En simpel højeffektiv protokol til den pankreatiske ø-isolation fra mus

Summary

Denne ø-isolations protokol beskrev en ny rute for kollagenase-injektion for at fordøje det exokrine væv og en forenklet gradient procedure for at rense Holme fra mus. Det involverer enzymatisk fordøjelse, gradient separation/rensning, og ø håndplukning. Vellykket isolation kan give 250 – 350 høj kvalitet og fuldt funktionelle Holme per mus.

Abstract

Pancreasøer, også kaldet Holme af Langerhans, er en klynge af endokrine celler, der producerer hormoner til glukose regulering og andre vigtige biologiske funktioner. Holme består primært af fem typer af hormon-secernerende celler: α celler udskiller Glucagon, β celler udskiller insulin, δ celler udskiller somatostatin, ε celler udskiller Ghrelin, og PP celler udskiller pancreas polypeptid. 60 til 80% af cellerne i Holme er β-celler, som er den vigtigste cellepopulation til at studere insulinsekretionen. Pancreasøer er et afgørende model system til at studere ex vivo insulinsekretion. Erhvervelse af høj kvalitet Holme er af stor betydning for diabetes forskning. De fleste Islet isolation procedurer kræver teknisk vanskeligt at få adgang til stedet for kollagenase injektion, barske og komplekse fordøjelse procedurer, og multiple tæthed gradient rensning trin. Dette papir har en simpel High Yield mus Islet isolation metode med detaljerede beskrivelser og realistiske demonstrationer, der viser følgende specifikke trin: 1) injektion af kollagenase P ved ampulla af Vater, et lille område, der tilmelder sig bugspytkirtlen kanalen og den fælles galdegang, 2) enzymatisk fordøjelse og mekanisk adskillelse af exokrine bugspytkirtlen, og 3) et enkelt gradient rensningstrin. Fordelene ved denne metode er injektion af fordøjelsesenzymer ved hjælp af den mere tilgængelige ampulla af Vater, mere komplet fordøjelse ved hjælp af en kombination af enzymatiske og mekaniske tilgange, og en enklere enkelt gradient rensning trin. Denne protokol producerer ca. 250 — 350 Holme pr. mus; og holme er velegnede til forskellige ex vivo-undersøgelser. Mulige forbehold af denne procedure er potentielt beskadigede Holme på grund af enzymatisk fordøjelse og/eller forlænget gradient inkubation, som alle kan i vid udstrækning undgås ved omhyggelig ad begrundelse af inkubationstiden.

Introduction

Der er to fælles metoder i litteraturen for bugspytkirtlen ø isolation. Man kræver excising bugspytkirtlen og terninger det i små stykker ved hjælp af kirurgisk saks, og derefter fordøje det i en kollagenase løsning^1,2,3. En anden mere præcis metode er at bruge nettet af kanaler til stede i bugspytkirtlen til at indføre fordøjelsessystemet enzym. Følgende steder er blevet brugt til fordøjelseskanalen enzym injektion: krydset af galde og cystisk kanal, galdeblæren i den fælles galdegang, eller den fælles galde kanalen selv^1,4,5. Det er kendt, at Holme ikke er jævnt fordelt i bugspytkirtlen; milt-regionen indeholder de fleste Holme⁶. Mens den anden metode ved hjælp af anatomiske veje til at levere fordøjelsesenzymer giver mulighed for en mere komplet perfusion af bugspytkirtlen, herunder splenisk region, denne procedure kræver ofte fastspænding eller suturering af ampulla af Vater, der er teknisk Udfordrende. Med hensyn til ø rensning, flere tæthed gradienter, samt celle sier og magnetisk retraktion er blevet brugt til at rense Holme^3,7. Udnyttelsen af disse gradienter kan være tidskrævende og Ficoll gradienter kan resultere i giftige skader af Holme⁸.

Den nuværende protokol er bygget på den metode, der er beskrevet af Li et al.⁷, med yderligere ændringer tilføjet baseret på erfaringerne fra os selv og andre^1,4. De mest kritiske trin i vores protokol er fastspænding af den fælles galdegang nær leveren ende, indsprøjtning kollagenase P via ampulla af Vater at fordøje den exokrine væv, og derefter ved hjælp af en ryster vandbad til at fremskynde fordøjelsen mekanisk^{1, 4,7}. Efterfølgende anvendes en "STOP"-løsning for at hæmme yderligere fordøjelse af Holme; HBSS bruges til at vaske den resterende kollagenase P og STOP opløsning. Da Ficoll-metoden blev brugt til at rense humane Holme, blev udbyttet rapporteret at være dobbelt så store som Holme med større funktionel kapacitet (f. eks. insulinsekretion) sammenlignet med brugen af Percoll gradienter⁹. Men, undersøgelser har sat spørgsmålstegn ved brugen af ficoll gradient på grund af dens toksiske virkning på Holme^1,10. Det er blevet rapporteret, at den Histuigennemsigtige gradient giver optimal rensning kinetik for mus ø isolation, som giver gode udbytte af høj kvalitet Holme med enklere trin og lavere omkostninger¹. I vores protokol, Histuigennemsigtig-1077 bruges til at rense Holme fra andre resterende væv^8,11. De høstede Holme kan dyrkes i komplet RPMI-1640 medier, eller direkte udnyttet i RNA/protein kvantitation.

Vores protokol, ved hjælp af en kombination af kollagenase P fordøjelse og en enkelt gradient rensning trin, er enklere end andre offentliggjorte protokoller. Vores metode kræver ikke krævende kirurgiske indgreb og har blot et par enkle trin. Endnu vigtigere, denne protokol konsekvent producerer et godt udbytte af høj kvalitet funktionelle Holme (250-350/mus) som vi rapporterede¹².

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for dyrepasning og-anvendelse (ACUC) fra Texas A & M University. De kirurgiske værktøjer skal vises i figur 1 , og skematisk diagram af proceduren er vist i figur 2.

1. løsninger

1. Forbered Hank's afbalancerede salt opløsning (HBSS) ved at tilsætte 100 mL 10X HBSS (fra lager) til 900 mL destilleret vand for at lave 1 L HBSS (1X).
2. Forbered STOP opløsning (skal gøres frisk og bør anvendes inden for 1 h) ved at tilføje 50 mL af 100X føtal kvægserum (FBS) til 450 mL iskold 1X HBSS; Dette gør 500 mL STOP opløsning. Hold STOP opløsningen ved 4 °C.
3. Forbered kollagenase P opløsning (skal gøres frisk inden for 1 h af at blive brugt) ved tilsætning af 1 mg/mL kollagenase P til iskold 1X HBSS; Brug 6 mL/mus.
   1. Tilsæt 0,05% (w/v) bovin serumalbumin (BSA) til kollagenase P opløsning (dette giver næringsstoffer til de isolerede Holme). For eksempel, brug 3 mg BSA i 6 ml kollagenase P opløsning. Hold på is.
   2. Beregn og Forbered mængden af kollagenase P nødvendig for alle mus i 1 50 mL rør.
4. Forbered komplet RPMI 1640 medium ved at tilføje 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, INS-1 celle supplement (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat og 0,05 mM 2-mercaptoethanol) til 500 mL RPMI 1640 medier indeholdende 5,5 mM glucose, der skal anvendes for natten kultur og inkubation.

2. forberedelse

1. Fyld 3 50 mL rør af 25 mL RNase hæmmende opløsning, 70% ethanol eller destilleret H₂O. Disse opløsninger vil blive brugt til at rense kirurgiske værktøjer før og under proceduren.
2. Sug spidsen af værktøjerne i RNase-hæmmende opløsning i 30 minutter, før du starter protokollen; Dette eliminerer enhver potentiel RNase på værktøjerne.
3. Pre-cut absorberende puder til 6 i x 6 i størrelse til brug under kirurgi.
4. Forbered 1X HBSS-opløsning på forhånd og opbevar ved 4 °C. Forbered STOP opløsningen før operationen. Opbevares ved 4 °C.
5. Forbered kollagenase P opløsning umiddelbart før operationen og opbevares på is.
   Bemærk: dette bør anvendes inden for 2 timer forberedelse.
6. Etiket 50 mL rør til fordøjelse og rensning; Forbered 2 rør til hver mus, en til fordøjelsen og den anden til ø rensning. Sørg for, at dyrets ID er på begge rør.
7. Tilsæt 3 mL kollagenase P-opløsning til det første 50 mL rør. De resterende 3 mL kollagenase P vil blive injiceret.
8. De resterende 3 mL kollagenaseopløsning trækkes ind i en 3 mL sprøjte, der er monteret med 30 G 1/2 i nål. Anbring sprøjten på is.

3. procedure

1. Fjern alle værktøjer fra RNase hæmmende opløsning, derefter dyppe dem først i røret med 70% ethanol, derefter i røret indeholder destilleret H₂O, derefter luft-tør på rent papir håndklæde.
2. Placer musen i et kammer, der indeholder 0,5 mL isofluran, indtil musen er dybt bedøvet.
3. Fjern musen fra kammeret og kontrollere tilstanden af anæstesi ved at klemme en fodpude med pincet. Dyb bedøvelse er baseret på observation af, at vejrtrækningen bliver støt langsom, og musen er ureaktiv til fods klemning. Efter at have bekræftet, at musen er dybt bedøvet, aflive musen med livmoderhals dislokation, og derefter placere musen på absorberende pad.
   1. Placer bedøvet mus på maven, lægge pres på halsen og afplacere rygsøjlen fra hjernen ved at trække hale.
4. Tape lemmerne af musen i liggende position til absorberende pad, spray kroppen med 70% ethanol, og tør overskydende ethanol.
5. Brug Cover glas pincet og buet kirurgisk saks til at gøre indsnit. Først gøre en horisontal indsnit på huden af maveregionen (~ 3 cm), trække huden bred åben for at udsætte bugvæggen. Derefter lave en lodret indsnit (~ 3 – 4cm) på bughulen til fuldt ud at udsætte bugspytkirtlen i bughulen (figur 3).
6. Skubbe lapper af leveren overlegent at udsætte galdegangen, det vil fremstå som en bleg lyserød tube (figur 3).
7. Flyt forsigtigt tarmene fra højre lænde/iliac-region i bughulen til højre, udsætter galdegangen og hepatisk arterie (figur 3).
8. Klem forsigtigt den fælles galdegang ved hjælp af Schwartz mikro serrefines (figur 1) så tæt på leveren som muligt.
9. Identificer ampulla af Vater, som er placeret på duodenal papilla, dannet af Unionen af bugspytkirtlen kanalen og den fælles galdegang. Ampulla af Vater vises hævede, når de ses under en dissektion mikroskop, som er Indgangspunktet til den fælles galdegang (figur 4).
   Bemærk: justering af intensiteten/vinklen på lyset i dissektions mikroskopet kan gøre det lettere at finde.
10. Sæt sprøjten med 3 mL kollagenase P opløsning i ampulla af Vater. Skub nålen ind i kanalen for omkring 1/4 af længden af den fælles galdegang (ampulla fører ind i kanalen) som vist i figur 5.
11. Når nålen er i ampulla, sikre, at orienteringen af nålen er sådan, at det er parallelt med kanalen.
12. Stabiliserer nålen ved at fastspænde med mikro-Adson-pincet for at forhindre, at den punktere kanalen (figur 5).
13. Injicer langsomt og støt 3 mL af kollagenase P-opløsningen fra sprøjten i den almindeligt forekommende galdegang (nok til at føle modstand) som vist i figur 6. Målet er at skabe tilbagestrømning pres for at tvinge kollagenase at komme ind i bugspytkirtlen kanalen. Injektion anses for vellykket, hvis hoved, nakke, krop og hale region i bugspytkirtlen er alle fuldt oppustet.
    Bemærk: Islet-udbyttet vil være lavt, hvis enten bugspytkirtlen ikke er helt oppustet, eller det spleniske område ikke er helt oppustet. Milt-området indeholder det højeste antal Holme⁶. Inflationen kan bekræftes ved fremkomsten af åbne rum mellem pancreas væv, der er fyldt med opløsning.
14. Forsigtigt dissekere den oppustet bugspytkirtel og placere den i en 50 mL fordøjelsesrør indeholdende 3 mL iskold kollagenase P opløsning.
    1. Fjern bugspytkirtlen ved hjælp af 2 pincet (buet og mikro Adson; Se figur 1): (begyndende fra milten, trække bugspytkirtlen væk fra milten og fortsætte med at fjerne fra maven og langs duodenum.
       Bemærk: der kræves ingen incisioner.
    2. Hak bugspytkirtlen i 3 – 5 s i fordøjelses røret med 3 mL iskold kollagenase P opløsning ved hjælp af fin kirurgisk saks (figur 7a).
15. Fastgør røret til et rack i 37 °C vandbad og ryst ved 100 – 120 rpm i ca. 12 – 13 minutter.
16. Efter inkubationen rystes rørene forsigtigt med hånden for at forstyrre vævet, indtil kollagenase P-fordøjelses opløsningen bliver homogen (figur 7b). Homogeniteten bekræftes af et sand lignende udseende af fine partikler i bugspytkirtlen. Omkring 30 s af blid hånd-ryster er normalt nok. Hold røret op til lys til at undersøge, om vævet er godt homogeniseret; Ryst for en anden ~ 15 s hvis det er nødvendigt.
17. Når fordøjet, straks placere rørene på is og tilsæt 40 mL iskold STOP opløsning til at afslutte den enzymatiske fordøjelse.
    Bemærk: på dette tidspunkt kan fordøjelsesrør tilbage på is op til 2 h, hvis der arbejdes på flere mus.
18. Centrifugeglasset centrifugeres i en sving-skovl centrifuge ved 300 x g i 30 s (temperaturen på centrifuge er fleksibel).
    Bemærk: Brug en sving-skovl centrifuge, så vævs pellet dannes i bunden af 50 mL røret og ikke på væggen af røret; Dette er afgørende for bedre ø-udbytte.
19. Decant og Gentag Centrifugerings opløsningen med STOP-opløsning 2 gange, og deantering af opløsningen efter hvert spin. Brug 20 mL STOP opløsning til hver efterfølgende vask.
    1. Før hvert spin, forstyrre pellet ved forsigtigt at ryste vævs pellet i 50 mL røret i 20 mL STOP opløsning.
20. Re-suspendere vævs pellet med 40 mL iskold HBSS og centrifugeres ved 300 x g for 30 s.
21. Decant og Gentag centrifugeringen ved hjælp af en svingende spand Centrifuge med HBSS-opløsning to gange mere, og deantering af opløsningen efter hvert spin. Brug 20 mL HBSS til hver vask.
    1. Før hvert spin, afbryde pellet, at løsne den fra bunden af røret ved forsigtigt at ryste røret indeholdende 20 mL HBSS opløsning.
22. Efter den sidste centrifugering fjernes alle HBSS.
23. Tilsæt derefter 5 mL rumtemperatur tæthed til 50 mL-røret, der indeholder pellet. Vortex kortvarigt ved lav hastighed indtil homogeniseret.
24. Tilsæt yderligere 5 mL af rumtemperatur tætheden til 50 mL røret. Må ikke vortex/mix.
    Bemærk: det er afgørende at forblive stabil og stadig for at give bedre gradient til form uden afbrydelse.
25. Afpipettér 10 mL rumtemperatur HBSS-buffer i røret (som indeholder densitetsgradient), Drop-by-Drop forsigtigt og langsomt for at tillade en gradient at danne. Brug en pipette pistol med en 10 mL pipette til at tilføje HBSS dropwise.
26. Ved hjælp af en sving-skovl centrifuge, spin rør ved 1700 x g i 15 min. Sørg for at ændre hastigheden for både acceleration/deceleration til den laveste indstilling for at opretholde gradient (figur 7c).
27. Efter spin, forsigtigt fjerne rørene uden at forstyrre gradient. Ved hjælp af en pipette pistol, der er forfuret med kold HBSS (pipette HBSS op og ned), pipetteres det lag af Holme (5-10 mL), der dannes mellem densitetsgradient og hbu'erne i det nye 50 mL ø-opsamlings glas.
    Bemærk: det er nyttigt at våd pipetten med kold HBSS før Pipettering af Holme for at forhindre, at Holme klæber til pipettens indre vægge.
    1. I tilfælde af adskillelse er ufuldstændig, Holme ville være synlige i tætheden gradient lag, pipette ud hele 10 ml af tætheden gradient (nederste lag) sammen med den ø lag dannet på grænsefladen (kun at forlade omkring 8-10 ml af hbss øverste lag bag).
       Bemærk: indsamling af både ø-lag og tæthed gradient lag (nederste lag) kan resultere i indsamlingen af snavs, som kan forlænge den ø plukke tid, men ingen andre skridt vil blive ændret. Indsamling af begge disse lag er ikke nødvendigt, når øen lag er godt dannet.
28. Tilsæt 20 mL iskold HBSS til det nye 50 mL rør, der indeholder Holme, og centrifuger derefter ved 350 x g i 3 minutter i en svingende spand centrifuge.
29. Efter spin, forsigtigt pipetten (ikke dekanteres) ud supernatanten (Lad ~ 3 ml i bunden) uden at forstyrre pellet indeholder Holme i bunden. Kassér supernatanten.
30. Gentag vask og centrifugering mindst 3 gange. Tilsæt 20 mL HBSS hver gang, og sørg for at suspendere pellet før hvert spin.
31. Varm RPMI-1640 komplet medie flaske i et vandbad ved 37 °C før brug. Efter den sidste centrifugering fjernes alle HBU'ERNE, og der tilsættes 4 mL af de tidligere forberedte komplette RPMI-1640-medier (indeholdende FBS, INS-1-celle tillæg og penicillin/streptomycin) til pellet.
32. Dislodge pellet ved forsigtigt hvirvlende røret og straks hælde RPMI-1640 medierne i en 100 mm Petri skål. Tilsæt yderligere 5 mL RPMI-1640-medier til røret og Hvirvl forsigtigt det ud for at vaske eventuelle resterende Holme, og hæld derefter mediet i samme Petri skål.
    1. Under et dissektion-mikroskop kan du vælge sunde Holme fra Petri skålen med en pipette på 20 μl og anbringe dem i en ny petriskål, der indeholder 10 ml komplet rpmi 1640-medie. Når de ses under en dissektion mikroskop, bør Holme vises sfærisk/aflang og gylden-brun farve med en glat overflade i forhold til den relativt gennemsigtige, wispy eksokrine væv.
       Bemærk: forstørrelse af dissektion mikroskop er normalt indstillet til 12.5-16x. Islet udbytte vil variere afhængigt af forskellige faktorer, herunder stamme, alder og sex af mus. Denne protokol giver normalt 250 – 350 sunde Holme fra sund C57BL/6J mus alder 4 – 10 måneder gammel.
33. Inkubér Holme i en steril inkubator ved 37 °c med 5% Co₂ -infusion og 95% befuret luft natten over for eksperimenter næste dag, eller fryse Holme for den ønskede analyse på et senere tidspunkt.
    1. Når Holme er frosset, kan de ikke anvendes til sekretions assays, kun RNA eller protein kvantificering. At indsamle celler til at fryse, placere dem i HBSS buffer, indsamle alle Holme i 200 – 500 μL buffer, overførsel til 1,5 mL rør, centrifuge 350 x g i 1 – 2 min, fjerne supernatanten forlader ikke mere end 30 – 40 μl opløsning, sted i-20 °c for kort tids opbevaring ( flere dage) eller-80 °C til langtidsopbevaring.

Representative Results

Korrekt færdiggørelse af denne procedure kræver en vis forståelse af mus anatomi i bughulen. Dette giver mulighed for korrekt identifikation af ampulla af Vater og Fastspænding af den fælles galdegang. Hele proceduren tager normalt 1 – 2 h. Det er mere effektivt at isolere Holme fra 4 – 6 mus på samme tid, så flere prøver kan centrifugeres sammen. Tiden for ø-plukning varierer, afhængigt af antallet af Holme og effektiviteten af fordøjelsen; Det kan tage cirka en time at plukke 250-350 Holme fra 1 mus.

I dette papir er en række meget realistiske billeder inkluderet: figur 3 viser bughulen af musen, udsætter den fælles galdegang og hepatisk arterie. Figur 4 viser hele længden af fælles galdegang, som synes at være en lysere farve, samt ampulla af Vater, som er større og mere skinnende nær skillevej (hvor nålen vil blive indsat) mellem bugspytkirtlen og duodenum. En klemme er placeret på den fælles galdegang og hepatisk arterie bundt tæt på leveren til at blokere strømmen af kollagenase P i leveren. Undladelse af at klemme galde kanalen korrekt eller stram nok vil resultere i lækage og ufuldstændig perfusion af bugspytkirtlen. Figur 5 viser nålen indsat ved ampulla af Vater i den fælles galdegang. Når nålen er i den fælles kanal, anvendes pincet til at stabilisere nålen for at forhindre det i at punktere kanalen under injektion. Når injektionen begynder, vil bugspytkirtlen begynde at svulme fra proksimal ende til distale ende; den spleniske region bør begynde at puste efter ca. 1 mL kollagenase injektion. Tilbagestrømning i tarmene kan føre til en uønsket inflation af duodenum; Dette kan afhjælpes ved at justere placeringen af nålen (trække det ud lidt, eller genindsætte lidt dybere) og ved korrekt stabilisering af nålen ved hjælp af pincet. Injektionen betragtes som en succes, hvis alle regioner i bugspytkirtlen er oppustet (duodenal, gastrisk og milt lapper) som vist i figur 6. Fjernelse af bugspytkirtlen bør begynde fra splenisk regionen. Den oppustet bugspytkirtel hakkes i bidder ved hjælp af fin kirurgisk saks (figur 7a). Efter 12 – 13 minutters fordøjelse og blanding ved hånd rystning forekommer den vævs indeholdende suspension mere homogen (figur 7b). Derefter renses øletterne ved tætheds gradienten efter centrifugering. Figur 7c viser, at et ø-ophængnings lag DANNES mellem hbu'erne og densitetsgradient efter centrifugering. God/sund Holme vises som glat rund formet; dårlige/beskadigede Holme viser ru kanter, og ufordøjet eksokrine væv viser uregelmæssig form og synes mere gennemsigtigt som vist i figur 8.

Figur 1: kirurgiske værktøjer.
Buet kirurgisk saks, Cover glas pincet, mikro Adson tang, buede pincet, lille kirurgisk saks, og Schwartz mikro serrefines (microvaskulære clamp) er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: skematisk illustration af protokollen.
De mest kritiske trin i denne procedure er fastspænding af den fælles galdegang i nærheden af leveren, og indsprøjtning kollagenase P via ampulla af Vater i fælles galdegang at fordøje bugspytkirtlen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: placering af fælles galdegang.
Pincet holde op den fælles galdegang og hepatisk arterie bundt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: illustration af almindelig galdegang og ampulla af Vater.
En klemme er placeret på den fælles galdegang og hepatisk arterie bundt nær leveren. De sorte pile peger på ampulla af Vater, hvor nålen vil blive indsat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Kanylering af almindelig galdegang.
Efter korrekt kanylering af den fælles galdegang injiceres ampulla af Vater med trypan og et Blue (kun til demonstrationsformål) for bedre at understrege placeringen af den fælles galdegang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: fuldt oppustet bugspytkirtel.
Den stiplede linje viser grænsen for den fuldt perfbrugte bugspytkirtel. Pincet holder den spleniske region, hvor Holme er mest koncentreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: øisolerede og rensningstrin.
A) mekanisk hakkede Vævsstykker af bugspytkirtlen før fordøjelsen. B) fordøjet bugspytkirtel — homogen vævs suspension af kollagenase-perfarerede bugspytkirtel efter 13 min inkubation i et ryste vandbad ved 37 °c, efterfulgt af 30 s blanding i hånden. C) der dannes en ø-suspension mellem hbu'erne og densitetsgradient efter centrifugering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: repræsentative ø-billeder fra fluorescens celle-Imager.
(A) der ses gode Holme, dårlige Holme og exokrine væv. B) der vises en klynge af gode Holme. (C) panel viser uforfordøjet eksokrine væv knyttet til en god ø. Gode/sunde Holme viser glatte, runde kanter, indikeret med det røde bogstav "G"; dårlige/beskadigede Holme viser uregelmæssig form og ru kanter, og er angivet med blåt bogstav "B". Uforfordøjet eksokrine væv vises gennemsigtige, ofte fastgjort til Holme, og er angivet med grønt bogstav "E". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol omfatter kollagenase perfusion og fordøjelse, efterfulgt af rensning af Holme. De mest kritiske trin i denne protokol er effektiv injektion og komplet perfusion af bugspytkirtlen^1,4,7. Leveringsmetoden i denne protokol gør det muligt for enzymet at krydse de anatomiske veje for bedre at fordøje det exokrine væv omkring Holme¹. Hertil kommer, at denne teknik er velegnet til komplet fordøjelse af splenisk region, som har den højeste koncentration af Holme^4,6. Denne protokol, med velkontrolleret fordøjelsestid og omhyggeligt udførte rensningstrin, kan producere 250 – 350 sunde Holme. Holme isoleret fra denne protokol er blevet anvendt med succes til at studere glukose-stimuleret insulinsekretion ex vivo¹². Fra vores erfaring, øget insulinsekretion 4-fold ved høj glukose stimulation (22,2 mM) sammenlignet med baseline (3,3 mM) efter natten inkubation i 5,5 mM glucoseholdige RPMI-1640 komplette medier. Ølets overlevelsesevne/funktionalitet under forlænget inkubation (2 – 7 dage) er ikke blevet afprøvet.

Selv om den præsenterede protokol indeholder detaljerede noter og visuelle demonstrationer, nogle justeringer er nødvendige for at opnå de optimale betingelser for højt udbytte og høj kvalitet Holme. To mest almindeligt forekommende problemer, der kan hæmme succes er forkert kanyle af ampulla af Vater eller utilsigtet punktering af kanalen. For at undgå disse, bør man sikre, at stedet for penetration er præcis, hvor ampulla mødes med duodenum. Dette område er større og relativt let at identificere, hvilket giver mulighed for flere punkteringer uden alvorligt at kompromittere integriteten af kanalen. En gang inden for ampulla, retningen af nålen skal være parallel med kanalen snarere end vinklet. På dette tidspunkt, skubbe nålen ind i kanalen for omkring 1/4 af kanalen længde, og derefter stabilisere nålen med pincet mens langsomt indsprøjtning kollagenase; Dette vil medvirke til at forhindre nålen i at bøje under trykket og ved et uheld at punktere kanalen. Andre problemer kan omfatte over-eller under-fordøjelse af bugspytkirtlen; Dette kan kræve ændringer baseret på alder, stamme og køn af musene. Beskadigede Holme på grund af over-fordøjelse (enzymatisk og mekanisk) eller langvarig udsættelse for tæthed gradient kan forekomme. Disse er almindelige problemer, der findes for lignende metoder; nogle mindre justeringer bør give betydelige forbedringer. Et forslag, når der beskæftiger sig med disse typer af spørgsmål er at vælge en variabel til at ændre på et tidspunkt (f. eks tid af fordøjelsen eller koncentrationen af collagenase).

Den største fordel ved denne protokol er den vej af enzym levering: at have kollagenase P til direkte fordøje den exokrine bugspytkirtlen ved hjælp af en lettere anatomisk rute, som øger fordøjelsen effektivitet¹. Denne metode er blevet rapporteret at give en 50% stigning i antallet af Holme sammenlignet med metoden til excising bugspytkirtlen, snitning det, og udsætter det til kollagenase¹³. Denne protokol kræver kun brug af en enkelt tæthed gradient, hvilket gør det betydeligt mindre arbejdskraftintensive og mere omkostningseffektive, sammenlignet med andre metoder, som kræver udarbejdelse af flere gradienter på forskellige tætheder, eller den komplekse Percoll metode, der kræver ekstra tid^1,8,11. Den gradient metode, der anvendes i denne protokol, er også brugt i Islet isolation af andre⁴. Denne metode til ø-isolation giver videnskabsmanden et forbedret værktøj til at studere pancreas-Holme. Fremtidige anvendelser af denne protokol omfatter ændring for at forbedre effektiviteten, når der beskæftiger sig med diabetiske mus. Som do et al. har observeret, diabetes mus, afhængigt af glukose niveauer, give færre Holme (mindre end 100), med reduceret størrelse og udseende af Holme⁴. Vi har observeret dette fænomen og mener, at diabetisk Holme er mere sårbare over for enzymatisk og mekanisk fordøjelse, som kræver særlig pleje. Desuden, ø tæthed kan ændre sit udseende i tætheden gradient, yderligere optimering af protokollen vil bidrage til at øge udbyttet af diabetiske Holme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL syringe	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass forceps	VWR	82027-396	Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forceps	Sigma-Aldrich	Z168696	Holding tissues during pancreas removal
Isoflurane	Piramal	B13B16A	To anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishes	VWR	30-2041	Used for islet culture
30 G. ½ inch needle	BD	305106	For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tube	VWR	89039-658	Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrier	VWR	82020-845	To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability	Eppendorf	5811FJ478114	Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissors	Fisher-Scientific	13-804-21	For cutting open mouse abdomen
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Corning	20-023-CV	Washing cells
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	For gradient formation
Light source	Leeds	LR92240	Enhancing visibility of microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Culturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)	Fine Science Tools	18052-01	Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbath	Boekel/Grant	8R0534008	Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissors	VWR	82027-578	Cuttitng tissue that atached to pancreas