Summary

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

Published: May 08, 2018
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Summary

Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.

Abstract

La possibilité d’étudier la genèse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) durant le développement embryonnaire a été limitée par la rareté des précurseurs de l’HSC dans l’embryon précoce et le manque de tests qui fonctionnellement identifier le potentiel à long terme de la prise de greffe multilignée de précurseurs HSC putatifs individuels. Nous décrivons ici la méthodologie permettant l’isolement et la caractérisation des précurseurs d’HSC fonctionnellement validés au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, nous utilisons indice tri pour cataloguer le paramètre phénotypique précis de chaque cellule individuellement trié, en utilisant une combinaison de marqueurs phénotypiques d’enrichir des précurseurs de l’HSC avec des marqueurs supplémentaires pour l’analyse expérimentale. Deuxièmement, chaque cellule index-triées est co cultivée avec le stroma vasculaire niche de la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA), qui prend en charge la maturation des précurseurs des HSC non-faire une exception HSC fonctionnelle avec greffe multilignée, à long terme potentiel dans essais de transplantation. Cette méthodologie permet la corrélation des propriétés phénotypiques des précurseurs hemogenic clonale avec leur potentiel fonctionnel de greffe ou d’autres propriétés telles que profil transcriptionnel, fournissant un moyen pour l’analyse détaillée des précurseurs de l’HSC développement à l’échelle de la cellule unique.

Introduction

Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement1. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition2. Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à une transplantation en conditionné bénéficiaires adultes, ne sont pas détectées jusqu’après jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez l’embryon de souris, à très basse fréquence3 . Au cours de leur développement, précurseurs des HSC (pre-HSC) découlant de l’endothélium hemogenic doivent être soumis à maturation avant d’acquérir les propriétés de HSC adulte qui permettent une prise de greffe efficace en transplantation essais4,5 , 6. obscurcissant l’étude d’origine rare de HSC, une multitude de progéniteurs hématopoïétiques avec érythroïdes, potentiel myéloïde et lymphoïde sont déjà détectés avant l’émergence du HSC de pre-HSC7,8. Distinguer pré-HSC des autres progéniteurs hématopoïétiques requiert donc des méthodes pour isoler par clonage des cellules et de leur fournir les signaux suffisants pour leur maturation à HSC, de détecter leurs propriétés de greffe lors d’essais de transplantation.

Plusieurs approches ont été décrits qui permettait de détecter des pré-HSC de maturation en vivo ou ex vivo de HSC. Ex vivo méthodes ont compté sur la culture des tissus embryonnaires, telles que la région de l’AGM, où le premier HSC sont décelées dans développement9. S’appuyant sur ces méthodes, protocoles qui incorporent la dissociation, tri et re-agrégation des tissus AGM ont permis la caractérisation des populations triées contenant des précurseurs de l’HSC au cours du développement de E9.5 à E11.5 dans le para-aortique splanchnopleura (P-Sp) / AGM régions4,5,10; Cependant, ces approches ne sont pas disposés à haut débit analyse des précurseurs au niveau de la cellule unique requis pour l’analyse clonale. De même, in vivo la maturation par greffe sur des souris nouveau-nées, où le microenvironnement est censé mieux convenir à l’appui des premiers stades des précurseurs de l’HSC, a également permis des études de populations triées du sac vitellin et AGM / P-Sp (P-Sp est la région de précurseur à l’AGA) présentant des caractéristiques de pre-HSC, mais ces méthodes aussi ne parviennent pas à fournir une plate-forme robuste simple cellule analyse11,12.

Études de Mustafa et coll. ont démontré que cette stroma Akt-lancée de cellules endothéliales (EC) peut fournir un substrat de niche pour le soutien des adultes HSC autorenouvellement in vitro13,14,,15. Nous avons récemment déterminé que ce Akt-activé, dérivé de la région de l’Assemblée générale annuelle (AGM-EC) prévoit une niche adapté en vitro la maturation des précurseurs hemogenic, isolé dès E9 dans le développement, à faire une exception adulte HSC, ainsi que la suite l’auto-renouvellement de généré HSC16. Étant donné que ce système utilise une simple culture CO 2 dimensions, il est facilement adaptable pour analyse clonale du potentiel HSC des précurseurs hemogenic isolés individuellement.

Nous avons récemment rapporté une approche pour analyser le potentiel HSC des précurseurs hemogenic clonale en combinant indice tri des précurseurs chimiques individuels hemogenic embryons murins avec co-culture AGM-EC et les analyses fonctionnelles en transplantation des analyses de17. Index de tri est un mode de fluorescence-lancée de cellules triant (FACS) qui enregistre (index) tous les paramètres phénotypiques (c’est-à-direavant dispersion (FSC-A), côté scatter (SSC-A), fluorescence paramètres) de chaque cellule individuellement trié tel que ces caractéristiques peuvent être rétrospectivement corrélés ultérieures analyse fonctionnelle après tri. FACS logiciel enregistre les deux informations phénotypiques pour chaque cellule et la position/puits de la plaque à 96 puits dans lequel il a été placé. Cette technique a déjà été élégamment utilisée pour identifier l’hétérogénéité adulte HSC, déterminer les paramètres phénotypiques encore enrichissent pour le sous-ensemble après à long terme de HSC et corrèlent phénotypiques paramètres de HSC avec transcription Propriétés sur le single cell niveau18,19. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche qui permet l’identification des paramètres phénotypiques uniques et les contributions de la lignée de pre-HSC durant les premiers stades du développement embryonnaire.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Fred Hutchinson Cancer Research Center. 1. préparation des AGM-EC monocouches de co-culture 24 h avant la dissection de l’AGA et trier, faire AGA-ce milieux de culture et filtre stériliser. Ajouter 0,1 % de gélatine dans l’eau (100 µL/puits) dans chaque puits d’une plaque 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. aspirer les…

Representative Results

Figure 1 a montre une représentation schématique du plan expérimental. Une fois que les tissus P-Sp/AGM sont disséqués, mis en commun et dissociées dans collagènase, elles sont tachées avec anticorps anti-VE-cadhérine et EPCR pour le tri des index. Pre-HSC sont plus riches en cellules triées à la VE-cadhérine+EPCRélevé (Figure 1 b). Autres anticorps conjugués fluorochrome peuvent être incluse…

Discussion

L’étude de la genèse de la HSC durant le développement embryonnaire nécessite des moyens pour détecter les potentiels des précurseurs hemogenic manque encore la compétence pour fournir à long terme multilignée reconstitution hématopoïétique chez les receveurs adultes transplantés HSC. Dans ce protocole, nous présentons un test clonal des hemogenic embryonnaires précurseurs par co-culture stromal sur niche vasculaire ECs de l’AGA, qui favorise la maturation des précurseurs des HSC, avec analyse fonctio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Andrew Berger, Stacey Dozono et Brian Raden INSEREE dans le Fred Hutchinson Flow Cytometry d’assistance avec FACS. Ce travail a été soutenu par l’instituts nationaux de santé NHLBI UO1 grant #HL100395, auxiliaires Collaborative Grant #HL099997 et NIDDK accordent #RC2DK114777. Brandon Hadland est supporté par l’Alex Lemonade Stand Fondation et Hyundai Hope sur roues Foundation.

Materials

AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express Gibco 12605-028 Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water StemCell Technologies 7903 Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates Corning 3599 Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles Fisher Scientific 9741202 Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 12440-053 400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH30088.03 100 mls
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 5 mls
Heparin Sigma H3149 50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM) StemCell Technologies 7100 5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS) Alfa Aesar J64516 (BT-203) Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%) StemCell Technologies 7902 Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe BD Biosciences 309657 Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter Millipore SLGP033RS Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap Corning 352235 Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) Millipore 268298 Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) BD Biosciences 553141 Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 eBioscience 25-1441-82 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4301-81 Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 eBioscience 46-2012-80 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 eBioscience 46-4031-80 Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE BD Biosciences 558040 Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE BD Biosciences 553925 Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC eBioscience 11-0451-85 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4031-81 Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20 Lonza 04-448Q 10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF) Peprotech 250-03 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) Peprotech 300-19 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3) Peprotech 213-13 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom Corning 3894 Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-0451-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 eBioscience 35-4031-80 Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE eBioscience 12-2012-82 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4031-81 Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC eBioscience 17-5981-83 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC eBioscience 17-4321-81 Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC eBioscience 11-4801-81 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC eBioscience 11-4321-41 Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC BD Biosciences 553127 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC BD Biosciences 556923 Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles BD Biosciences 309306 Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend 108426 Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP Biolegend 400629 Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE eBioscience 12-4321-80 Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC BD Biosciences 555274 Staining
Anti-mouse CD19 APC BD Biosciences 550992 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC BD Biosciences 553932 Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 eBioscience 25-0453-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-81 Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 eBioscience 47-0454-82 Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 eBioscience 47-4321-80 Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader BD Biosciences
Haemocytometer Fisher Scientific S17040 For counting cells
Multi-channel pipette Fisher Scientific 14-559-417 For dispensing cells
FACS analysis software FlowJo/BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

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Cite This Article
Hadland, B. K., Varnum-Finney, B., Nourigat-Mckay, C., Flowers, D., Bernstein, I. D. Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture. J. Vis. Exp. (135), e56973, doi:10.3791/56973 (2018).

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