Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture
Summary
Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.
Abstract
La possibilité d’étudier la genèse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) durant le développement embryonnaire a été limitée par la rareté des précurseurs de l’HSC dans l’embryon précoce et le manque de tests qui fonctionnellement identifier le potentiel à long terme de la prise de greffe multilignée de précurseurs HSC putatifs individuels. Nous décrivons ici la méthodologie permettant l’isolement et la caractérisation des précurseurs d’HSC fonctionnellement validés au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, nous utilisons indice tri pour cataloguer le paramètre phénotypique précis de chaque cellule individuellement trié, en utilisant une combinaison de marqueurs phénotypiques d’enrichir des précurseurs de l’HSC avec des marqueurs supplémentaires pour l’analyse expérimentale. Deuxièmement, chaque cellule index-triées est co cultivée avec le stroma vasculaire niche de la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA), qui prend en charge la maturation des précurseurs des HSC non-faire une exception HSC fonctionnelle avec greffe multilignée, à long terme potentiel dans essais de transplantation. Cette méthodologie permet la corrélation des propriétés phénotypiques des précurseurs hemogenic clonale avec leur potentiel fonctionnel de greffe ou d’autres propriétés telles que profil transcriptionnel, fournissant un moyen pour l’analyse détaillée des précurseurs de l’HSC développement à l’échelle de la cellule unique.
Introduction
Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement1. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition2. Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à une transplantation en conditionné bénéficiaires adultes, ne sont pas détectées jusqu’après jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez l’embryon de souris, à très basse fréquence3 . Au cours de leur développement, précurseurs des HSC (pre-HSC) découlant de l’endothélium hemogenic doivent être soumis à maturation avant d’acquérir les propriétés de HSC adulte qui permettent une prise de greffe efficace en transplantation essais4,5 , 6. obscurcissant l’étude d’origine rare de HSC, une multitude de progéniteurs hématopoïétiques avec érythroïdes, potentiel myéloïde et lymphoïde sont déjà détectés avant l’émergence du HSC de pre-HSC7,8. Distinguer pré-HSC des autres progéniteurs hématopoïétiques requiert donc des méthodes pour isoler par clonage des cellules et de leur fournir les signaux suffisants pour leur maturation à HSC, de détecter leurs propriétés de greffe lors d’essais de transplantation.
Plusieurs approches ont été décrits qui permettait de détecter des pré-HSC de maturation en vivo ou ex vivo de HSC. Ex vivo méthodes ont compté sur la culture des tissus embryonnaires, telles que la région de l’AGM, où le premier HSC sont décelées dans développement9. S’appuyant sur ces méthodes, protocoles qui incorporent la dissociation, tri et re-agrégation des tissus AGM ont permis la caractérisation des populations triées contenant des précurseurs de l’HSC au cours du développement de E9.5 à E11.5 dans le para-aortique splanchnopleura (P-Sp) / AGM régions4,5,10; Cependant, ces approches ne sont pas disposés à haut débit analyse des précurseurs au niveau de la cellule unique requis pour l’analyse clonale. De même, in vivo la maturation par greffe sur des souris nouveau-nées, où le microenvironnement est censé mieux convenir à l’appui des premiers stades des précurseurs de l’HSC, a également permis des études de populations triées du sac vitellin et AGM / P-Sp (P-Sp est la région de précurseur à l’AGA) présentant des caractéristiques de pre-HSC, mais ces méthodes aussi ne parviennent pas à fournir une plate-forme robuste simple cellule analyse11,12.
Études de Mustafa et coll. ont démontré que cette stroma Akt-lancée de cellules endothéliales (EC) peut fournir un substrat de niche pour le soutien des adultes HSC autorenouvellement in vitro13,14,,15. Nous avons récemment déterminé que ce Akt-activé, dérivé de la région de l’Assemblée générale annuelle (AGM-EC) prévoit une niche adapté en vitro la maturation des précurseurs hemogenic, isolé dès E9 dans le développement, à faire une exception adulte HSC, ainsi que la suite l’auto-renouvellement de généré HSC16. Étant donné que ce système utilise une simple culture CO 2 dimensions, il est facilement adaptable pour analyse clonale du potentiel HSC des précurseurs hemogenic isolés individuellement.
Nous avons récemment rapporté une approche pour analyser le potentiel HSC des précurseurs hemogenic clonale en combinant indice tri des précurseurs chimiques individuels hemogenic embryons murins avec co-culture AGM-EC et les analyses fonctionnelles en transplantation des analyses de17. Index de tri est un mode de fluorescence-lancée de cellules triant (FACS) qui enregistre (index) tous les paramètres phénotypiques (c’est-à-direavant dispersion (FSC-A), côté scatter (SSC-A), fluorescence paramètres) de chaque cellule individuellement trié tel que ces caractéristiques peuvent être rétrospectivement corrélés ultérieures analyse fonctionnelle après tri. FACS logiciel enregistre les deux informations phénotypiques pour chaque cellule et la position/puits de la plaque à 96 puits dans lequel il a été placé. Cette technique a déjà été élégamment utilisée pour identifier l’hétérogénéité adulte HSC, déterminer les paramètres phénotypiques encore enrichissent pour le sous-ensemble après à long terme de HSC et corrèlent phénotypiques paramètres de HSC avec transcription Propriétés sur le single cell niveau18,19. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche qui permet l’identification des paramètres phénotypiques uniques et les contributions de la lignée de pre-HSC durant les premiers stades du développement embryonnaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude de la genèse de la HSC durant le développement embryonnaire nécessite des moyens pour détecter les potentiels des précurseurs hemogenic manque encore la compétence pour fournir à long terme multilignée reconstitution hématopoïétique chez les receveurs adultes transplantés HSC. Dans ce protocole, nous présentons un test clonal des hemogenic embryonnaires précurseurs par co-culture stromal sur niche vasculaire ECs de l’AGA, qui favorise la maturation des précurseurs des HSC, avec analyse fonctio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Andrew Berger, Stacey Dozono et Brian Raden INSEREE dans le Fred Hutchinson Flow Cytometry d’assistance avec FACS. Ce travail a été soutenu par l’instituts nationaux de santé NHLBI UO1 grant #HL100395, auxiliaires Collaborative Grant #HL099997 et NIDDK accordent #RC2DK114777. Brandon Hadland est supporté par l’Alex Lemonade Stand Fondation et Hyundai Hope sur roues Foundation.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
References
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