Klonal analys av hematopoetiska stamceller från embryon prekursorer använder enstaka Cell Index sortering kombinerade med endotelceller nisch samtidig kultur
Summary
Här presenterar vi metod för klonal analys av hematopoetiska stamceller prekursorer under murina embryonal utveckling. Vi kombinerar index sortering av enstaka celler från regionen embryonala aorta-gonad-mesonephros med endotelceller samtidig kultur och transplantation att karakterisera de fenotypiska egenskaper och engraftment potential av enda hematopoetisk prekursorer.
Abstract
Möjligheten att studera hematopoetiska stamceller (HSC) genesis under fosterutvecklingen har begränsats av sällsynthet av HSC prekursorer i det tidiga embryot och avsaknaden av analyser som funktionellt identifiera Multilinjärt engraftment långsiktig potential för enskilda förmodad HSC prekursorer. Här, beskriver vi metodik som möjliggör isolering och karakterisering av funktionellt validerade HSC prekursorer på enstaka cellnivå. Först, vi använder index sortering för att katalogisera exakt fenotypiska parametern för varje individuellt sorterade cell, med en kombination av fenotypiska markörer för att berika för HSC prekursorer med ytterligare markörer för experimentell analys. Andra, varje index-sorterade cell är samtidig odlade med vaskulär nisch stroma från regionen aorta-gonad-mesonephros (AGM), som stöder mognaden av icke-implantation HSC prekursorer till funktionella HSC med Multilinjärt, långsiktig engraftment potential i transplantation-analyser. Denna metod möjliggör korrelation av fenotypiska egenskaper av klonala hemogenic prekursorer med sin funktionella engraftment potential eller andra egenskaper såsom transkriptionell profil, att tillhandahålla ett sätt för detaljerad analys av HSC föregångare utveckling på enstaka cellnivå.
Introduction
Klonal studier visat heterogenitet i långsiktiga engraftment egenskaperna för vuxna Förenta, vilket ger nya insikter om HSC subtyper och förändringar i HSC beteende under åldrande1. Liknande studier av embryonala Förenta och deras prekursorer har dock mer utmanande. Under tidig embryonal utveckling, Förenta uppstår från en population av prekursorer som kallas hemogenic endotelet i en övergående process avses som den endothelial hematopoetiska övergång2. Den första HSC, definieras av deras förmåga att tillhandahålla robust, långsiktiga Multilinjärt engraftment efter transplantation i konditionerat vuxna mottagare, inte upptäcks förrän efter embryonala dag 10.5 (E10.5) i murina embryot, på mycket låg frekvens3 . Under deras utveckling, måste prekursorer till HSC (pre-HSC) som härrör från hemogenic endotelet genomgå mognad innan förvärva egenskaperna för vuxna HSC som möjliggör effektiv engraftment i transplantation analyser4,5 , 6. skymmer studiet av sällsynta HSC ursprung, en mängd hematopoetiska progenitorceller med erytroid, myeloisk och lymfatisk potential upptäcks redan före uppkomsten av HSC från pre-HSC7,8. Således kräver skilja pre-HSC från andra hematopoetiska progenitorceller metoder klonalt isolera cellerna och förse dem med signalerna som är tillräcklig för deras mognad till HSC, upptäcka deras engraftment boenden i transplantation analyser.
Ett antal metoder har beskrivits som gör det möjligt för detektion av pre-HSC av antingen ex vivo eller in-vivo mognad till HSC. Ex vivo metoder har berodde på kultur av embryonala vävnader, såsom årsstämman regionen, där den första HSC upptäcks i utveckling9. Bygga på dessa metoder, protokoll som inkorporerar dissociation, har sortering och förnyad aggregering av årsstämman vävnader tillåtet karakterisering av sorterade populationer som innehåller HSC prekursorer under utvecklingen från E9.5 till E11.5 i den para-aorta Splanchnopleuraen (P-Sp) / AGM regioner4,5,10; dessa metoder är dock inte mottaglig för hög genomströmning analys av prekursorer till den enda cell-nivå som krävs för klonal analys. Likaså i vivo mognad av transplantation till nyfödda möss, där mikromiljö antas vara mer lämplig för stöd av tidigare stadier av HSC prekursorer, har också möjliggjort studier av sorterade populationer från gulesäcken och AGM / P-Sp (P-Sp är regionen föregångare till årsstämman) med egenskaper av pre-HSC, men dessa metoder också misslyckas med att tillhandahålla en robust plattform för single cell analys11,12.
Studier från Rafii et al. visade att Akt-aktiverade endotelceller (EG) stroma kan ge en nisch substrat för stöd av vuxna HSC självförnyelse in vitro-13,14,15. Vi bestämde nyligen att Akt-aktiverat EG härrör från regionen AGM (AGM-EG) ger en lämpliga in vitro- nisch för mognaden av hemogenic prekursorer, isolerade så tidigt som E9 i utveckling till vuxen-implantation HSC, samt den efterföljande självförnyelse genererade HSC16. Med tanke på att detta system använder en enkel 2-dimensionella samtidig kultur, är det lätt anpassningsbar för klonal analys av individuellt isolerade hemogenic prekursorer HSC potential.
Vi har nyligen rapporterat en strategi till assay HSC potential av klonala hemogenic prekursorer genom att kombinera index sortering av enskilda hemogenic prekursorer från murina embryon med AGM-EG samtidig kultur och efterföljande funktionell analys vid transplantation analyser17. Index sortering är en läge av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) som spelar (index) alla fenotypiska parametrar (dvsframåt scatter FSC-A-side scatter (SSC-A), fluorescens parametrar) av varje individuellt sorterade cell så att dessa funktioner kan korreleras retroaktivt till efterföljande funktionell analys efter sortering. FACS programvaran registrerar både fenotypisk information för varje cell och position/väl av den plattan med 96 brunnar där den placerades. Denna teknik har tidigare elegant används för att identifiera heterogenitet i vuxen HSC, bestämma fenotypiska parametrar som ytterligare berika för långsiktig implantation delmängden av HSC, och korrelera fenotypiska parametrar för HSC med transkriptionell boenden på singeln cell nivå18,19. Här, tillhandahåller vi detaljerad metod för denna strategi som möjliggör identifiering av unika fenotypiska parametrar och härstamning bidrag av pre-HSC under tidiga stadierna av fosterutvecklingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien av HSC genesis under fosterutvecklingen nödvändiggör medel för att upptäcka HSC potential i hemogenic prekursorer ännu saknar behörighet att tillhandahålla långsiktiga Multilinjärt hematopoetiska beredning i transplanterade vuxna mottagare. I detta protokoll presenterar vi en klonal analys av embryonala hemogenic prekursorer av stromal samtidig kultur på vaskulär nisch ECs från årsstämman, som stöder mognaden av prekursorer till HSC, med efterföljande Funktionalanalys i transplantation analyser. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Andrew Berger, Stacey Dozono och Brian Raden i Fred Hutchinson Flow flödescytometri kärna för hjälp med FACS. Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa NHLBI UO1 bidraget #HL100395, tillhörande Collaborative Grant #HL099997 och NIDDK bevilja #RC2DK114777. Brandon Hadland stöds av Alexs lemonad stå Foundation och Hyundai Hope på hjul Foundation.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
