sinalização do TGF-β pode suprimir a atividade citolítica de células NK via receptividade de interferon para baixo-regulação e mediada por CD16 interferon-gama (IFN-γ) produção em vitro16,17, 18.
Apesar de interrupção de TGF-β sinalização no microambiente do tumor pode ser um caminho possível para eliminar cânceres, bloquear completamente a sinalização do TGF-β causará doenças autoimunes, devido à sua função de anti-inflamatórios, como evidenciado pela evolução da efeitos colaterais adversos incluindo inflamação sistêmica, defeitos cardiovasculares e auto-imunidade mouse modelos19. Assim, entender o mecanismo de trabalho de TGF-β-mediada imunossupressão conduzirá à identificação de um alvo terapêutico acessível para tratamento de câncer.
Para elucidar os eventos moleculares necessários para o desenvolvimento de células NK, Williams et al estabeleceu um sistema in vitro para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas murino de medula óssea em NK células20. Este sistema facilita em grande parte o estudo mecanicista do desenvolvimento de célula NK, incluindo a identificação dos progenitores romance de NK células21. No entanto, os progenitores da medula óssea devem ser cultivados no sistema com células estromais OP9 de apoio como um alimentador camada20,21, e esta população celular heterogênea em grande parte limita a aplicação adicional de desregulação gene ferramentas (p. ex., silenciamento de genes mediada por siRNA) especificamente aplicada às células NK diferenciadoras.
Aqui, descrevemos um sistema alimentador-livre que se desenvolveu ainda mais, modificando o sistema in vitro de Williams et al.20. Em nosso sistema, as células de alimentador estromais OP9 não são necessárias, e em vez disso OP9 médio condicional é usado sem afetar a diferenciação da NK células in vitroe isto recentemente nos levam a descobrir que o TGF-β é capaz de promover a progressão do câncer através de suprimir o desenvolvimento de células NK E4bp4-dependente no tumor microambiente22. Este novo sistema com sucesso fornece um método livre de plano de fundo para elucidar o mecanismo molecular do desenvolvimento de células NK em condições específicas (por exemplo, elevada TGF-β1, silenciamento de genes mediada por siRNA, etc.) em vitro.
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Protocol
O protocolo para obtenção e diferenciando NK derivadas da medula óssea, células (BM-NK) é baseado em métodos anteriormente publicados20,21,22. Todos os procedimentos com ratos foram aprovados pelo Animal ética Experimental Comité (AEEC) da universidade chinesa de Hong Kong.
1. preparação do OP9 médio condicional
- Cultura a linhagem de células de estroma murino OP9 em alfa-MEM, contendo 20% FBS, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C numa atmosfera de ar/CO2 umidificada (95%: 5%).
- Conte as células com um hemocytometer, então semente 2 x 106 células OP9 para cada frasco de cultura2 75cm com 15 mL de meio. Cultura por 48 h.
- Quando a cultura atinge 80% confluência, lave o frasco com 10 mL de PBS e adicionar 20 mL de meio de alfa-MEM liso (sem FBS e antibióticos) por balão.
- Coletar o OP9 meio de condição do frasco de cultura em 24h, limpar os escombros de célula com filtro de polietersulfona (PES) 0,25 µm e preservar a 4 ° C (uso dentro de 2 semanas).
2. isolamento de células de medula óssea de rato
- Eutanásia em um rato de C57BL/6J de 12 semanas de idade com uma overdose de pentobarbitone (100 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirmar a morte pela falta de respiração, em seguida, colher os ossos fêmur com um corte de faca cirúrgica para as junções entre os ossos e remover os restantes músculos com a lâmina riscando suave.
- Coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo refrigerado estéril alfa-MEM e em seguida, execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança.
- Descartar o meio de alfa-MEM e enxágue os ossos com etanol a 70% por 30 s.
- Lave os ossos com PBS estéril gelada duas vezes para limpar o restante do etanol.
- Transfira os ossos de uma argamassa contendo 5 mL de PBS gelado e suavemente fragmentam os ossos com um pilão (não pulverizá-los).
- Agite suavemente os ossos e agitando o pilão para liberar as células da medula óssea para a PBS. Recolha as células de medula óssea contendo PBS para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
- Repita a etapa 2.6 para quatro vezes, até que os fragmentos de osso se tornar sólido branco na cor.
- Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet com 18 mL de água destilada estéril e deixá-lo ficar por 30 s para remover células vermelhas do sangue.
- Adicionar 2 mL de gelado 10 X PBS para parar a reação, em seguida filtrar a mistura através de um filtro de célula de 70 µm para remover os lisados glóbulos vermelhos.
- Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 20 mL de PBS gelado.
- Lave as células, repetindo o passo 2.11 uma segunda vez.
- Transferir o centrifugado para uma 100mm Petri estéril com 10 mL de OP9 médio condicional da etapa 1.2 suplementado com 20% FBS e uma mistura de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino de 100 U/mL.
- Incubar o prato a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 h. transferência das células não anexadas em um novo recipiente de cultura em uma densidade de 5 x 105 viável células/mL (contagem por hemocytometer com azul trypan exclusão de células) com a mesma fórmula média como na etapa 2.13 e incubar a 37 ° C com 5% de CO2.
- No dia 4, alterar a condição de cultura para OP9 condicional meio suplementado com 20% FBS e 2.000 U/mL de murino Il-2.
- Atualizar o meio de cultura a cada 3 dias; células NK maduras podem ser obtidas por 7 dias e qualificadas como na seção 4.
3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciar as células NK
- Premix o controle siRNA ou absurdo (NC) com um agente de Transfeccao de acordo com o manual do produto.
- Execute o passo 3.1 em qualquer ponto do tempo desde o dia 0.
- Adicionar a 50 nM de siRNA ou mistura de NC para as células da etapa 2.14.
- Repita o passo 3.1 em cada refresco médio (por exemplo, dia 0, 4 e 7) até o ponto de extremidade experimental.
4. análise da diferenciação de células NK usando citometria de fluxo
- Em um ponto de tempo apropriado, recolher a suspensão de diferenciar as células e lave com PBS gelado.
- Fixe as células com buffer de fixação da célula de acordo com o manual do produto.
- Lavar as células fixas com PBS gelado e depois Ressuspender 1 x 106 células em 100 µ l de fluxo Cytometry coloração Buffer contendo Cy3 anti-ratinho conjugada com NKp46 e anticorpos CD244 anti-rato PE-conjugados em uma diluição de 1: 100.
- Manche a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
- Resuspenda as amostras coradas com 300 µ l de PBS, em seguida, adquirir dados de FACS e analisar com Cytobank plataforma20 (http://cytobank.org/).
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Representative Results
Obtêm-se resultados representativos do protocolo descrito a seguir. Células de suspensão total da medula óssea foram cultivadas sob o sistema de diferenciação de alimentador-livre durante 11 dias; observou-se aumento significativo da taxa de proliferação de dia 7, em comparação com o número de células totais no dia 0 (Figura 1A). Células NK maduras com alta relação nuclear para o citoplasma e morfologia de citoplasma rico em grânulos foram encontradas por dia 6 no sistema (Figura 1B).
A fim de elucidar o efeito regulatório de TGF-β1/Smad3 sinalização na diferenciação de células NK, medula óssea, as células foram transfectadas com siRNA contra E4bp4 mRNA (siE4bp4, que efetivamente suprime a nível E4bp4 mRNA como mostrado na Figura 2) ou absurdo controle no dia 0 e 4 na célula-alimentador do sistema livre. As diferenciação de células foram cultivadas no sistema com ou sem inibidor Smad3 SIS3 por 6 dias. Análise de fluxo detectado esse nocaute de E4bp4 em grande parte suprimida a maturação de células NK, como mostrado pela redução na CD244+ ve NKp46- ve NK células imaturas comparadas com controle NC-transfectadas, Considerando que a inibição da ativação de TGF-β1/Smad3 significativamente, resgata a supressão mediada por siRNA de maturação de células NK em comparação com o grupo siE4BP4-transfectadas (Figura 3).
Figura 1 . Imagem de medula óssea-derivado NK células do sistema alimentador-free. Crescimento do (A) curva de medula óssea submetidos à diferenciação de células NK em células do sistema até o dia 11, obtidos através da contagem de células. (B) células NK maduros com alta relação nuclear para o citoplasma e morfologia de citoplasma rico em grânulos aparecem por dia 6, conforme indicado pelas setas. Ampliação de 200 x, escala bar 50 µm. dados representam média ± SEM para 3 experimentos independentes, * * *p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Efeito de silenciamento de genes mediada por siRNA na medula óssea, as células submetidos à diferenciação de células NK no dia 6. As diferenciação de células foram transfectadas com controle absurdo (NC) ou siRNA direcionamento murino E4bp4 mRNA (siE4bp4) no dia 0 e 4. PCR em tempo real mostra que o nível de expressão do mRNA da E4bp4 foi significativamente reduzida nas células NK de si-E4bp4 tratada no dia 6, em comparação com o grupo NC. Dados representam média ± SEM para 3 experimentos independentes, * *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Silenciamento de E4bp4 inibe a diferenciação das células da medula óssea-derivado murino NK em uma maneira de TGF-β1/Smad3-dependente. (A) fluxo cytometry análise mostra que nocaute de E4bp4, em grande parte, diminui a produção de células imaturas do NK (CD244+ ve NKp46-ve) no dia 6 em comparação com o grupo de controle (NC) absurdo, usando o alimentador do sistema sem in vitro , que pode ser resgatado significativamente, suprimindo a ativação de TGF-β1/Smad3 com 1 µM de inibidor Smad3 SIS3. (B) quantificação dos resultados de análise do fluxo, * * *p < 0,01 comparado com NC; ### p < 0,01 em comparação com o grupo siE4BP4-transfectadas. Dados representativos de 3 experimentos independentes são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Retenção de estratégia para análise de fluxo de expressão de marcador de células NK em total diferenciar células no dia 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente trabalho, descrevemos um método novo para produzir derivados de medula óssea murino NK células in vitro. O alimentador de célula no sistema original21,22 é substituído com sucesso pelo meio condicional de células OP9, que em grande parte, aumentou a estabilidade do sistema de diferenciação. Além disso, o sistema pode produzir quantidade elevada, e a pureza da NK maduro células para em vitro , bem como na vivo ensaios, o que podem facilitar o estudo mecanicista, bem como investigação de translação das células NK em doenças humanas.
O método descrito tem sido usado para investigar o papel regulador de TGF-β1 sinalização na supressão de células NK durante o desenvolvimento de câncer23. Como não havia nenhuma influência das células do alimentador, a eficiência do knockdown mediada por siRNA gene, bem como a inibição mediada por inibidor são largamente melhorada. A ausência das células OP9 alimentador nos permite demonstrar claramente a função biológica da Smad3 no desenvolvimento celular mediada por E4BP4 NK, mostrando o nocaute ou a inibição de genes alvo em vitro23.
Mais importante, este sistema pode ser ainda mais utilizado para produzir uma grande quantidade de células NK murino geneticamente modificadas para ensaios na vivo . Por exemplo, temos produzido pelo menos 1 x 108 células NK maduras das células da medula óssea de um único rato por este sistema, e as células NK com nocaute de um gene específico foram infundidas tumor-rolamento modelo do rato NOD/SCID para demonstrar a diferença em câncer-matança efeitos na vivo23. Com efeito, outras modificações podem ser feitas sobre as células NK neste sistema, tais como a superexpressão do gene viral mediada, coloracao celular, etc.
No entanto, deve notar-se que um máximo de 70% de células NK maduras pode ser produzido a partir do sistema no dia 9 (dados não mostrados), que é semelhante ao resultado do sistema cultivado com OP9 stromal mostrado por Williams et al. 21 para superar essa limitação, as células NK mistas podem ser mais purificadas com um fluxo classificação máquina, bem como jogos de isolamento de célula NK comerciais a fim de isolar a população desejada.
Em conclusão, é desenvolvido um novo método de diferenciação de células NK de células murino da medula óssea. Este novo sistema pode fornecer uma opção para a obtenção de alta pureza e quantidade de células NK maduras para o estudo da imunidade em doenças humanas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo Research Grants Conselho de Hong Kong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) e inovação e tecnologia Fund de Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), subvenção directa para pesquisa-CUHK (2016.035) e estudioso de Hong Kong Programa.
H.-Y.L. projetado e supervisionou todas as experiências e contribuiu para a preparação do manuscrito. P.M.-K.T. realizou experimentos, analisaram dados e contribuiu para a preparação do manuscrito. PC-T. T., JY-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., e G.-Y.L. coletou amostras de animais e participou de experiências em animais. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuiu para a preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
