En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å masseprodusere gen-stanse murine NK celler ved hjelp av en mater-fri differensiering system for mekanistisk studie i vitro og i vivo.
Abstract
Naturlig morderen celler (NK) tilhører det medfødte immunsystemet og er en første linje anti-kreft immunforsvar forsvar; men de er undertrykt i svulst microenvironment og den underliggende mekanismen er fortsatt hovedsakelig ubekjent. Mangelen på en konsistent og pålitelig kilde av NK celler begrenser forskning fremdriften av NK celle immunitet. Her rapporterer vi et i vitro system som kan gi høy kvalitet og kvantitet av bein margtransplantasjon-avledet murine NK celler under en mater-fri tilstand. Enda viktigere, viser vi også at siRNA-mediert genet stanse vellykket hemmer E4bp4-avhengige NK celle modning ved hjelp av dette systemet. Dermed er denne romanen i vitro NK cellen differensiering systemet en biomateriale løsning for immunitet forskning.
Introduction
Kreft progresjon er i stor grad avhengig av svulst microenvironment1,2, inkludert vert-avledet immunocytes, f.eks, NK celler. Flere studier har vist at intratumoral NK celler er negativt korrelert med tumor progresjon3,4. I tillegg viste kliniske studier at NK cellen adoptivforeldre terapi er en mulig strategi for cancer5,6,7,8,9. NK cellebasert kreft immunterapi ble nylig foreslått som et terapeutisk alternativ for solide svulster, men utfordringene finnes utskillelsen av suppressive cytokiner og downregulation å aktivere ligander i microenvironment av solide svulster 10,11. Omforming vekst faktor-β (TGF-β) har blitt foreslått for å spille en undertrykkende rolle i kreft, men paradoksalt kreftceller også produsere TGF-β1 for å støtte de tumor utvikling12,13,14 , 15. TGF-β signalering kan undertrykke cytolytic aktiviteten av NK celler via ned-regulere interferon respons og CD16-mediert interferon-gamma (IFN-γ) produksjon i vitro16,17, 18.
Selv om avbrudd av TGF-β signalering i svulst microenvironment kan være en mulig måte for å eliminere kreft, vil helt blokkere TGF-β signalering føre autoimmune sykdommer på grunn av sin anti-inflammatorisk funksjon, som dokumentert av utviklingen av uønskede bivirkninger, inkludert systemisk betennelse, modeller hjerte feil og autoimmunitet musen19. Dermed vil forstå arbeidsgruppen mekanisme av TGF-β-mediert immunsuppresjon føre til identifikasjon av en tilgjengelig terapeutisk mål for behandling av kreft.
For å belyse molekylære hendelsene nødvendig for NK celle utvikling, etablert Williams et al. et i vitro system for skille murine benmarg blodkreft stamceller i NK celler20. Dette systemet muliggjør hovedsakelig mekanistisk studiet av NK celle utvikling, inkludert identifikasjon av romanen progenitors av NK celler21. Men det benmarg progenitors bør kultivert i systemet med støtte OP9 stromal celler som mater lag20,21, og denne heterogene celle befolkningen stort sett begrenser ytterligere anvendelsen av gen-forstyrre verktøy (f.ekssiRNA-mediert genet stanse) spesielt gjelder for unike NK-cellene.
Her beskriver vi en mater-fritt system som er utviklet ved ytterligere å endre systemet i vitro Williams et al20. I systemet vårt, OP9 stromal mater cellene er ikke nødvendig, og i stedet OP9 betinget mediet brukes uten å påvirke differensiering av NK celler i vitro, og dette sist fører oss til å avdekke det TGF-β er kjøpedyktig fremme kreft progresjon via undertrykke E4bp4-avhengige NK celle utvikling i svulst microenvironment22. Dette nye systemet hell gir bakgrunn-fri metode for Klargjørende molekylær mekanismen av NK celle utvikling under bestemte forhold (f.ekshøy TGF-β1, siRNA-mediert genet stanse, etc.) i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den nåværende arbeidet, har vi beskrev en roman metode for å produsere Ben margtransplantasjon-avledet murine NK celler i vitro. Cellen materen i det opprinnelige system21,22 er erstattet av betinget mediet av OP9 celler, som i stor grad økte stabiliteten av differensiering. I tillegg systemet kan produsere høy mengde og renhet av modne NK celler i vitro samt i vivo analyser, som kan lette den mekanistiske studie samt translasjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av forskning tilskudd Council av Hongkong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) og innovasjon og teknologi Fund av Hong Kong (ITS/227/15, ITS inngangen/164/16, ITS-inngangen/242/16), direkte stipend for forskning-CUHK (2016.035) og Hong Kong Scholar Programmet.
H.-Y.L. designet og overvåket alle eksperimenter og bidratt til manuskriptet forberedelse. PM-K.T. utført eksperimenter, analyserte data og bidratt til manuskriptet forberedelse. PC-T. T., J.Y.-FC, JS-C., H., Q.-M.W., G.-Y.L. samlet dyr prøver og deltok i dyreforsøk. JS, X.-R.H., og K.-F.T. bidro til manuskriptet forberedelse.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
