Summary
在这里, 我们提出了一个 mass-produce 基因沉默小鼠 NK 细胞的协议, 使用无馈线分化系统的机械研究体外和在体内。
Abstract
自然杀手 (NK) 细胞属于先天免疫系统, 是一线抗癌免疫防御;然而, 它们在肿瘤微环境中被压制, 其基本机制仍然是未知的。nk 细胞缺乏一致、可靠的来源, 限制了 nk 细胞免疫的研究进展。在这里, 我们报告一个体外系统, 可以提供高质量和数量的骨髓来源的小鼠 NK 细胞在无饲养条件下。更重要的是, 我们还证明, siRNA 介导的基因沉默成功地抑制了 E4bp4-dependent NK 细胞成熟, 利用该系统。因此, 这本新的体外NK 细胞分化系统是一种生物材料免疫研究的解决方案。
Introduction
癌症进展主要依赖于肿瘤微环境1,2, 包括主机派生的免疫,, NK 细胞。几项研究表明, 肿瘤的 NK 细胞呈负相关的癌症进展3,4。此外, 临床研究表明 NK 细胞过继疗法是一种可能的治疗癌症的策略5,6,7,8,9。NK 细胞癌免疫治疗是最近被认为是一种治疗选择的固体肿瘤, 但存在的挑战, 由于免疫抑制剂的分泌因子和下调激活配体在微环境中的实体肿瘤10,11。转化生长因子β (TGF β) 已被认为起抑制作用的致癌作用, 但矛盾的癌细胞也产生 TGF-β1支持肿瘤的发展12,13,14,15. TGF β信号通过下调干扰素反应性和 CD16-mediated 干扰素-γ-γ (干扰素) 产生抑制 NK 细胞的细胞活性体外16,17, 18。
虽然 TGF β信号在肿瘤微环境中的破坏可能是消除癌症的一种可能的方法, 完全阻断 TGF β信号将导致自身免疫性疾病, 由于其抗炎作用, 证明了发展不良副作用包括全身炎症、心血管缺陷和自身免疫在小鼠模型中的19。因此, 了解 TGF β介导的免疫抑制的工作机制将导致确定一个治疗癌症的辅助性治疗靶。
为了阐明 nk 细胞发育所需的分子事件, 威廉斯et al.建立了一个用于将小鼠骨髓造血干细胞分化为 nk 细胞的体外系统20。该系统在很大程度上促进了 nk 细胞发育的机制研究, 包括对 nk 细胞的新祖的鉴定21。然而, 骨髓祖细胞应在系统中培养, 以支持 OP9 基质干细胞为饲养层20,21, 而这种异构的细胞群在很大程度上限制了基因中断工具的进一步应用(例如, siRNA 介导的基因沉默) 专门用于区分 NK 细胞。
在这里, 我们描述一个无馈线系统, 已经开发的进一步修改的在体外系统的威廉姆斯et al20。在我们的系统中, 不需要 OP9 基质饲养细胞, 而使用 OP9 条件培养基, 而不影响 NK 细胞的分化在体外, 这最近导致我们发现, TGF β能够促进癌症进展通过抑制 E4bp4-dependent NK 细胞在肿瘤微环境中的发育22。该系统成功地提供了一种无背景的方法来阐明在特定条件下 NK 细胞发育的分子机制 (例如, 高 TGF β, siRNA 介导的基因沉默, etc。体外。
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Protocol
获得和区分骨髓源性 nk 细胞的协议是基于以前发布的方法20,21,22。所有与老鼠有关的程序已获香港中文大学动物伦理实验委员会 (AEEC) 批准。
1. OP9 条件培养基的制备
- 培养小鼠基质细胞系 OP9 在α-记忆中含有 20% FBS, 100 U/毫升青霉素 G 和100µg/毫升链霉素, 在37° c 空气湿润大气/CO2 (95%: 5%)。
- 用例计数单元格, 然后种子 2 x 106 OP9 细胞到每75厘米2培养瓶与15毫升培养基。文化为 48 h。
- 当养殖达到80% 汇流时, 用10毫升 PBS 洗涤烧瓶, 并在每瓶中加入20毫升的普通α记忆培养基 (不含 FBS 和抗生素)。
- 收集 OP9 条件培养基从培养烧瓶在24小时, 清理细胞碎片与0.25 µm 砜 (PES) 过滤器和保留在4° c (使用在2星期之内)。
2. 分离小鼠骨髓细胞
- 安乐12周大的 C57BL/6J 鼠, pentobarbitone 过量 (100 毫克/千克, 腹腔注射)。确认死亡的缺乏呼吸, 然后收获股骨骨与手术刀切割的交界处之间的骨骼和删除剩余的肌肉与刀片的温柔划伤。
- 将骨头放在一个50毫升的离心管中, 其中含有冷冻无菌的α记忆体, 然后在生物安全柜中执行以下步骤。
- 丢弃α-记忆介质, 用70% 乙醇在三十年代冲洗骨头。
- 用 ice-cold 消毒的 PBS 两次清洗骨头, 清理剩下的乙醇。
- 将骨骼转移到含有5毫升 ice-cold PBS 的灰浆中, 用杵轻轻 fragmentize 骨头 (不要将其粉碎)。
- 通过旋转杵来轻轻搅动骨骼, 将骨髓细胞释放到 PBS 中。将含有骨髓细胞的 PBS 收集到新的50毫升离心管中。
- 重复步骤 2.6, 四次, 直到骨骼碎片变成纯白色的颜色。
- 离心管在 465 x g 为5分钟在4° c, 然后放弃上清。
- 重18毫升无菌蒸馏水, 并让它的立场三十年代, 以消除红血球。
- 添加2毫升的 ice-cold 10X PBS 停止反应, 然后过滤的混合物通过一个70µm 细胞过滤器, 以消除裂解红血细胞。
- 离心管在 465 x g 为5分钟在4° c。用20毫升的 ice-cold PBS 重颗粒。
- 第二次重复步骤2.11 来清洗细胞。
- 将细胞小球转移到100毫米的无菌培养皿中, 10 毫升的 OP9 条件培养基从步骤1.2 补充 20% FBS 和混合 0.5 ng/毫升小鼠 IL-7, 30 ng/毫升老鼠, 和 100 U/毫升鼠 flt3L。
- 孵育盘在37° c 与 5% CO2为 2 h. 将未连接的单元格转移到新的区域性容器中, 其密度为 5 x 105可生存单元/mL (计数单元格例与台盼蓝排除) 与步骤2.13 中的相同介质公式, 并在37° c 下孵育 5% CO2。
- 4天, 将培养条件转变为 OP9 条件培养基, 辅以 20% FBS 和2000小鼠 IL-2。
- 每3天刷新培养基;成熟的 NK 细胞可在7天获得, 并符合4节的规定。
3. siRNA 介导的分化 NK 细胞基因沉默
- 根据产品说明书将 siRNA 或无意义的控制 (NC) 与转染剂混合。
- 从0天起, 在任何时间点执行步骤3.1。
- 将 50 nM 的 siRNA 或 NC 混合物添加到步骤2.14 中的单元格。
- 重复步骤3.1 在每个中等茶点 (例如, 天 0, 4 和 7), 直到实验结束点。
4. 应用流式细胞仪分析 NK 细胞分化
- 在适当的时间点, 收集的悬浮分化细胞和洗涤与 ice-cold PBS。
- 根据产品说明书将细胞固定缓冲液固定。
- 用 ice-cold PBS 冲洗固定细胞, 然后在100µL 流式细胞术染色缓冲液中重 1 x 106细胞, 其中含有 Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 和 PE 共轭 anti-mouse CD244 抗体, 稀释率为1:100。
- 在室温下对样品进行2小时的染色。
- 用 PBS 的300µL 重染色样品, 然后获取 Cytobank 平台20 (http://cytobank.org/) 的数据并进行分析。
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Representative Results
根据所述协议得到了代表性的结果。在无饲养诱导分化系统下培养的总骨髓悬浮细胞11天;7天, 与0天 (图 1A) 的总细胞数相比, 增殖率显著增加。在系统 (图 1B) 中, 6 天发现了成熟的 NK 细胞, 细胞核胞质比和富含颗粒的细胞质形态。
为了阐明 TGF-β1/Smad3 信号在 NK 细胞分化中的调节作用, 骨髓细胞转染 siRNA 对 E4bp4 mrna (siE4bp4, 有效抑制 E4bp4 mrna 水平如图 2) 或废话控制在0天和天4在饲养细胞自由系统。在有或无 Smad3 抑制剂 SIS3 的系统中培养分化细胞6天。流分析检测到, E4bp4 的击倒主要抑制了 nk 细胞的成熟, 这表现为 CD244+ ve NKp46ve与 NC 转染控制相比, 未成熟 nk 细胞的减少, 而抑制 TGF-β1/Smad3 活化与 siE4BP4-transfected 组相比, 显著地拯救了 siRNA 介导的 NK 细胞成熟抑制 (图 3)。
图 1.从无馈线系统中提取骨髓源性 NK 细胞的图像.(A) 骨髓细胞在 NK 细胞分化过程中的生长曲线直到11天, 由细胞计数得到。(B) 成熟的 NK 细胞, 细胞核和细胞质比高, 颗粒丰富的细胞质形态在6天出现, 如箭头所示。放大倍数 200x, 缩放条形图50µm. 数据代表3独立实验的平均± SEM, **p < 0.01。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.siRNA 介导的基因沉默对 NK 细胞分化6天骨髓细胞的影响.分化细胞转染无废话控制 (NC) 或 siRNA 靶向小鼠 E4bp4 mRNA (siE4bp4) 在0天和4天。实时 PCR 显示, 与 NC 组相比, 6 天 si-E4bp4 治疗 NK 细胞的 E4bp4 mRNA 表达水平明显降低。数据代表平均± SEM 为3独立实验, **p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.沉默的 E4bp4 抑制小鼠骨髓源性 NK 细胞的分化, 以 TGF-β1/Smad3-dependent 的方式.(A) 流式细胞仪分析表明, 在6天, E4bp4 的击倒很大程度上减少了未成熟 (CD244+ ve NKp46) NK 细胞的生成, 而与无废话控制 (NC) 组相比, 使用无馈线系统体外, 可通过抑制 TGF-β/Smad3 活化与1µM Smad3 抑制剂 SIS3 进行显著的抢救。(B) 流量分析结果的量化, **p < 0.01 与 NC 相比;###p < 0.01 与 siE4BP4-transfected 组比较。给出了3独立实验的代表性数据。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图1。全分化细胞 NK 细胞标记表达流动分析的门控策略6天.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在目前的工作中, 我们描述了一种新的方法生产骨髓源性小鼠 NK 细胞体外。原始系统21、22中的单元格进纸器被 OP9 单元的条件介质成功替换, 这极大地提高了微分系统的稳定性。此外, 该系统还能为体外的成熟 nk 细胞产生高纯度的增殖和纯化, 并能促进人体疾病中 nk 细胞的机械研究和转化研究.
所描述的方法已被用于研究 TGF-β1信号在 NK 细胞抑制过程中的调控作用23。由于饲养细胞没有影响, siRNA 介导的基因击倒以及抑制剂介导抑制的效率得到很大改善。没有饲养细胞 OP9 允许我们清楚地证明 Smad3 在 E4BP4-mediated NK 细胞发育中的生物学功能, 通过显示靶基因的击倒或抑制在体外23。
更重要的是, 该系统可进一步用于生产大量基因修饰的小鼠 NK 细胞, 用于体内测定。例如, 我们从单个小鼠的骨髓细胞中生成了至少 1 x 108成熟的 nk 细胞, 并将特定基因击倒的 nk 细胞注入肿瘤的 NOD/免疫缺陷小鼠模型, 以证明杀死癌症的效果在体内23。事实上, 在该系统中, 可以对 NK 细胞进行其他修饰, 如病毒介导的基因过度表达、细胞染色、等。
然而, 应该指出的是, 在9天 (未显示的数据) 中, 可以从系统中产生最多70% 的成熟 NK 细胞, 这与威廉斯et al所显示的具有 OP9 基质的培养体系的结果相似。21为了克服这一限制, 混合 nk 细胞可以通过流动分拣机以及商业 nk 细胞隔离套件进一步纯化, 以隔离所需的种群。
结论建立了一种新的小鼠骨髓细胞 NK 细胞的鉴别方法。本系统可为研究人类疾病的免疫功能提供一种获得高纯度和数量成熟 NK 细胞的方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到香港研究资助局 (GRF 468513、CUHK3/CRF/12R) 及香港创新科技基金 (ITS/227/15、其 InP/164/16、ITS-InP/242/16)、中大 (2016.035) 及香港学者的直接资助。程序.
/设计和监督所有的实验, 并为手稿的编写做出贡献。康普茶进行了实验, 分析了数据并为稿件的编写做出了贡献。t。彼莱, 俱乐部, M.W., 和 G.-/收集动物标本, 并参与动物实验。右侧和 K-f.t 为手稿的编写做出了贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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