Summary
Hier presenteren we een protocol om de massa van gen-zwijgen lymfkliertest NK cellen met behulp van een systeem van differentiatie feeder-gratis voor mechanistisch onderzoek in vitro en in vivo.
Abstract
Natural killer (NK) cellen behoren tot het aangeboren immuunsysteem en een eerstelijns anti-kanker immuunsysteem verdediging; echter, zij worden onderdrukt in de communicatie van de tumor en het onderliggende mechanisme is nog grotendeels onbekend. De voortgang van het onderzoek van NK-cel-immuniteit wordt beperkt door het ontbreken van een consistente en betrouwbare bron van NK-cellen. Wij rapporteren hier een in vitro -systeem dat hoge kwaliteit en kwantiteit van beenmerg-afgeleide lymfkliertest NK cellen onder een feeder-free-conditie bieden kan. Wat nog belangrijker is, wij ook laten zien dat met succes de rijping van de cel E4bp4-afhankelijke NK siRNA-gemedieerde gene silencing remt met behulp van dit systeem. Deze roman in vitro NK cel differentiatie systeem is dus een biomaterial oplossing voor onderzoek van de immuniteit.
Introduction
Progressie van kanker is grotendeels afhankelijk van de tumor communicatie1,2, met inbegrip van gastheer afkomstige immunocytes, bijvoorbeeld, NK-cellen. Verschillende studies aangetoond dat intratumoral NK-cellen zijn negatief gecorreleerd met tumor progressie3,4. Bovendien, klinische studies is gebleken dat adoptief celtherapie NK een mogelijke strategie voor kanker5,6,7,8,9. NK cel-gebaseerde kanker immunotherapie onlangs voorgesteld als een therapeutische optie voor solide tumoren, maar uitdagingen bestaan als gevolg van de afscheiding van immunosuppressieve cytokinen en Downregulatie van liganden in de communicatie van stevige tumors activeren 10,11. Transformeren groeifactor-β (TGF-β) is gesuggereerd een onderdrukkende rol te spelen in carcinogenese, maar paradoxaal genoeg kankercellen produceren ook TGF-β1 ter ondersteuning van de tumor ontwikkeling12,13,14 , 15. de cytolytische activiteit van NK cellen via de down-regulering interferon responsiviteit en CD16-gemedieerde interferon-gamma (IFN-γ) productie in vitro16,17, TGF-β signalering kunt onderdrukken 18.
Hoewel verstoring van TGF-β signalering in de communicatie van de tumor kan een mogelijke manier voor het elimineren van kankers, volledig blokkeren TGF-β signalering zal leiden tot auto-immune ziekten als gevolg van zijn anti-inflammatoire functie, zoals blijkt uit de ontwikkeling van negatieve bijwerkingen, met inbegrip van systemische ontstekingen, modellen cardiovasculaire afwijkingen en autoimmuniteit in muis19. Dus, inzicht in het werkingsmechanisme bij immuunsuppressie TGF-β-gemedieerde zal leiden tot de identificatie van een toegankelijk therapeutisch doel voor de behandeling van kanker.
Om het ophelderen van de moleculaire gebeurtenissen die nodig zijn voor cel ontwikkeling van NK, gevestigde Williams et al. een in vitro -systeem voor20differentiëren lymfkliertest beenmerg hematopoietische stamcellen in NK cellen. Dit systeem vergemakkelijkt grotendeels het mechanistisch onderzoek naar NK-cel ontwikkeling, met inbegrip van de identificatie van nieuwe progenitorcellen van NK cellen21. Echter het beenmerg progenitoren moeten worden gekweekt in het systeem met ondersteunende OP9 stromale cellen als een feeder laag20,21, en deze heterogene celpopulatie grotendeels beperkt de verdere toepassing van gene disrupting tools (bijvoorbeeld, siRNA-gemedieerde gene silencing) specifiek toegepast op de onderscheidende NK-cellen.
Hier beschrijven we een feeder-vrij systeem dat is ontwikkeld door verdere aanpassing van de in vitro -systeem van Williams et al.20. In ons systeem, de OP9 feeder stromale cellen zijn niet vereist, en in plaats daarvan OP9 voorwaardelijke voedingsbodem wordt gebruikt zonder de differentiatie van NK cellen in vitroen dit onlangs leiden ons om te ontdekken welk TGF-β vermag bevordering van progressie van kanker via E4bp4-afhankelijke NK cel ontwikkeling in de tumor communicatie22te onderdrukken. Dit nieuwe systeem biedt met succes een achtergrond-gratis methode voor het ophelderen van het moleculaire mechanisme van NK-cel ontwikkeling onder bepaalde voorwaarden (bijvoorbeeldhoge TGF-β1, siRNA-gemedieerde gene silencing, enz.) in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is voor het verkrijgen en differentiatie van de NK beenmerg-afgeleide cellen (BM-NK) gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden20,21,22. Alle procedures met muizen zijn goedgekeurd door het dier Experimental ethische Commissie (AEEC) aan de Chinese Universiteit van Hongkong.
1. bereiding van OP9 voorwaardelijke Medium
- Cultuur van de lymfkliertest stroma cellijn OP9 in alpha-MEM met 20% FBS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine, bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer van lucht/CO2 (95%: 5%).
- De cellen met een hemocytometer, dan zaad 2 x 106 OP9 cellen aan elke maatkolf van 75 cm2 cultuur met 15 mL medium tellen. Cultuur gedurende 48 uur.
- Wanneer de cultuur 80% samenvloeiing bereikt, wassen van de kolf met 10 mL PBS en Voeg 20 mL van gewone alpha-MEM-medium (zonder FBS en antibiotica) per fles.
- Het OP9 voorwaarde medium ophalen in de erlenmeyer van de cultuur op 24 h, cel puin ruimen met 0,25 µm polyethersulfon (PES) filter en bewaren bij 4 ° C (gebruik binnen 2 weken).
2. isolatie van beenmergcellen van de muis
- Een 12-week-oude C57BL/6J muis met een overdosis van de pentobarbitone (100 mg/kg, intraperitoneale injectie) euthanaseren. Bevestigen van dood door het ontbreken van ademhaling, dan oogst de botten van het dijbeen met een chirurgisch mes snijden bij de kruisingen tussen botten en verwijder de resterende spieren met het mes door het zachte krabben.
- Plaats de botten in een 50 mL centrifugebuis met gekoeld steriel alpha-MEM en voer de volgende stappen uit in een kabinet bioveiligheid.
- Het alpha-MEM-medium verwijderen en spoel de botten met 70% ethanol voor 30 s.
- Wassen van de botten met ijskoude steriel PBS tweemaal aan het opruimen van de resterende ethanol.
- Breng de botten in een mortier met 5 mL ijskoud PBS, en zachtjes fragmentize de botten met een stamper (doen niet verpulveren ze).
- De botten zachtjes doorroeren door zwenken van de stamper om de beenmergcellen in de PBS vrij te geven. De PBS met beenmergcellen in een nieuwe 50 mL centrifugebuis verzamelen.
- Herhaal stap 2.6 voor vier keer totdat de botfragmenten effen wit van kleur geworden.
- Centrifugeer de buis bij 465 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de pellet met 18 mL steriel gedistilleerd water en laat het staan voor 30 s tot het verwijderen van rode bloedcellen.
- Voeg toe 2 mL ijskoud 10 X PBS om te stoppen met de reactie, filtert vervolgens het mengsel door een zeef cel 70 µm te verwijderen van de lysed rode bloedcellen.
- Centrifugeer de buis bij 465 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 20 mL ijskoud PBS.
- De cellen door stap te herhalen 2.11 een tweede keer wassen.
- Breng de pellet cel in een 100-mm steriele petrischaal met 10 mL van de voorwaardelijke medium OP9 uit stap 1.2 aangevuld met 20% FBS en een mengsel van 0,5 ng/mL lymfkliertest IL-7, 30 ng/mL muis SCF en 100 U/mL lymfkliertest flt3L.
- Incubeer de schotel bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 h. overdracht de niet-vastgemaakte cellen in een nieuwe verpakking van de cultuur bij een dichtheid van 5 x 105 levensvatbare cellen/mL (aantal cellen door hemocytometer met trypan-blauw-uitsluiting) met dezelfde middellange formule als in stap 2.13 , en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
- Op dag 4, wijzigen de toestand van de cultuur op OP9 voorwaardelijke normaal aangevuld met 20% FBS en 2.000 U/mL lymfkliertest IL-2.
- Vernieuwen van het kweekmedium elke 3 dagen; volwassen NK-cellen kunnen worden verkregen door dag 7 en gekwalificeerd als in punt 4.
3. siRNA-gemedieerde Gene Silencing van NK-cellen differentiëren
- Meng het siRNA of onzin besturingselement (NC) met een agent van de transfectie volgens de producthandleiding.
- Voer stap 3.1 op elk punt van de tijd sinds dag 0.
- Toevoegen van de 50 nM van siRNA of NC mengsel aan de cellen van stap 2.14.
- Herhaal stap 3.1 op elke middelgrote verfrissing (bijvoorbeelddag 0, 4 en 7) tot de experimentele eindpunt.
4. analyse van NK celdifferentiatie gebruikt Stroom Cytometry
- Op een passend tijdstip, de opschorting van de differentiatie van cellen verzamelen en wassen met ijskoude PBS.
- Het herstellen van de cellen met de fixatie van de cel buffer volgens de producthandleiding.
- Wassen van de vaste cellen met ijskoude PBS en vervolgens resuspendeer 1 x 106 cellen in 100 µL van Stroom Cytometry kleuring Buffer met Cy3-geconjugeerde anti-muis NKp46 en PE-geconjugeerde anti-muis CD244 antilichamen in een verdunningsverhouding van 1:100.
- Vlek het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Resuspendeer de gebeitst monsters met 300 µL van PBS, dan FACS gegevens verwerven en analyseren met Cytobank platform20 (http://cytobank.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden verkregen volgens de beschreven protocol. Totale opschorting beenmergcellen werden gekweekt onder de feeder-vrije differentiatie systeem voor 11 dagen; aanzienlijke toename van de proliferatie tarief werd waargenomen door dag 7 vergeleken met het aantal totaal aantal cellen op dag 0(Figuur 1). Volwassen NK-cellen met hoge nucleaire aan cytoplasmatische ratio en morfologie van de submodule-rijke cytoplasma werden gevonden door dag 6 in het systeem (Figuur 1B).
Om het verhelderen van het regulerende effect van TGF-β1/Smad3 signalering in NK celdifferentiatie, beenmerg cellen werden transfected met siRNA tegen E4bp4 mRNA (siE4bp4, die effectief E4bp4 mRNA niveau onderdrukt zoals afgebeeld in Figuur 2) of onzin controle op dag 0 en dag 4 in de feeder-cel gratis system. De onderscheidende cellen werden gekweekt in het systeem met of zonder Smad3 inhibitor SIS3 voor 6 dagen. Flow analyse ontdekt dat knockdown van E4bp4 grotendeels onderdrukt de rijping van NK-cel, zoals blijkt uit de vermindering in CD244+ ve NKp46- ve onvolwassen NK cellen in vergelijking met NC-transfected control, overwegende dat remming van TGF-β1/Smad3 activering aanzienlijk redt de siRNA-gemedieerde onderdrukking van NK-cel rijping in vergelijking met de groep siE4BP4-transfected (Figuur 3).
Figuur 1 . Foto van NK beenmerg-afgeleide cellen uit de feeder-vrij systeem. (A) groei curve van het beenmerg ondergaan NK celdifferentiatie in het systeem tot dag 11 cellen, verkregen door het tellen van de cel. ()B) volwassen NK-cellen met hoge nucleaire aan cytoplasmatische ratio en morfologie van de submodule-rijke cytoplasma verschijnen per dag 6, zoals aangegeven door de pijlen. Vergroting van 200 x, schaal bar 50 µm. gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM voor 3 onafhankelijke experimenten, ***p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Effect van siRNA-gemedieerde gene zwijgen op het beenmerg cellen ondergaan NK celdifferentiatie op dag 6. De onderscheidende cellen werden transfected met onzin controle (NC) of siRNA lymfkliertest E4bp4 mRNA (siE4bp4) te richten op dag 0 en dag 4. PCR in real time toont dat mRNA uitdrukking E4bp4 was aanzienlijk verminderd in si-E4bp4 behandeld NK cellen op dag 6 vergeleken met de NC-groep. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM voor 3 onafhankelijke experimenten, **p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Differentiatie van lymfkliertest beenmerg-afgeleide NK cellen in een TGF-β1/Smad3-afhankelijke manier monddood maken van E4bp4 remt. (A) stroom cytometry analyse toont aan dat knockdown van E4bp4 grotendeels vermindert de productie van onrijpe (CD244+ ve NKp46-ve) NK-cellen op dag 6 vergeleken met de onzin-controlegroep (NC) met behulp van de feeder-vrij systeem in vitro , die aanzienlijk kunnen worden gered door het onderdrukken van de activering van de TGF-β1/Smad3 met 1 µM van Smad3-remmer SIS3. (B) kwantificering van de resultaten van de analyse van de stroom, ***p < 0.01 vergeleken met NC; ### p < 0.01 vergeleken met siE4BP4-transfected groep. Representatieve gegevens van 3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1. Gating strategie voor flow analyse van NK-cel marker expressie in het totale onderscheiden op dag 6 cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige werk, hebben we een nieuwe methode voor de productie van beenmerg-afgeleide lymfkliertest NK cellen in vitrobeschreven. De cel feeder in de oorspronkelijke systeem21,22 is met succes vervangen door de voorwaardelijke medium OP9 cellen, die grotendeels de stabiliteit van het systeem van differentiatie vergroot. Bovendien, het systeem kan produceren hoge hoeveelheid en zuiverheid van volwassen NK cellen voor in vitro als in vivo tests, die het mechanistisch onderzoek evenals translationeel onderzoek van NK cellen in ziekten bij de mens vergemakkelijken kunnen.
De beschreven methode is gebruikt voor het onderzoeken van de regulerende rol van TGF-β1 signalering in NK-cel onderdrukking tijdens kanker ontwikkeling23. Als er was geen invloed van de feeder cellen, de efficiëntie van siRNA-gemedieerde gene knockdown evenals de Inhibitor van de omwenteling-gemedieerde remming zijn grotendeels verbeterd. Het ontbreken van de feeder cellen OP9 laat ons toe om duidelijk de biologische functie van Smad3 in de E4BP4-gemedieerde NK cel ontwikkeling, door het knockdown of remming van doel genen in vitro23te tonen.
Wat nog belangrijker is, kan dit systeem verder worden gebruikt voor de productie van een grote hoeveelheid genetisch gemodificeerde lymfkliertest NK-cellen voor in vivo tests. Bijvoorbeeld, we hebben minstens 1 x 108 volwassen NK cellen uit het beenmergcellen van een enkele muis geproduceerd door dit systeem, en de NK-cellen met knockdown van een specifiek gen werden toegediend in tumor-dragende knik/SCID muismodel om aan te tonen het verschil in kanker-doden effecten in vivo23. Inderdaad, andere wijzigingen kunnen worden gedaan op de NK-cellen in dit systeem, zoals virale-gemedieerde gene overexpressie, cel kleuring, enz.
Echter moet worden opgemerkt dat een maximaal 70% van de volwassen NK-cellen kan worden geproduceerd uit het systeem op dag 9 (gegevens niet worden weergegeven), die is vergelijkbaar met het resultaat van de gekweekte systeem met OP9 stromale getoond door Williams et al.. 21 om te overwinnen deze beperking, de gemengde NK-cellen kunnen verder gezuiverd worden met een stroom sorteren van de machine, alsmede commerciële NK cel isolatie kits om te isoleren van de gewenste bevolking.
Kortom, is een nieuwe methode voor het differentiëren van NK-cellen uit lymfkliertest beenmergcellen ontwikkeld. Dit nieuwe systeem kan bieden een optie voor het verkrijgen van hoge zuiverheid en de hoeveelheid volwassen NK-cellen voor de studie van de immuniteit in ziekten bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Research Grants Raad van Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) en de innovatie en technologie Fonds van Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), directe subsidie voor onderzoek-CUHK (2016.035) en Hong Kong geleerde Programma.
H.-Y.L. ontworpen en begeleid alle experimenten en bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript. P.M.-R.C. experimenten uitgevoerd, geanalyseerd gegevens en bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript. P.C.-T. T., J.Y.-FC, J.S.-C., H., Q.-M.W., en G.-Y.L. verzamelde dierlijke monsters en deelgenomen aan dierproeven. J.S., X.-R.H., en K.-F.T. bijgedragen tot de voorbereiding van de manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
