Summary
זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.
Abstract
איולי הלבלב, הנקרא גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצרת הורמונים עבור רגולציה של גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. איונים בעיקר מורכב מחמישה סוגים של הורמון הפרשת תאים: α תאים להפריש glucagon, תאים β להפריש אינסולין, δ תאים להפריש סוסטטין, ε תאים להפריש ghrelin, ו PP תאים להפריש polypeptide הלבלב. 60 עד 80% התאים באיים הם β תאים, שהם אוכלוסיית התאים החשובים ביותר ללמוד הפרשת אינסולין. איי הלבלב הם מערכת מודל חיונית כדי ללמוד לשעבר הפרשת אינסולין vivo. הקניית איים באיכות גבוהה היא בעלת חשיבות רבה לחקר הסוכרת. רוב הליכי בידוד של איון דורשים מבחינה טכנית קשה לגשת לאתר של הזרקת קולגן, הליכי עיכול קשים ומורכבים, ושלבי הדרגתי דחיסות מרובים. נייר זה כולל פשוט תשואה גבוהה העכבר איון בידוד שיטה עם תיאורים מפורטים והפגנות מציאותי, מראה את הצעדים הבאים ספציפיים: 1) הזרקה של הקולגן בתוך ampulla של vater, אזור קטן הצטרפות תעלת הלבלב ו צינור המרה המשותף, 2) העיכול אנזימטי והפרדה מכנית של הלבלב אקסוקרינית ו 3) צעד אחד טיהור הדרגתי. היתרונות של שיטה זו הם הזרקה של אנזים העיכול באמצעות ampulla נגיש יותר של Vater, העיכול מלאה יותר באמצעות שילוב של גישות אנזימטיות ומכני, ופשוט צעד טיהור יחיד הדרגתי. פרוטוקול זה מייצר כ-250-350 איים לכל עכבר; ו איונים מתאימים למחקרים שונים vivo ex. האזהרות האפשריות של הליך זה עלולות להינזק איונים בגלל עיכול אנזימטי ו/או דגירה ממושכת של הדרגתי, אשר כולם יכולים להימנע במידה רבה על ידי הצדקת מודעות לזמן הדגירה.
Introduction
ישנן שתי שיטות נפוצות בספרות עבור בידוד איון הלבלב. האדם דורש לנצל את הלבלב ולהכניס אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיים, ולאחר מכן לעכל אותו בתמיסה הקולגן1,2,3. עוד שיטה מדויקת יותר היא להשתמש ברשת של צינורות הנמצאים בלבלב כדי להחדיר אנזים העיכול. האתרים הבאים שימשו עבור הזרקת אנזים העיכול: הצומת של צינור המרה פיברוזיס, המרה לתוך צינור המרה המשותף, או צינור מרה משותף עצמו1,4,5. ידוע כי איונים אינם מופצים באופן שווה בלבלב; אזור הטחול מכיל את מרבית האיים6. בעוד השיטה השנייה באמצעות נתיבי אנטומי לספק אנזימי העיכול מאפשר להשלים מלאה יותר של הלבלב, כולל האזור הטחול, הליך זה דורש לעתים קרובות לולאה או מעבר ampulla של Vater כי הוא מבחינה טכנית מאתגר. מבחינת הטיהור של איון, מעברי צפיפות מרובים, כמו גם שפכים סלולריים והנסיגה המגנטית שימשו כדי לטהר את איונים3,7. הניצול של מעברי הצבע האלה יכול לגזול זמן ומעברי הצבע של פיקדול עלולים לגרום לנזק רעיל של איונים8.
הפרוטוקול הנוכחי בנוי על השיטה המתוארת על ידי Li et al.7, עם שינויים נוספים שנוספו על בסיס החוויה של עצמנו ואחרים1,4. הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו הם לסדר את צינור המרה המשותף ליד סוף הכבד, הזרקת הקוליואז P דרך ampulla של Vater לעכל את רקמת אקסוקרינית, ולאחר מכן באמצעות אמבט מים לרעוד כדי לזרז את העיכול מכנית1, 4,7. לאחר מכן, הפתרון ' STOP ' מיושם על מנת לעכב את העיכול של איונים; HBSS משמש כדי לשטוף את שאר הקולגן בתמיסה ו STOP פתרון. כאשר שימש השיטה לטיהור האיים האנושיים, התשואה דווחה כפליים מהאיונים בעלי יכולת תפקודית גדולה יותר (למשל, הפרשת אינסולין) לעומת השימוש במעברי הצבע של חלחול9. עם זאת, מחקרים חקרו את השימוש בהדרגה בעקבות ההשפעה הרעילה שלה על איונים1,10. זה דווח כי הדרגתי Histopaque מספק קינטיקה טיהור אופטימלי עבור בידוד איון העכבר, אשר מייצרת תשואה טובה של איונים באיכות גבוהה עם צעדים פשוטים יותר ועלות נמוכה1. בפרוטוקול שלנו, Histopaque-1077 משמש לטיהור איונים משאר רקמות שיורית8,11. איונים שנקטפו יכול להיות תרבותי בRPMI מלאה-1640 מדיה, או מנוצל ישירות ב-RNA/חלבון כימות.
הפרוטוקול שלנו, באמצעות שילוב של העיכול הקולגן P וצעד טיהור יחיד מעבר צבע, הוא פשוט יותר מאשר פרוטוקולים שפורסמו אחרים. השיטה שלנו לא דורשת הליכים כירורגיים תובעניים ויש לו רק כמה צעדים פשוטים. חשוב מכך, פרוטוקול זה מייצר בעקביות תשואה טובה של איונים פונקציונליים באיכות גבוהה (250-350/עכבר) כפי שדווחו12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (ACUC) של אוניברסיטת טקסס A & M. הכלים המנתחים צריכים מוצגים באיור 1 והתרשים הסכמטי של השגרה מוצג באיור 2.
1. פתרונות
- להכין את הפתרון מאוזנת מלח של האנק (HBSS) על ידי הוספת 100 mL של 10X HBSS (מהמלאי) כדי 900 מ ל של מים מזוקקים לעשות 1 L HBSS (1X).
- הכנת פתרון STOP (חייב להיות טרי ויש להשתמש בו בתוך 1 h) על ידי הוספת 50 mL של סרום העוברי 100X (FBS) כדי 450 mL של קרח קר 1X HBSS; זה הופך את הפתרון 500 mL להפסיק. שמור על פתרון ה-STOP ב-4 ° c.
- הכנת קולגן הפתרון P (חייב להיות טרי בתוך 1 h של להיות בשימוש) על ידי הוספת 1 מ"ג/mL של הקולגנראז P כדי קרח קר 1X HBSS; להשתמש 6 מ ל/עכבר.
- להוסיף 0.05% (w/v) סרום שור אלבומין (BSA) כדי לפתור את הפתרון הקולגן (זה מספק חומרים מזינים את איונים מבודדים). לדוגמה, השתמש ב-3 מ"ג BSA ב 6 מ ל בתמיסה P. לשמור על קרח
- לחשב ולהכין את כמות הקולגנאז P הדרושים עבור כל העכברים בצינור 1 50 mL.
- להכין להשלים RPMI 1640 בינוני על ידי הוספת 10% fbs, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, INS-1 מוסף תא (10 מ"מ hepes, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 mm נתרן פירובט, ו 0.05 mm 2-mercaptoethanol) כדי 500 mL RPMI 1640 מדיה המכילה את הגלוקוז של 5.5 mm ל לתרבות הלילה ולדגירה.
2. הכנה
- מילוי 3 50 mL של 25 מ"ל RNase פתרון מעכב, 70% אתנול או מזוקק H2O. פתרונות אלה ישמשו לניקוי כלי ניתוח לפני ובמהלך ההליך.
- משרים את קצות הכלים בפתרון מעכב RNase למשך 30 דקות לפני התחלת הפרוטוקול; פעולה זו מבטלת את כל RNase פוטנציאלי על הכלים.
- רפידות ספיגה מראש כדי 6 ב x 6 בגודל לשימוש במהלך הניתוח.
- הכינו פתרון HBSS של 1X מראש ואחסן ב-4 ° c. הכינו את פתרון העצירה לפני הניתוח. חנות ב -4 ° c.
- הכינו את התמיסה באופן מיידי לפני הניתוח והחנות על הקרח.
הערה: יש להשתמש בפעולה זו בתוך 2 שעות של הכנה. - לייבל 50 mL לעיכול ולטיהור; להכין 2 צינורות עבור כל עכבר, אחד לעיכול והשני עבור טיהור איון. ודא שמזהה בעל החיים ממוקם על שני הצינורות.
- הוסף 3 מ ל של התמיסה הקולגן P לתוך הצינור הראשון 50 mL. הנותרים 3 מ ל של הקוליוראז P הוזרק.
- לצייר את הנותרים 3 mL של הפתרון הקולגן לתוך מזרק ל 3 מ ל רכוב עם 30 G 1/2 במחט. . הנח את המזרק על הקרח
3. נוהל
- הסר את כל הכלים מ RNase פתרון מעכב, ולאחר מכן לטבול אותם הראשון בצינור עם 70% אתנול, ואז בצינור המכיל H2O מזוקקים, ואז האוויר יבש על מגבת נייר נקי.
- מניחים את העכבר בחדר המכיל 0.5 mL של isofרדימים ane עד העכבר הוא עמוק.
- להסיר את העכבר מתא ולבדוק את מצב ההרדמה על ידי צובט משטח כף רגל עם מלקחיים. ההרדמה עמוקה מבוססת על ההתבוננות כי הנשימה הופכת איטית בהתמדה ועכבר הוא בלתי מגיב לצביטה ברגל. לאחר אישור כי העכבר הוא עמוק רדימים, המתת החסד העכבר עם נקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן למקם את העכבר על הלוח סופג.
- מניחים את העכבר רדימים על הבטן, הפעלת לחץ על הצוואר לפירוק עמוד השדרה מהמוח על ידי משיכת הזנב.
- להקליט את הגפיים של העכבר במיקום פרקדן אל הלוח סופג, לרסס את הגוף עם 70% אתנול, ולנגב עודף אתנול עודף.
- השתמש כיסוי מלקחיים זכוכית מספריים כירורגית מעוקל כדי ליצור חתכים. ראשית לעשות חתך אופקי על העור של אזור הבטן (~ 3 ס מ), למשוך את העור פתוח לרווחה כדי לחשוף את קיר הבטן. ואז לעשות חתך אנכי (~ 3 – 4 ס מ) על צפק הבטן כדי לחשוף במלואו את הלבלב בחלל הבטן (איור 3).
- לדחוף את האונות של הכבד מראש כדי לחשוף את צינור המרה, זה יופיע כצינור ורוד חיוור (איור 3).
- הזיזו בזהירות את המעיים מאזור המותניים/אילאק הימני של חלל הבטן ימינה, תוך חשיפת צינור המרה ועורק הכבד (איור 3).
- בזהירות להדק את צינור המרה המשותף באמצעות שוורץ מיקרו סרזקק (איור 1) קרוב לכבד ככל האפשר.
- זיהוי ampulla של Vater, אשר ממוקם ב papdenal התריסריון, נוצר על ידי האיחוד של צינור הלבלב ואת צינור המרה המשותף. Ampulla של Vater נראה נפוח כאשר מוצג תחת מיקרוסקופ לנתיחה שהוא נקודת הכניסה לצינור המרה המשותף (איור 4).
הערה: התאמת העוצמה/זווית האור של מיקרוסקופ החיתוך יכולה להקל על האיתור. - הכנס את המזרק עם 3 מ ל של פתרון הקולגן של התמיסה לתוך ampulla של Vater. לדחוף את המחט לתוך תעלת האוורור על 1/4 של אורך צינור המרה המשותף (ampulla מוביל צינור האוורור) כפי שמוצג באיור 5.
- לאחר המחט היא בתוך ampulla, לוודא כי הכיוון של המחט הוא כזה שהוא מקביל עם צינור.
- ייצוב המחט על ידי הדפון עם מלקחיים מיקרו Adson כדי למנוע את הצינור (איור 5).
- לאט ובהתמדה להזריק 3 מ ל של פתרון הקולגן בתמיסה מן המזרק לתוך צינור המרה המשותף (מספיק כדי להרגיש התנגדות) כפי שמוצג באיור 6. המטרה היא ליצור לחץ על הזרימה האחורית כדי לאלץ את הקולגנאז להיכנס תעלת הלבלב. ההזרקה נחשבת מוצלחת אם הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב הם מנופחים לחלוטין.
הערה: יבול האיון יהיה נמוך אם הלבלב אינו מנופח לגמרי, או האזור הטחול אינו מנופח לגמרי. אזור הטחול מכיל את המספר הגבוה ביותר של איונים6. האינפלציה יכולה להיות מאושרת על ידי המראה של חללים פתוחים בין רקמת הלבלב כי הם מלאים פתרון. - בזהירות לנתח את הלבלב מנופח ולמקם אותו בצינור העיכול 50 mL המכיל 3 מ ל של הקרח קר הקולגן הפתרון P.
- הסר את הלבלב באמצעות 2 מלקחיים (מעוקל ו מיקרו Adson; ראה איור 1): (החל מן הטחול, למשוך את הלבלב הרחק הטחול ולהמשיך להסיר מן הקיבה ולאורך התריסריון.
הערה: אין צורך בחתכים. - קוצצים הלבלב עבור 3 – 5 s בצינור העיכול עם 3 מ ל של קרח קר הקולגן התמיסה הפתרון באמצעות מספריים כירורגי משובח (איור 7A).
- הסר את הלבלב באמצעות 2 מלקחיים (מעוקל ו מיקרו Adson; ראה איור 1): (החל מן הטחול, למשוך את הלבלב הרחק הטחול ולהמשיך להסיר מן הקיבה ולאורך התריסריון.
- אבטחו את הצינורית לארון תקשורת ב37 המים של ° c ונענעי במהירות של 100 – 120 סל ד במשך כ -12 – 13 דקות.
- לאחר הדגירה, בעדינות לנער את הצינורות ביד כדי לשבש את הרקמה עד הקולגן בתמיסה העיכול P הופך הומוגנית (איור 7B). הומוגניות מאושרת על-ידי המראה הדומה לחול של חלקיקים עדינים של הלבלב. כ -30 ס מ עדין מספיק. החזיקו את השפופרת עד לאור כדי לבדוק אם הרקמה הינה הומוגניים היטב; ללחוץ על עוד ~ 15 s אם יש צורך.
- לאחר מתעכל, מיד למקם את הצינורות על הקרח ולהוסיף 40 mL של תמיסת קרח קר להפסיק לסיים את העיכול אנזימטי.
הערה: בשלב זה צינורות העיכול יכול להיות שמאל על הקרח עד 2 h, אם עובד על עכברים מרובים. - צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה מנופף דלי ב 300 x g עבור 30 s (הטמפרטורה של צנטריפוגה היא גמישה).
הערה: השתמש צנטריפוגה דלי מנופף כך את הגלולה הרקמה נוצרת בתחתית שפופרת 50 mL ולא על הקיר של הצינור; זה קריטי לתשואה טובה יותר של איון. - Decant ולחזור על הצנטריפוגה עם פתרון STOP 2 פעמים יותר, בקבוקי את הפתרון לאחר כל ספין. השתמש ב -20 מ ל של פתרון STOP עבור כל שטיפת הבאים.
- לפני כל ספין, לשבש את הגלולה על ידי טלטול בעדינות את הגלולה בצינור 50 mL ב 20 mL להפסיק פתרון.
- מחדש להשעות את הגלולה הרקמה עם 40 mL של HBSS קר קרח ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 30 s.
- Decant ולחזור על הצנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה דלי מנופף עם פתרון HBSS פעמיים יותר, בקבוקי את הפתרון לאחר כל ספין. השתמש ב-20 מ ל של HBSS עבור כל כביסה.
- לפני כל ספין, לשבש את הגלולה, כדי לנתק אותו מהחלק התחתון של הצינור על ידי לטלטל בעדינות את הצינור המכיל 20 mL HBSS פתרון.
- לאחר הצנטריפוגה האחרון להסיר את כל HBSS.
- ואז להוסיף 5 מ ל של צפיפות טמפרטורת החדר הדרגתי לצינור 50 mL המכיל את הגלולה. מערבולת בקצרה במהירות נמוכה עד הומוגניים.
- הוסיפו עוד 5 מ ל של צפיפות טמפרטורת החדר מעבר לצינור 50 mL. אל תעשה מערבולת/מיקס.
הערה: קריטי להישאר יציב ועדיין כדי לאפשר מעבר צבע טוב יותר לטופס ללא הפרעה. - פיפטה 10 מ ל של טמפרטורת החדר HBSS מאגר לתוך הצינור (המכיל את הדרגתי צפיפות), ירידה באמצעות ירידה בעדינות ובאיטיות כדי לאפשר הדרגתי לטופס. השתמש באקדח הפיפטה עם הפיפטה 10 מ"ל כדי להוסיף HBSS dropwise.
- באמצעות צנטריפוגה מנופף בדלי, שפופרות ספין ב 1700 x g עבור 15 דקות. הקפד לשנות את המהירות של הן האצה/האטה להגדרה הנמוכה ביותר כדי לשמור על מעבר הצבע (איור 7c).
- לאחר הספין, בזהירות להסיר את הצינורות מבלי להפריע את מעבר הצבע. באמצעות אקדח הצינורות מראש עם HBSS קר (הצינור HBSS למעלה ולמטה), פיפטה את השכבה של איונים (5-10 mL) נוצר בין הדרגתי צפיפות HBSS לתוך הצינור החדש 50 mL איון האוסף.
הערה: מומלץ להרטיב את הפיפטה עם HBSS הקר לפני שהוא מלטף את האיים כדי למנוע מהאיים לדבוק בקירות הפנימיים של הפיפטה.- במקרה ההפרדה אינה מלאה, איונים יהיה גלוי בשכבה מעבר הצפיפות, פיפטה את כל 10 מ ל של הצפיפות הדרגתי (השכבה התחתונה) יחד עם שכבת איון שנוצר בממשק (רק לעזוב על 8-10 מ ל של השכבה העליונה HBSS מאחורי).
הערה: איסוף הן שכבת איון ואת מעבר הצבע שכבת הצפיפות (השכבה התחתונה) יכול לגרום לאוסף של פסולת אשר עשוי להאריך את זמן הקטיף איון, אך לא לשנות שלבים אחרים. איסוף שתי שכבות אלה אינו הכרחי כאשר שכבת איון היא בנויה היטב.
- במקרה ההפרדה אינה מלאה, איונים יהיה גלוי בשכבה מעבר הצפיפות, פיפטה את כל 10 מ ל של הצפיפות הדרגתי (השכבה התחתונה) יחד עם שכבת איון שנוצר בממשק (רק לעזוב על 8-10 מ ל של השכבה העליונה HBSS מאחורי).
- הוסף 20 מ ל של קרח קר HBSS לצינור חדש 50 mL המכיל איונים, אז צנטריפוגה ב 350 x g עבור 3 דקות ב צנטריפוגה מנופף דלי.
- לאחר הספין, פיפטה בזהירות (לא decant) החוצה supernatant (לעזוב את ~ 3 מ ל בתחתית) מבלי להפריע את הגלולה המכילה את איונים בתחתית. . מחק את הסופרנטאנט
- חזרו על הכביסה והתפרידו לפחות 3 פעמים. הוסף 20 מ ל של HBSS בכל פעם, ולהיות בטוח להשעות את הגלולה לפני כל ספין.
- חמם את RPMI-1640 בקבוק מדיה מלא באמבט מים ב 37 ° c לפני השימוש. לאחר הצנטריפוגה האחרון, להסיר את כל HBSS ולהוסיף 4 מ ל של הוכנו בעבר RPMI-1640 מדיה (המכיל FBS, INS-1 מוסף תא פניצילין/סטרפטומיצין) אל הגלולה.
- להוציא את הגלולה על ידי מתערבל בעדינות את הצינור ומיד לשפוך את RPMI-1640 מדיה לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. הוסף עוד 5 מ ל של RPMI-1640 מדיה לצינור ומערבולת בעדינות כדי לשטוף את כל האיים הנותרים, אז גם לשפוך את המדיה לתוך אותה צלחת פטרי.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לקטוף איונים בריאים מן צלחת פטרי באמצעות הצינורות 20 μL, ולשים אותם בצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מ ל RPMI 1640 מלאה מדיה. כאשר מתבוננים תחת מיקרוסקופ לנתיחה, איונים צריכים להופיע בצבע כדורי/מלבני וחום זהוב עם משטח חלק לעומת הרקמה השקופה באופן יחסי, ווירגל אקסוקרינית.
הערה: הגדלה של מיקרוסקופ הניתוח מוגדרת בדרך כלל בשעה 12.5 – 16x. תשואה איון ישתנה בהתאם לגורמים שונים כולל זן, גיל ומין של העכבר. פרוטוקול זה בדרך כלל מניב 250 – 350 איונים בריאים מן העכבר C57BL/6J גיל 4 – 10 חודשים.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לקטוף איונים בריאים מן צלחת פטרי באמצעות הצינורות 20 μL, ולשים אותם בצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מ ל RPMI 1640 מלאה מדיה. כאשר מתבוננים תחת מיקרוסקופ לנתיחה, איונים צריכים להופיע בצבע כדורי/מלבני וחום זהוב עם משטח חלק לעומת הרקמה השקופה באופן יחסי, ווירגל אקסוקרינית.
- מודחלת האיים בחממה סטרילית ב 37 ° c עם 5% CO2 אינפוזיה ו 95% מחולל אוויר לילה לניסויים למחרת, או להקפיא את איונים לניתוח הרצוי במועד מאוחר יותר.
- ברגע שהאיים קפואים, לא ניתן להשתמש בהם לפרשת הפרשה, רק RNA או קוונפיקציה של חלבון. כדי לאסוף את התאים כדי להקפיא, למקם אותם במאגר HBSS, לאסוף את כל איונים ב 200 – 500 μL של מאגר, העברה לצינור 1.5 mL, צנטריפוגה 350 x g עבור 1 – 2 דקות, להסיר את הסופרנטנט עוזב לא יותר מ 30-40 מענה μl, מקום ב-20 ° c עבור אחסון כמה ימים) או-80 ° c לאחסון ארוך טווח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלמת נאותה של הליך זה דורשת הבנה מסוימת של אנטומיה של העכבר בחלל הבטן. זה מאפשר זיהוי הנכון של ampulla של Vater ולסדר את צינור המרה המשותף. ההליך כולו בדרך כלל לוקח 1 – 2 h. זה יעיל יותר לבודד איונים מ 4-6 עכברים באותו זמן, כך כמה דגימות יכול להיות centrifuged יחד. הזמן עבור הקטיף איון משתנה, בהתאם למספר איונים ויעילות העיכול; זה יכול לקחת בערך שעה כדי לאסוף 250 – 350 איונים מ 1 עכבר.
במאמר זה, מספר תמונות מציאותיות מאוד כלולים: איור 3 מראה את חלל הבטן של העכבר, חשיפת צינור המרה המשותף עורק הכבד. איור 4 מראה את אורך כולו של צינור המרה המשותף, שנראה להיות צבע בהיר יותר, כמו גם ampulla של vater, אשר גדול יותר מבריק ליד הצומת (שם המחט יתווספו) בין הלבלב התריסריון. מהדק ממוקם על צינור המרה המשותף צרור עורק הכבד קרוב לכבד כדי לחסום את הזרימה של הקולגנאז P לתוך הכבד. כישלון להדק את צינור המרה כראוי או הדוק מספיק יגרום דליפה ו זלוף שלם של הלבלב. איור 5 מראה את המחט מוכנס ampulla של vater לתוך צינור המרה המשותף. ברגע שהמחט נמצאת בתעלת האוורור המשותפת, מלקחיים משמשות לייצוב המחט כדי למנוע את ההדבקה בצינור האוורור. לאחר ההזרקה מתחיל, הלבלב יתחיל להתנפח מהסוף האבובי לסוף; אזור הטחול צריך להתחיל לנפח אחרי כ 1 mL של הזרקת הקולגן. זרימה אחורית לתוך המעיים יכול להוביל לאינפלציה בלתי רצויה של התריסריון; זה ניתן לתקן על ידי הקראת מיקום של המחט (למשוך אותו החוצה קצת, או להוסיף קצת עמוק יותר) ועל ידי ייצוב כראוי את המחט באמצעות מלקחיים. הזריקה נחשבת להצלחה אם כל האזורים של הלבלב הם מנופחים (האונות, הקיבה, והטחול) כפי שמוצג באיור 6. הסרת הלבלב צריך להתחיל מאזור הטחול. הלבלב המנופח חתוך לגושים באמצעות מספריים כירורגיים משובחים (איור 7A). אחרי 12 – 13 דקות העיכול וערבוב ידי טלטול ביד, ההשעיה המכילה את הרקמה נראה הומוגנית יותר (איור 7B). לאחר מכן, האיים מטוהרים על ידי מעבר הצפיפות לאחר צנטריפוגה. איור 7C מראה כי שכבת ההשעיה של איון נוצרת בין HBSS לבין הדרגתי צפיפות לאחר צנטריפוגה. איונים טובים/בריאים מופיעים כחלק בצורת עגול; רע/האיים הפגומים להראות קצוות מחוספס, רקמה אקסוקרינית מתעכל מראה צורה לא סדירה ומופיע שקוף יותר כפי שמוצג באיור 8.
איור 1: כלים כירורגיים.
מספריים כירורגיים מעוקלים, מלקחיים זכוכית מכסה, מלקחיים מיקרו Adson, מלקחיים מעוקל, מספריים כירורגיים קטנים, ו שוורץ מיקרו סרזקק (מלחציים microvascular) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור סכמטי של הפרוטוקול.
הצעדים הקריטיים ביותר של הליך זה הם הדרך של צינור המרה המשותף ליד הכבד, והזרקת הקולגן באמצעות ampulla של Vater לתוך צינור המרה המשותף כדי לעכל את הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום צינור המרה המשותף.
מלקחיים להחזיק את צינור המרה המשותף צרור עורק הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איור של צינור המרה המשותף ampulla של Vater.
מהדק ממוקם על צינור המרה המשותף צרור עורק הכבד ליד הכבד. החצים השחורים מצביעים על ampulla של Vater שבו המחט תתווסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הצינורית של צינור המרה המשותף.
לאחר הצינורית הנכונה של צינור המרה המשותף, ampulla של Vater מוזרק עם טריגונה כחול (למטרת הדגמה בלבד) כדי להדגיש טוב יותר את המיקום של צינור המרה המשותף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: לבלב מנופח לחלוטין.
הקו המנוקד מראה את הגבול של הלבלב המלא. מלקחיים להחזיק את האזור הטחול שבו האיים מרוכזים ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: בידוד איון ושלבי טיהור.
(א) מכנית פיסות רקמה קצוץ של לבלב לפני העיכול. (ב) לבלב מתעכל-השעיית רקמה הומוגנית של קולגן הלבלב לאחר 13 דקות של דגירה באמבט מים רועד ב 37 ° c, ואחריו 30 s ערבוב ביד. (C) שכבת ההשעיה של איון נוצר בין HBSS ומעבר הדרגתי צפיפות לאחר צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מייצגים של תמונות איון מתוך תא הזריחה-Imager.
(A) האיים הטובים, איונים רעים ורקמות אקסוקרינית נראים. (ב) מוצג מקבץ של איונים טובים. (ג) הפאנל מראה רקמה אקסוקרינית מעוסרת מחובר איון טוב. איונים טובים/בריאים מציגים קצוות עגולים וחלקים, המסומנים באות האדומה "G"; איונים פגומים/פגועים מראים צורה לא סדירה וקצוות גסים, ומצוינים באמצעות אות כחול "B". רקמות אקסוקרינית מתעכלים להופיע שקוף, לעתים קרובות מצורף איונים, והם מצוינים על ידי האות הירוק "E". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה כולל קולגן הפרזיה ועיכול, ואחריו טיהור של איונים. הצעדים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם הזרקה יעילה זלוף השלם של הלבלב1,4,7. שיטת המסירה של פרוטוקול זה מאפשרת לאנזים לחצות את המסלולים האנטומיים כדי לעכל טוב יותר את רקמת אקסוקרינית המקיפים את איונים1. בנוסף, טכניקה זו מתאימה היטב לעיכול מוחלט של אזור הטחול, אשר הריכוז הגבוה ביותר של איונים4,6. פרוטוקול זה, עם זמן העיכול מבוקר ושלבי הטיהור שבוצעו בקפידה, יכולים לייצר 250 – 350 איונים בריאים. האיים הבודדים מהפרוטוקול זה השתמשו בהצלחה כדי לחקור הפרשת אינסולין מגורה הפרשות לשעבר vivo12. מן הניסיון שלנו, הפרשת אינסולין גדל 4-קיפול על גירוי גלוקוז גבוה (22.2 mM) לעומת בסיס הבסיס (3.3 mM) לאחר הדגירה של הלילה 5.5 מ"מ המכיל RPMI-1640 מדיה מלאה. ההישרדות/פונקציונליות של איונים תחת דגירה ממושכת (2 – 7 ימים) לא נבדקו.
למרות שהפרוטוקול המוצג כולל הערות מפורטות והדגמות חזותיות, יש צורך בהתאמות מסוימות כדי להשיג את התנאים האופטימליים לתשואה גבוהה ולאיים באיכות גבוהה. שתי הבעיות השכיחות ביותר שעלולות לעכב את ההצלחה הם צינורית לא נאותה של האמפוללה של הוואטר או ניקוב בשוגג של תעלת האוורור. כדי למנוע אלה, יש להבטיח כי האתר של חדירה היא בדיוק איפה ampulla פוגש את התריסריון. אזור זה הוא גדול וקל יחסית לזהות, אשר מאפשר דקירות מרובות מבלי להתפשר ברצינות על השלמות של צינור. פעם בתוך ampulla, את הכיוון של המחט צריך להיות מקביל עם הצינור ולא בזווית. בשלב זה, לדחוף את המחט לתוך תעלת האוורור על 1/4 של אורך הצינור, ולאחר מכן לייצב את המחט עם מלקחיים בזמן הזרקת הקולגן באיטיות; זה יעזור למנוע את המחט מפני כיפוף תחת הלחץ ובטעות לכופף את הצינור. בעיות אחרות עשויות לכלול מעל או מתחת לעיכול של הלבלב; זה עשוי לדרוש שינוי מבוסס על גיל, זן ומין של העכברים. איונים פגומים עקב עיכול יתר (אנזימטי ומכני) או חשיפה ממושכת למעבר הצפיפות עלול להתרחש. אלה הן בעיות נפוצות הקיימות עבור שיטות דומות; כמה התאמות קטין צריך להניב שיפורים משמעותיים. הצעה בעת התמודדות עם נושאים מסוג זה היא לבחור משתנה אחד כדי לשנות בכל פעם (למשל, זמן עיכול או ריכוז של הקולגן).
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא תוואי של משלוח אנזימים: לאחר שהקולגיראז P לעכל ישירות את הלבלב אקסוקרינית באמצעות תוואי אנטומי קל יותר אשר מגביר את יעילות העיכול1. שיטה זו דווחה כדי להניב גידול של 50% במספר איונים לעומת השיטה של הסוואת הלבלב, חיתוך אותו, וחשיפת אותו לקולגאז13. פרוטוקול זה דורש רק שימוש במילוי צפיפות בודד, מה שהופך אותו לפחות משמעותי בעבודה וחסכוני יותר, לעומת שיטות אחרות הדורשות הכנת מעברי צבע מרובים בצפיפויות שונות, או הקומפלקס שיטת חלחול הדורשת זמן נוסף1,8,11. שיטת מעבר הצבע המועסקים בפרוטוקול זה יש גם להשתמש בבידוד איון על ידי אחרים4. שיטה זו של בידוד איון מספק את המדען עם כלי משופר עבור לימוד איונים הלבלב. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה כוללים שינוי כדי לשפר את היעילות בעת התמודדות עם עכברים סוכרתית. כמו לעשות ואח ' הבחינו, עכברים סוכרתית, בהתאם לרמות הגלוקוז, תשואה פחות איונים (פחות מ 100), עם גודל מופחת והמראה של איונים4. הבחנו בתופעה זו והאמנו שאיונים סוכרתית פגיעים יותר לעיכול אנזימטי ומכני המחייב טיפול מיוחד. בנוסף, צפיפות איון עשוי לשנות את הופעתו הדרגתי של צפיפות, אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול יעזור להגדיל את התשואה של איונים סוכרתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה לגברת ג'ניפר Munguia להמחשה האמנותית של התרשים הסכימטי. אנו מודים למר מייקל ר. הוניג בתחנת הרדיו הציבורית של יוסטון, KPFT לקבלת סיוע מערכתי. מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת #1 -15-BS-177 (YS), ו-NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1010840 (YS) ו R01 DK095118 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
