Summary
Dette Holme isolasjons protokollen beskrev en roman rute av kollagenase injeksjon å fordøye eksokrin vev og en forenklet gradient prosedyre for å rense holmer fra mus. Det innebærer enzymatisk fordøyelse, gradient separasjon/rensing, og Holme hånd-plukking. Vellykket isolering kan gi 250 – 350 høy kvalitet og fullt funksjonelle holmer per mus.
Abstract
Bukspyttkjertelen holmer, også kalt holmer Langerhans, er en klynge av endokrine celler som produserer hormoner for glukose regulering og andre viktige biologiske funksjoner. Holmer består hovedsakelig av fem typer hormon-sekresjon celler: α celler skiller glukagon, β celler skiller ut insulin, δ celler skiller somatostatin, ε celler skiller ghrelin, og PP celler skiller bukspyttkjertelen polypeptid. 60 til 80% av cellene i holmer er β-celler, som er den viktigste cellen befolkning å studere insulin sekresjon. Bukspyttkjertelen holmer er et avgjørende modell system for å studere ex vivo insulin sekresjon. Anskaffe høy kvalitet holmer er av stor betydning for diabetes forskning. De fleste Holme isolasjon prosedyrer krever teknisk vanskelig å få tilgang til stedet for kollagenase injeksjon, harde og komplekse fordøyelsen prosedyrer, og flere tetthet gradient rensing trinn. Dette papiret har en enkel High Yield Mouse Holme isolasjon metode med detaljerte beskrivelser og realistiske demonstrasjoner, som viser følgende konkrete skritt: 1) injeksjon av kollagenase P ved ampulle av Vater, et lite område som ble med i bukspyttkjertelen duct og den vanlige galle duct, 2) enzymatisk fordøyelse og mekanisk separasjon av eksokrin bukspyttkjertel, og 3) en enkelt gradient rensing trinn. Fordelene med denne metoden er injeksjon av fordøyelsesenzymer ved hjelp av mer tilgjengelig ampulle av Vater, mer komplett fordøyelse ved hjelp av kombinasjon av enzymatisk og mekaniske tilnærminger, og en enklere enkelt gradient rensing trinn. Denne protokollen produserer ca. 250 – 350 holmer per mus. og holmer er egnet for ulike ex vivo-studier. Mulige begrensninger i denne prosedyren er potensielt skadede holmer på grunn av enzymatisk fordøyelse og/eller forlenget gradient inkubasjons, som alle kan i stor grad unngås ved forsiktig annonse begrunnelse av inkubasjonstid.
Introduction
Det er to vanlige metoder i litteraturen for bukspyttkjertel-Holmen isolasjon. Man krever excising bukspyttkjertelen og dicing den i små biter ved hjelp av kirurgisk saks, og deretter fordøye det i en kollagenase løsning1,2,3. En annen mer presis metode er å bruke nettverket av kanaler til stede i bukspyttkjertelen for å innføre fordøyelsesenzymer. Følgende områder har blitt brukt for fordøyelsesenzymer injeksjon: krysset av galle og cystisk duct, galleblæren til felles galle duct, eller vanlig galle duct seg1,4,5. Det er kjent at holmer ikke fordeles jevnt i bukspyttkjertelen; den milt regionen inneholder de fleste holmer6. Mens den andre metoden ved hjelp av anatomiske ruter for å levere fordøyelsesenzymer gir en mer fullstendig behandling av bukspyttkjertelen, inkludert milt regionen, krever denne prosedyren ofte klemmer eller suturing av ampulle av Vater som er teknisk Utfordrende. I form av Holme rensing, flere tetthet graderinger, samt celle siler og magnetisk tilbaketrekking har blitt brukt til å rense holmer3,7. Utnyttelsen av disse gradienter kan være tidkrevende og Ficoll graderinger kan føre til giftige skader av holmer8.
Den gjeldende protokollen er bygget på metoden beskrevet av Li et al.7, med ytterligere modifikasjoner lagt til basert på erfaringene fra oss selv og andre1,4. De mest kritiske trinnene i vår protokoll er klemmer av felles galle duct nær leveren slutten, sprøytebruk kollagenase P via ampulle av Vater å fordøye eksokrin vev, og deretter bruke en risting vannbad å fremskynde fordøyelsen mekanisk1, 4,7. Deretter brukes en "STOP"-løsning for å hemme ytterligere fordøyelse av holmer; HBSS brukes til å vaske av gjenværende kollagenase P og STOP-løsning. Da Ficoll-metoden ble brukt til å rense menneske holmer, ble det rapportert at det var dobbelt så mange holmer med større funksjonell kapasitet (f.eks. insulin sekresjon) sammenlignet med bruken av Percoll graderinger9. Men studier har stilt spørsmål ved bruk av Ficoll gradient på grunn av sin giftige effekt på holmer1,10. Det har blitt rapportert at Histopaque gradient gir optimal rensing Kinetics for mus Holmen isolasjon, noe som gir god avkastning av høy kvalitet holmer med enklere trinn og lavere kostnad1. I vår protokoll, Histopaque-1077 brukes til å rense holmer fra andre rester av vev8,11. De høstes holmer kan være kultivert i komplett RPMI-1640 Media, eller direkte benyttet i RNA/protein kvantifisering.
Vår protokoll, ved hjelp av en kombinasjon av kollagenase P fordøyelsen og en enkelt gradient rensing trinn, er enklere enn andre publiserte protokoller. Vår metode krever ikke krevende kirurgiske prosedyrer og har bare noen få enkle trinn. Enda viktigere, gir denne protokollen konsekvent en god avkastning av høy kvalitet funksjonelle holmer (250-350/mus) som vi rapporterte12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det dyr bekymre og bruk komité (ACUC) av Texas en & M universitet. Den kirurgiske verktøy trenger er vist i figur 1 og skjematisk diagram av prosedyren er vist i figur 2.
1. løsninger
- Forbered Hank ' s balansert salt Solution (HBSS) ved å legge 100 mL på 10X HBSS (fra lager) til 900 mL destillert vann for å lage 1 L HBSS (1X).
- Forbered STOP-løsning (må gjøres friskt og bør brukes innen 1 time) ved å tilsette 50 mL av 100 x FBS-serum til 450 mL med iskald 1X HBSS; Dette gjør 500 mL STOP-løsningen. Oppbevar STOP-løsningen ved 4 ° c.
- Klargjør kollagenase P-løsning (må gjøres friskt innen 1 time etter bruk) ved å tilsette 1 mg/mL kollagenase P til iskald 1X HBSS; Bruk 6 mL/mus.
- Legg 0,05% (w/v) storfe serum albumin (BSA) til kollagenase P-løsning (dette gir næringsstoffer til de isolerte holmer). Bruk for eksempel 3 mg BSA i 6 mL kollagenase P-løsning. Hold på isen.
- Beregn og Forbered mengden av kollagenase P nødvendig for alle mus i 1 50 mL tube.
- Forbered komplett RPMI 1640 medium ved å legge til 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, INS-1 celle supplement (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat og 0,05 mM 2-mercaptoethanol) til 500 mL RPMI 1640 medier som inneholder 5,5 mM glukose som skal brukes for overnatting kultur og inkubasjons.
2. forberedelse
- Fyll 3 50 mL rør av 25 mL RNase hemmende oppløsning, 70% etanol eller destillert H2O. Disse løsningene vil bli brukt til rengjøring av kirurgiske verktøy før og under prosedyren.
- Sug tipsene av verktøyene i RNase hemme løsning for 30 min før du starter protokollen; Dette eliminerer eventuelle potensielle RNase på verktøy.
- Pre-cut absorberende pads til 6 i x 6 i størrelse for bruk under operasjonen.
- Forbered 1X HBSS-løsning på forhånd og oppbevar ved 4 ° c. Forbered STOP-løsning før operasjon. Oppbevares ved 4 ° c.
- Forbered kollagenase P løsning umiddelbart før kirurgi og lagre på isen.
Merk: Dette bør brukes innen 2 timer forberedelser. - Label 50 mL rør for fordøyelsen og rensing; forberede 2 rør for hver mus, en for fordøyelsen og den andre for Holme rensing. Kontroller at dyre-ID-en er på begge rørene.
- Tilsett 3 mL kollagenase P-løsning i det første 50 mL røret. De resterende 3 mL kollagenase P vil bli injisert.
- Trekk de resterende 3 mL kollagenase oppløsning til en 3 mL sprøyte montert med 30 G 1/2 i nålen. Plasser sprøyten på is.
3. prosedyre
- Fjern alle verktøyene fra RNase hemme løsning, og dypp dem først i røret med 70% etanol, deretter i røret som inneholder destillert H2O, deretter luft-tørt på rent papir håndkle.
- Plasser musen i et kammer som inneholder 0,5 mL isoflurane til musen er dypt anesteserte.
- Fjern musen fra kammeret og sjekke tilstanden til anestesi ved å knipe en fot pad med pinsett. Deep bedøvelsen er basert på observasjon at pusten blir stadig treg og musen er unreactive til fots knipe. Etter å ha bekreftet at musen er dypt anesteserte, euthanize musen med cervical forvridning, og deretter plassere musen på absorberende pad.
- Plasser anesteserte musen på magen, legge press på nakken og dislocating ryggsøylen fra hjernen ved å trekke halen.
- Tape lemmer av musen i liggende posisjon til absorberende pad, spray kroppen med 70% etanol, og tørk overflødig av overflødig etanol.
- Bruk cover glass tang og buet kirurgisk saks for å gjøre snitt. Først lage en horisontal snitt på huden av abdominal området (~ 3 cm), trekke huden vidåpne å utsette bukveggen. Deretter lage en vertikal snitt (~ 3-4cm) på abdominal peritoneum å fullt utsette bukspyttkjertelen i bukhulen (Figur 3).
- Skyv fliker av leveren superiorly å utsette gallekanalen, vil det vises som en blek rosa Tube (Figur 3).
- Forsiktig flytte tarmen fra høyre korsrygg/iliaca regionen i bukhulen til høyre, utsette galle duct og hepatic arterien (Figur 3).
- Klem forsiktig den vanlige gallekanalen ved hjelp av Schwartz Micro serrefines (figur 1) så nær leveren som mulig.
- Identifiser ampulle av Vater, som ligger på duodenalsår papilla, dannet av foreningen av bukspyttkjertelen duct og felles galle duct. Ampulle av Vater vises hoven når den vises under et disseksjon mikroskop som er inngangspunktet til felles galle duct (Figur 4).
Merk: justering av intensiteten/vinkelen på lys av disseksjon mikroskop kan gjøre det lettere å finne. - Sett inn sprøyten med 3 mL kollagenase P-løsning i ampulle på Vater. Skyv nålen inn i kanalen i ca 1/4 av lengden av den felles galle duct (ampulle fører inn duct) som vist i figur 5.
- Når nålen er i ampulle, sørg for at retningen på nålen er slik at den er parallell med røret.
- Stabilisere nålen ved å klemme med mikro Adson tang for å hindre at den punktering kanalen (figur 5).
- Injiser langsomt og jevnt 3 mL av den kollagenase P-løsningen fra sprøyten og inn i den felles gallekanalen (nok til å føle motstand) som vist i figur 6. Målet er å skape tilbakestrømning press for å tvinge kollagenase til å gå inn i bukspyttkjertel kanalen. Injeksjon anses vellykket hvis hodet, nakke, kropp og hale regionen i bukspyttkjertelen er alle fullt oppblåst.
Merk: Holmen yield vil være lav Hvis enten bukspyttkjertelen ikke er helt oppblåst, eller milt området er ikke helt oppblåst. Det milt området inneholder det høyeste antallet holmer6. Inflasjon kan bekreftes av utseendet av åpne mellomrom mellom bukspyttkjertelen vev som er fylt med løsning. - Forsiktig analysere ut oppblåst bukspyttkjertelen og legg den i en 50 mL fordøyelsen tube inneholder 3 mL iskald kollagenase P løsning.
- Fjern bukspyttkjertelen ved hjelp av 2 tang (buet og Micro Adson; Se figur 1): (fra milten, trekk bukspyttkjertelen bort fra milten og fortsette å fjerne fra magen og langs tolvfingertarmen.
Merk: ingen snitt kreves. - Chop bukspyttkjertel for 3-5 s i fordøyelsen tube med 3 mL iskald kollagenase P løsning ved hjelp av fin kirurgisk saks (figur 7a).
- Fjern bukspyttkjertelen ved hjelp av 2 tang (buet og Micro Adson; Se figur 1): (fra milten, trekk bukspyttkjertelen bort fra milten og fortsette å fjerne fra magen og langs tolvfingertarmen.
- Fest røret til et stativ i 37 vannbad og rist ved 100 – 120 RPM i ca. 12 – 13 min.
- Etter inkubasjons, rist rørene forsiktig for hånd for å forstyrre vevet til kollagenase P fordøyelsen blir homogen (figur 7b). Homogenitet bekreftes av et sand-lignende utseende av fine partikler av bukspyttkjertelen. Om 30 s av skånsom hånd risting er vanligvis nok. Hold røret opp til lys for å undersøke om vevet er godt homogenisert; riste for en annen ~ 15 s om nødvendig.
- Når fordøyd, umiddelbart plassere rørene på is og tilsett 40 mL iskald stopp løsning for å avslutte enzymatisk fordøyelsen.
Merk: på dette punktet fordøyelsen rørene kan stå på isen opp til 2 h, hvis du arbeider på flere mus. - Sentrifuger røret i en svingende-bøtte sentrifuger på 300 x g for 30 s (temperaturen på sentrifuge er fleksibel).
Merk: Bruk en svingende-bøtte sentrifuge slik at vevet pellet er dannet på bunnen av 50 mL røret og ikke på veggen av røret; Dette er avgjørende for bedre Holme yield. - Dekanter og gjenta sentrifugering med STOP-løsning 2 ganger til, decanting løsningen etter hvert spinn. Bruk 20 mL STOP-oppløsning for hver påfølgende vask.
- Før hvert spinn, forstyrre pellet ved forsiktig risting vevet pellet i 50 mL rør i 20 mL stopp løsning.
- Re-suspendere vevet pellet med 40 mL iskald HBSS og sentrifuge ved 300 x g for 30 s.
- Dekanter og gjenta sentrifugering med en svingende-bøtte sentrifuge med HBSS-oppløsning to ganger til, decanting løsningen etter hvert spinn. Bruk 20 mL HBSS for hver vask.
- Før hvert spinn, forstyrre pellet, å løsne den fra bunnen av røret ved forsiktig risting røret som inneholder 20 mL HBSS løsning.
- Etter siste sentrifugering fjerne alle HBSS.
- Deretter legger du til 5 mL romtemperatur tetthet gradient til 50 mL rør som inneholder pellet. Vortex kort med lav hastighet til homogenisert.
- Tilsett ytterligere 5 mL av romtemperatur tettheten gradient til 50 mL røret. Ikke Vortex/mix.
Merk: det er viktig å holde seg stødig og fortsatt slik at bedre gradient å danne uten avbrudd. - Pipetter 10 mL romtemperatur HBSS buffer inn i røret (som inneholder tettheten gradient), drop-by-drop forsiktig og langsomt for å tillate en gradient å danne. Bruk en pipette pistol med en 10 mL pipette for å legge til HBSS dråpevis.
- Ved hjelp av en svingende-bøtte sentrifuge, spin rør på 1700 x g i 15 min. Sørg for å endre hastigheten på både akselerasjon/retardasjon til den laveste innstillingen for å opprettholde gradient (figur 7C).
- Etter spin, forsiktig fjerne rørene uten å forstyrre gradient. Ved hjelp av en pipette pistol pre-fuktet med kaldt HBSS (pipette HBSS opp og ned), Pipetter ut laget av holmer (5 – 10 mL) dannet mellom tettheten gradient og HBSS inn i den nye 50 mL Holme samling tube.
Merk: det er nyttig å fukte pipette med kaldt HBSS før pipettering av holmer for å hindre at holmer stikker til de indre veggene i pipette.- I tilfelle separasjon er ufullstendig, holmer ville være synlig i tettheten gradient lag, pipette ut hele 10 mL av tettheten gradient (nederste lag) sammen med Holmen laget dannet i grensesnittet (bare å forlate ca 8-10 mL av HBSS øverste laget bak).
Merk: samle både Holmen laget og tettheten gradient lag (nederste lag) kan resultere i innsamling av rusk som kan forlenge Holmen plukke tid, men ingen andre tiltak vil bli endret. Samle begge disse lagene er ikke nødvendig når Holme laget er godt dannet.
- I tilfelle separasjon er ufullstendig, holmer ville være synlig i tettheten gradient lag, pipette ut hele 10 mL av tettheten gradient (nederste lag) sammen med Holmen laget dannet i grensesnittet (bare å forlate ca 8-10 mL av HBSS øverste laget bak).
- Tilsett 20 mL iskald HBSS til den nye 50 mL rør inneholdende holmer, deretter sentrifuger ved 350 x g i 3 min i en svingende-bøtte sentrifuge.
- Etter spin, forsiktig pipette (ikkeDekanter) ut supernatanten (la ~ 3 ml nederst) uten å forstyrre pellet med holmer nederst. Kast supernatanten.
- Gjenta vask og sentrifugering minst 3 ganger. Tilsett 20 mL HBSS hver gang, og sørg for å suspendere pellet før hvert spinn.
- Varm opp RPMI-1640 med en komplett medie flaske i et vannbad ved 37 ° c før bruk. Etter den siste sentrifugering, fjerne alle HBSS og tilsett 4 mL tidligere forberedt komplett RPMI-1640 Media (inneholder FBS, INS-1 celle supplement og penicillin/Streptomycin) til pellet.
- Løsne pellet ved forsiktig virvlende røret og umiddelbart helle RPMI-1640 Media i en 100 mm Petri parabolen. Tilsett ytterligere 5 mL RPMI-1640 Media til røret og roter det forsiktig for å vaske av eventuelle gjenværende holmer, og hell deretter mediet i samme Petri-rett.
- Under et disseksjon mikroskop, plukke sunne holmer fra Petri parabolen ved hjelp av en 20 μL pipette, og legg dem i en ny Petri parabolen inneholder 10 mL komplett RPMI 1640 Media. Sett under et disseksjon mikroskop, holmer skal vises sfærisk/av lang og gylden-brun farge med en glatt overflate i forhold til den relativt gjennomsiktige, pistrete eksokrin vev.
Merk: forstørrelse av disseksjon mikroskop er vanligvis innstilt på 12,5 – 16x. Islet yield vil variere avhengig av ulike faktorer, inkludert belastning, alder og kjønn på musen. Denne protokollen gir vanligvis 250-350 friske holmer fra sunne C57BL/6J mus alder 4-10 måneder gammel.
- Under et disseksjon mikroskop, plukke sunne holmer fra Petri parabolen ved hjelp av en 20 μL pipette, og legg dem i en ny Petri parabolen inneholder 10 mL komplett RPMI 1640 Media. Sett under et disseksjon mikroskop, holmer skal vises sfærisk/av lang og gylden-brun farge med en glatt overflate i forhold til den relativt gjennomsiktige, pistrete eksokrin vev.
- Ruge de holmer i en steril inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 infusjon og 95% fuktet luft over natten for eksperimenter neste dag, eller fryse holmer for ønsket analyse på et senere tidspunkt.
- Når holmer er frosset, kan de ikke brukes til sekresjon analyser, bare RNA eller protein kvantifisering. For å samle celler for å fryse, plassere dem i HBSS buffer, samle alle holmer i 200 – 500 μL av buffer, overføring til 1,5 mL rør, sentrifuger 350 x g for 1 – 2 min, Fjern supernatanten som etterlater ikke mer enn 30 – 40 μL oppløsning, plass i-20 ° c for korttidslagring ( flere dager) eller-80 ° c for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig gjennomføring av denne prosedyren krever en viss forståelse av musen anatomi i bukhulen. Dette gjør det mulig for riktig identifisering av ampulle av vater og klemme av felles galle duct. Hele prosedyren tar normalt 1 – 2 timer. Det er mer effektivt å isolere holmer fra 4 – 6 mus samtidig, så flere prøver kan sentrifugert sammen. Tiden for Holme-plukking varierer, avhengig av antall holmer og effektiviteten av fordøyelsen; Det kan ta omtrent en time å velge 250 – 350 holmer fra 1 mus.
I dette papiret, en rekke svært realistiske bilder er inkludert: Figur 3 viser bukhulen av musen, utsette felles galle duct og hepatic arterien. Figur 4 viser hele lengden av felles galle duct, som synes å være en lysere farge, samt ampulle av Vater, som er større og blankere nær tidspunktet (der nålen vil bli satt inn) mellom bukspyttkjertelen og tolvfingertarmen. En klemme er plassert på felles galle duct og hepatic arterien bunt nær leveren til å blokkere av flyten av kollagenase P til leveren. Unnlatelse av å klemme gallekanalen riktig eller stramt nok vil resultere i lekkasje og ufullstendig mengde av bukspyttkjertelen. Figur 5 viser nålen inn i ampulle av Vater inn i felles gallekanalen. Når nålen er i felles duct, tang brukes til å stabilisere nålen for å hindre den fra punktering kanalen mens sprøytebruk. Når injeksjonen begynner, vil bukspyttkjertelen begynne å hovne opp fra proksimale ende til den er på slutten; milt regionen skal begynne å blåse etter ca 1 mL kollagenase injeksjon. Tilbakestrømning i tarmen kan føre til en uønsket inflasjon av tolvfingertarmen; Dette kan rettes opp ved å justere plasseringen av nålen (trekke den ut litt, eller sett litt dypere) og ved riktig å stabilisere nålen ved hjelp av tang. Injeksjonen er betraktet som en suksess hvis alle regioner i bukspyttkjertelen er oppblåst (duodenalsår, mage og milt fliker) som vist i figur 6. Fjerning av bukspyttkjertelen bør begynne fra milt regionen. Den oppblåste bukspyttkjertelen er hakket i biter med fin kirurgisk saks (figur 7a). Etter 12 – 13 min fordøyelse og miksing ved hånd risting, ser den vevet inneholdende suspensjonen mer homogen (figur 7b). Deretter blir holmer renset av tettheten gradient etter sentrifugering. Figur 7C viser at en Holme suspensjon lag DANNES mellom HBSS og tettheten gradient etter sentrifugering. Gode/sunne holmer vises som glatt rund-formet; dårlig/skadet holmer viser ujevne kanter, og ufordøyd eksokrin vev viser uregelmessig form og vises mer gjennomskinnelig som vist i Figur 8.
Figur 1: kirurgiske verktøy.
Buet kirurgisk saks, dekkglass tang, mikro Adson tang, buet tang, liten kirurgisk saks, og Schwartz Micro serrefines (mikrovaskulær klemme) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk illustrasjon av protokollen.
De mest kritiske trinnene i denne prosedyren er klemme av felles galle duct nær leveren, og sprøytebruk kollagenase P via ampulle av Vater til felles galle duct å fordøye bukspyttkjertelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: plassering av felles galle duct.
Tang holde opp felles galle duct og hepatic arterien bunt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: illustrasjon av felles galle duct og ampulle av Vater.
En klemme er plassert på felles galle duct og hepatic arterien bunt nær leveren. De svarte pilene peker på ampulle til Vater hvor nålen skal settes inn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kanyleringen av felles galle duct.
Etter riktig kanyleringen av felles galle duct, ampulle av Vater injiseres med trypan blå (for demonstrasjon formål) for å bedre understreke plassering av felles galle duct. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: fullt oppblåst bukspyttkjertel.
Den stiplede linjen viser grensen til fullt perfusert bukspyttkjertel. Tang holder opp milt regionen der holmer er mest konsentrert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Holme isolasjon og rensing trinn.
(A) mekanisk hakket vev biter av bukspyttkjertel før fordøyelsen. (B) fordøyd bukspyttkjertel-homogen vev suspensjon av kollagenase-perfusert bukspyttkjertel etter 13 min av inkubasjons i et risting vannbad ved 37 ° c, etterfulgt av 30 s av miksing for hånd. (C) Islet suspensjon lag DANNES mellom HBSS og tettheten gradient etter sentrifugering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: representative Holme bilder fra fluorescens Cell-Imager.
(A) gode holmer, dårlige holmer og eksokrin vev blir sett. (B) en klynge av gode holmer vises. (C) panel viser ufordøyd eksokrin vev festet til en god Holme. Gode/sunne holmer viser jevne, runde kanter, indikert med den røde bokstaven "G"; dårlig/skadet holmer viser uregelmessig form og grove kanter, og er indikert med blå bokstaven "B". Ufordøyd eksokrin vev vises gjennomskinnelig, ofte festet til holmer, og er indikert med grønn bokstav "E". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen inkluderer kollagenase og fordøyelse, etterfulgt av rensing av holmer. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er effektiv injeksjon og fullstendig mengde av bukspyttkjertelen1,4,7. Leveringsmetoden for denne protokollen gjør at enzymet å krysse anatomiske ruter for å bedre fordøye eksokrin vevet rundt holmer1. I tillegg er denne teknikken velegnet for fullstendig fordøyelse av milt-regionen, som har den høyeste konsentrasjonen av holmer4,6. Denne protokollen, med godt kontrollert fordøyelsen tid og nøye utført rensing trinn, kan produsere 250-350 friske holmer. Holmer isolert fra denne protokollen har blitt brukt med hell å studere glukose-stimulert insulin sekresjon ex vivo12. Fra vår erfaring, insulin sekresjon økt 4-fold på høy glukose stimulering (22,2 mM) sammenlignet med Baseline (3,3 mM) etter natten inkubasjons i 5,5 mM glukose-inneholdende RPMI-1640 komplette medier. Overlevelsesevne/funksjonaliteten til holmer under lengre inkubasjons (2 – 7 dager) er ikke testet.
Selv om den presenterte protokollen inneholder detaljerte notater og visuelle demonstrasjoner, er noen justeringer som trengs for å oppnå optimale forhold for høy avkastning og høy kvalitet holmer. To vanligste problemene som kan hemme suksessen er upassende kanyleringen av ampulle av Vater eller utilsiktet punktering av kanalen. For å unngå disse, bør man sørge for at stedet for penetrasjon er nettopp der ampulle møter med tolvfingertarmen. Dette området er større og relativt lett å identifisere, noe som gjør det mulig for flere hull uten alvorlig å svekke integriteten til kanalen. En gang innenfor ampulle, bør orienteringen av nålen være parallelt med kanalen i stedet vinklet. På dette punktet, skyv nålen inn i kanalen i ca 1/4 av duct lengde, og deretter stabilisere nålen med pinsett mens langsomt sprøytebruk kollagenase; Dette vil bidra til å hindre nålen fra bøying under trykket og tilfeldigvis punktering kanalen. Andre problemer kan omfatte over-eller under-fordøyelse av bukspyttkjertelen; Dette kan kreve modifisering basert på alder, belastning og kjønn på mus. Skadede holmer på grunn av over-fordøyelsen (enzymatisk og mekanisk) eller langvarig eksponering for tettheten gradient kan forekomme. Dette er vanlige problemer som finnes for lignende metoder; noen mindre justeringer bør gi betydelige forbedringer. Et forslag når du arbeider med disse typer problemer er å velge en variabel til å endre om gangen (f. eks tid med fordøyelsen eller konsentrasjon av kollagenase).
Den største fordelen med denne protokollen er ruten for enzymet levering: å ha kollagenase P å direkte fordøye eksokrin bukspyttkjertelen ved hjelp av en enklere anatomiske ruten som øker fordøyelsen effektivitet1. Denne metoden har blitt rapportert å gi en 50% økning i antall holmer sammenlignet med metoden for excising av bukspyttkjertelen, hakking den, og utsette den til kollagenase13. Denne protokollen krever bare bruk av en enkelt tetthet gradient, noe som gjør det betydelig mindre arbeidskrevende og mer kostnadseffektivt, i forhold til andre metoder som krever utarbeidelse av flere graderinger på ulike tetthet, eller komplekse Percoll-metode som krever ekstra tid1,8,11. Den gradient metoden ansatt i denne protokollen har også brukes i Holme isolert av andre4. Denne metoden av Holme isolasjon gir forskeren et forbedret verktøy for å studere bukspyttkjertelen holmer. Fremtidige anvendelser av denne protokollen inkluderer endring for å øke effekten når du arbeider med diabetiker mus. Som do et al. har observert, diabetiker mus, avhengig av glukose nivåer, gi færre holmer (mindre enn 100), med redusert størrelse og utseende av holmer4. Vi har observert dette fenomenet og mener at diabetiker holmer er mer sårbare for enzymatisk og mekanisk fordøyelse som krever spesiell forsiktighet. I tillegg kan Holme tetthet endre sitt utseende i tettheten gradient, ytterligere optimalisering av protokollen vil bidra til å øke avkastningen av diabetiker holmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er svært takknemlige for fru Jennifer Munguia for hennes kunstneriske illustrasjon av skjematisk diagram. Vi takker Mr. Michael R. Honig på Houston ' s Community Public Radio Station KPFT for hans redaksjonelle assistanse. Denne studien ble støttet av American Diabetes Association #1 -15-BS-177 (andre), og NIH R56DK118334/R01DK118334 (andre). Dette arbeidet ble også støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1010840 (/) og R01 DK095118 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
