Summary
이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.
Abstract
Langerhans의 섬이라고도 하는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능에 대한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 섬은 주로 5가지 유형의 호르몬 분비 세포로 구성됩니다: α 세포는 글루카곤을 분비하고, β 세포는 인슐린을 분비하고, δ 세포는 소마토스타틴을 분비하며, δ 세포는 그렐린을 분비하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 분비합니다. 작은 섬에 있는 세포의 60-80%는 인슐린 분비를 공부하는 가장 중요한 세포 인구인 β 세포입니다. 췌도는 생체 내 인슐린 분비를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 고품질 섬을 확보하는 것은 당뇨병 연구에 매우 중요합니다. 대부분의 아일렛 격리 절차는 콜라게나아제 주입, 가혹하고 복잡한 소화 절차 및 다중 밀도 구배 정제 단계의 부위에 기술적으로 접근하기 어렵습니다. 이 논문은 상세한 설명과 현실적인 데모와 간단한 고수율 마우스 섬 격리 방법을 갖추고 있습니다, 다음과 같은 특정 단계를 보여주는: 1) Vater의 암풀라에서 콜라게나제 P의 주입, 췌장 덕트를 결합하는 작은 영역과 일반적인 담관, 2) 효소 소화 및 외분비 췌장의 기계적 분리, 및 3) 단일 그라데이션 정제 단계. 이 방법의 장점은 Vater의 접근성이 좋은 암풀라를 사용하여 소화 효소를 주입하고 효소 및 기계적 접근법을 사용하여 보다 완전한 소화를 하고, 더 간단한 단일 그라데이션 정제 단계입니다. 이 프로토콜은 마우스당 약 250-350개의 섬을 생성합니다. 및 섬은 다양한 생체 내 연구에 적합하다. 이 절차의 가능한 주의 사항은 효소 소화 및 / 또는 장기간 그라데이션 배양으로 인해 잠재적으로 손상된 섬이며, 이 모든 것은 인큐베이션 시간의 신중한 광고 정당화에 의해 크게 피할 수 있습니다.
Introduction
췌도 격리에 대한 문헌에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다. 하나는 췌장을 절제하고 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 다이싱 한 다음 콜라게 나아제 용액1,2,3으로소화해야합니다. 또 다른 더 정확한 방법은 소화 효소를 소개하기 위하여 췌장에 존재하는 덕트의 네트워크를 이용하는 것입니다. 다음 사이트는 소화 효소 주입에 사용되었습니다 : 담즙 과 낭포 덕트의 접합, 일반적인 담관으로 담낭,또는 일반적인 담관 자체 1,4,5. 작은 섬이 췌장에 고르게 분포되지 않은 것으로 알려져 있습니다. 비장 영역은 가장 작은섬 6을 포함합니다. 소화 효소를 전달하기 위해 해부학 경로를 사용하는 두 번째 방법은 비장 영역을 포함하여 췌장의 보다 완전한 관류를 허용하지만,이 절차는 종종 기술적으로 Vater의 암풀라의 클램핑 또는 봉합이 필요합니다. 도전. 섬 정화의 관점에서, 다중 밀도 그라데이션뿐만 아니라 세포 스트레이너 및 자기 후퇴는 섬을정화하기 위해 사용되어 왔다 3,7. 이러한 그라데이션의 활용은 시간이 많이 소요될 수 있으며 Ficoll 그라데이션은 섬8의독성 손상을 초래할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 Li et al. 7에의해 설명된 방법에 기초하여 구축되며, 우리 자신과 다른 사람의 경험을 기반으로 추가 된 수정사항1,4. 우리의 프로토콜의 가장 중요한 단계는 간 끝 의 가까이에 일반적인 담관의 클램핑, 외분비 조직을 소화하기 위하여 Vater의 ampulla를 통해 콜라게나제 P를 주입하고, 그 때 기계적으로 소화를 가속화하기 위하여 동요하는 근해를 사용하여1, 4,7. 이어서, 'STOP' 용액이 인가되어 작은 섬들의 추가 소화를 억제한다; HBSS는 나머지 콜라게나제 P 및 STOP 용액을 세척하는 데 사용됩니다. 피콜 방법이 인간 섬을 정화하는 데 사용되었을 때, 수율은 Percoll 그라데이션 9의 사용에 비해 더 큰 기능적 능력(예를 들어,인슐린 분비)을 가진 섬보다 두 배 인 것으로 보고되었다. 그러나, 연구는섬1,10에그것의 독성 효과 때문에 Ficoll 그라데이션의 사용에 의문을 제기 했다 . 히스타크 그라데이션은 마우스 섬 격리를 위한 최적의 정제 역학을 제공하는 것으로 보고되었으며, 이는 더 간단한 단계와 낮은비용으로 고품질 의 섬들의 좋은 수율을 생성한다 1. 우리의 프로토콜에서, Histopaque-1077다른 잔류 조직에서 섬을 정화하는 데사용된다 8,11. 수확된 섬은 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양되거나 RNA/단백질 정량에 직접 활용될 수 있다.
콜라게나아제 P 소화와 단일 그라데이션 정제 단계의 조합을 사용하는 당사의 프로토콜은 다른 출판된 프로토콜보다 간단합니다. 우리의 방법은 까다로운 외과 적 수술을 필요로하지 않으며 몇 가지 간단한 단계가 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 지속적으로 우리가보고 한바와 같이 고품질 기능 섬 (250-350 / 마우스)의 좋은 수율을 생산하고 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 텍사스 A&M 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에 의해 승인되었습니다. 수술 도구 의 필요성은 도 1에 나타내고 절차의 회로도 도면은 그림2에 도시되어 있습니다.
1. 솔루션
- 1L HBSS(1X)를 만들기 위해 증류수 900mL에 100mL(재고)의 100mL를 추가하여 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)을 준비합니다.
- 얼음 차가운 1X HBSS의 450 mL에 100X 태아 소 혈청 (FBS)의 50 mL을 추가하여 STOP 용액을 준비하십시오 (신선하게 만들어야하며 1 시간 이내에 사용해야합니다); 이것은 500 mL STOP 솔루션을 만듭니다. STOP 용액을 4°C로 유지합니다.
- 콜라게나제 P 용액을 얼음 차가운 1X HBSS에 1 mg/mL의 콜라게나아제 P를 첨가하여 (사용 후 1시간 이내에 신선하게 만들어야 함)을 준비하십시오. 6 mL/ 마우스를 사용합니다.
- 콜라주나제 P 용액에 0.05%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가합니다(이것은 고립된 섬에 영양분을 제공합니다). 예를 들어, 6 mL 콜라게나제 P 용액에 3 mg의 BSA를 사용하십시오. 얼음에보관하십시오.
- 하나의 50 mL 튜브에 있는 모든 마우스에 필요한 콜라게나아제 P의 양을 계산하고 준비한다.
- 10% FBS를 추가하여 완전한 RPMI 1640 매체를 준비하십시오. 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, INS-1 세포 보충제(10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루바테, 0.05 mM 2-메르카포에탄올) ~ 500 mL RPMI 1640 m를 함유하는 500 mL RPMI 1640 하룻밤 문화와 배양.
2. 준비
- 25 mL RNase 억제 용액, 70 % 에탄올 또는 증류 H2O의 3 개의 50 mL 튜브를 채웁니다. 이 해결책은 수술 전과 절차 도중 수술 도구를 청소하는 데 사용됩니다.
- 프로토콜을 시작하기 전에 RNase 억제 용액에서 도구의 팁을 30 분 동안 담그십시오. 이렇게 하면 도구의 잠재적인 RNase가 제거됩니다.
- 수술 중 사용하기 위해 흡수 패드를 6 in x 6 크기로 미리 자르면 됩니다.
- 1X HBSS 솔루션을 미리 준비하고 4°C에 보관하십시오. 수술 전에 STOP 솔루션을 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- 수술 직전에 콜라게나아제 P 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오.
참고 : 이것은 준비 2 시간 이내에 사용해야합니다. - 소화 및 정화를 위한 50 mL 관을 라벨; 각 마우스에 대해 2 개의 튜브를 준비하고, 하나는 소화를 위해, 다른 하나는 아일렛 정화를 위해 준비하십시오. 동물 ID가 두 튜브에 있는지 확인합니다.
- 처음 50 mL 튜브에 콜라게나아제 P 용액 3 mL을 넣습니다. 나머지 3 mL의 콜라게나아제 P가 주입됩니다.
- 나머지 3 mL의 콜라게나아제 용액을 바늘에 30G 1/2로 장착된 3 mL 주사기에 넣습니다. 주사기를 얼음 위에 놓습니다.
3. 수속
- RNase 억제 용액에서 모든 도구를 제거 한 다음 70 % 에탄올로 튜브에 먼저 담근 다음 증류된 H2O를 함유 한 튜브에 담근 다음 깨끗한 종이 타월에 공기 건조하십시오.
- 마우스가 깊이 마취 될 때까지 이소플루란 0.5 mL를 포함하는 챔버에 마우스를 놓습니다.
- 챔버에서 마우스를 제거하고 집게로 발 패드를 꼬집어 마취 상태를 확인합니다. 깊은 마취는 호흡이 꾸준히 느려지고 마우스가 발 꼬집기에 반응하지 않는다는 관찰에 근거를 두습니다. 마우스가 깊이 마취되어 있는지 확인한 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킨 다음 마우스를 흡수 패드에 놓습니다.
- 마취 된 마우스를 위장에 놓고 목에 압력을 가하고 꼬리를 당겨 뇌에서 척추를 분리하십시오.
- 마우스의 팔다리를 흡수 패드에 테이프로 테이프로 채우고, 70% 에탄올로 몸에 스프레이하고, 여분의 에탄올을 닦아냅니다.
- 커버 유리 집게와 곡면 수술 가위를 사용하여 절개를 합니다. 먼저 복부 영역 (~3cm)의 피부에 수평 절개를하고, 피부를 넓게 당겨 복벽을 노출시다. 그런 다음 복부 복막에 수직 절개 (~ 3-4cm)를 만들어 복강에 췌장을완전히 노출시십시오 (그림 3).
- 간엽을 우월하게 밀어 담관을 노출시켜, 옅은 분홍색 관으로 나타날것이다(도 3).
- 복강의 오른쪽 요추 /장골 부위에서 오른쪽으로 조심스럽게 내장을 이동하여 담관과 간 동맥을 노출시다(그림 3).
- 슈워츠 마이크로 세정제 (그림 1)를사용하여 일반적인 담관을 가능한 한 간가까이 조심스럽게 고정시다.
- 췌장 덕트와 일반적인 담관의 결합에 의해 형성 된 십이지장 유두에위치한 Vater의 맥풀라를 식별하십시오. 바터의 암풀라는 일반적인 담관에 진입점인 해부 현미경의 밑에 볼 때 부어나타납니다 (그림 4).
참고: 해부 현미경의 빛의 강도/각도를 조정하면 쉽게 찾을 수 있습니다. - 콜라게나제 P 용액 3 mL로 주사기를 바터의 암풀라에 넣습니다. 그림5와 같이 일반적인 담관 (암풀라 리드 덕트)의 길이의 약 1/4 동안 덕트에 바늘을 밀어 넣습니다.
- 바늘이 암풀라에 있으면 바늘의 방향이 덕트와 평행하도록하십시오.
- 마이크로 Adson 집게로 고정하여 바늘을 안정화하여 덕트에구멍을 뚫지 못하게합니다 (그림 5).
- 도6에 나타낸 바와 같이 주사기로부터 콜라게나아제 P 용액의 3 mL을 서서히 주입하여 일반적인 담관(저항을 충분히 느낄 수 있음)을 주입한다. 목표는 콜라게나제를 강제로 췌장 덕트에 진입하도록 역류 압력을 만드는 것입니다. 췌장의 머리, 목, 신체 및 꼬리 부위가 모두 완전히 팽창되면 주사가 성공한 것으로 간주됩니다.
참고: 췌장이 완전히 팽창되지 않았거나 비장 영역이 완전히 팽창되지 않으면 저수분 수율이 낮아집니다. 비장 영역은 작은 섬 6의가장 높은 수를 포함. 인플레이션은 용액으로 채워진 췌장 조직 사이의 열린 공간의 출현에 의해 확인 될 수있다. - 팽창된 췌장을 조심스럽게 해부하고 얼음처럼 차가운 콜라게나아제 P 용액 3 mL을 함유한 50 mL 소화 튜브에 넣습니다.
- 2 집게를 사용하여 췌장을 제거 (곡선 및 마이크로 Adson; 그림 1참조): (비장에서 시작하여 췌장을 비장에서 멀리 당기고 위장과 십이지장을 따라 계속 제거하십시오.
참고: 절개가 필요하지 않습니다. - 미세 한 수술 가위를 사용 하 여 얼음 차가운 콜라게 나 아 제 P 용액의 3 mL소화튜브에 3-5 s에 대 한 췌 장을 잘라 (그림 7A).
- 2 집게를 사용하여 췌장을 제거 (곡선 및 마이크로 Adson; 그림 1참조): (비장에서 시작하여 췌장을 비장에서 멀리 당기고 위장과 십이지장을 따라 계속 제거하십시오.
- 튜브를 37°C 수조랙에 고정하고 100-120rpm에서 약 12-13분 동안 흔들어 줍니다.
- 배양 후, 콜라게나제 P 소화액이 균질해질 때까지 튜브를 손으로 흔들어 조직을 교란시다(도7B). 균질성은 췌장의 미세 입자의 모래 모양에 의해 확인된다. 약 30 s의 부드러운 손 떨기는 대개 충분 합니다. 튜브를 빛까지 잡고 조직이 잘 균질화되었는지 검사합니다. 필요한 경우 다른 ~ 15 s를 위해 흔들어주세요.
- 일단 소화되면, 즉시 얼음에 튜브를 놓고 효소 소화를 종료얼음 차가운 STOP 용액의 40mL를 추가합니다.
참고 : 이 시점에서 소화 튜브는 여러 마우스에서 작업하는 경우, 2 시간까지 얼음에 남아있을 수 있습니다. - 30s에 대한 300 x g의 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기 (원심 분리기의 온도는 유연합니다).
참고 : 조직 펠릿이 튜브의 벽이 아닌 50 mL 튜브의 바닥에 형성되도록 스윙 버킷 원심 분리기를 사용하십시오. 이것은 더 나은 아일렛 수율에 매우 중요합니다. - STOP 용액으로 원심분리를 2회 더 반복하고 각 스핀 후 용액을 디캔팅합니다. 이후세척시 20mL의 STOP 용액을 사용하십시오.
- 각 스핀 전에, 20 mL STOP 용액에서 50 mL 튜브에서 조직 펠릿을 부드럽게 흔들어 펠릿을 중단시다.
- 40 mL의 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기를 30 초 동안 300 x g에서 조직 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- HBSS 용액을 사용하여 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 원심분리를 두 번 더 반복하고 각 스핀 후에 용액을 디캔팅합니다. 각 세척시 20 mL의 HBSS를 사용하십시오.
- 각 스핀 전에 펠릿을 분리하여 20 mL HBSS 용액을 함유 한 튜브를 부드럽게 흔들어 튜브 바닥에서 분리하십시오.
- 마지막 원심분리 후 모든 HBSS를 제거합니다.
- 그런 다음 펠렛을 함유하는 50 mL 튜브에 실온 밀도 구배 5 mL을 추가합니다. 소용돌이가 균질화 될 때까지 저속으로 잠시.
- 50 mL 튜브에 실온 밀도 그라데이션의 또 다른 5 mL을 추가합니다. 소용돌이/혼합하지 마십시오.
참고: 더 나은 그라데이션이 중단 없이 형성될 수 있도록 안정적이고 여전히 유지하는 것이 중요합니다. - 피펫 10 mL의 실온 HBSS 버퍼튜브(밀도 그라데이션 포함)는 그라데이션이 형성될 수 있도록 부드럽고 천천히 투하한다. 10mL 파이펫이 있는 파이펫 건을 사용하여 HBSS 를 드롭와이즈로 추가합니다.
- 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 15분 동안 1700 x g의 스핀 튜브를 사용하십시오.
- 스핀 후 그라데이션을 방해하지 않고 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 차가운 HBSS(파이펫 HBSS)로 미리 적은 파이펫 건을 사용하여 밀도 그라데이션과 HBSS 사이에 형성된 아일렛 층(5-10mL)을 새로운 50mL 아일렛 수집 튜브로 피펫을 꺼냅니다.
참고: 작은 섬이 파이펫의 내부 벽에 달라붙지 않도록 섬을 파이펫팅하기 전에 차가운 HBSS로 파이펫을 적시면 도움이 됩니다.- 분리가 불완전한 경우, 섬은 밀도 그라데이션 층에서 볼 수 있을 것이고, 피펫은 인터페이스에 형성된 섬 층과 함께 밀도 그라데이션(bottom layer)의 전체 10 mL을 밖으로 내보피낼 것이다(HBSS 최상위 층의 약 8-10 mL만 뒤에 남을 뿐).
참고: 아일렛 레이어와 밀도 그라데이션 레이어(하단 레이어)를 모두 수집하면 이물질이 수집되어 아일렛 피킹 시간이 길어질 수 있지만 다른 단계는 변경되지 않습니다. 아일렛 층이 잘 형성될 때 이러한 레이어를 모두 수집할 필요는 없습니다.
- 분리가 불완전한 경우, 섬은 밀도 그라데이션 층에서 볼 수 있을 것이고, 피펫은 인터페이스에 형성된 섬 층과 함께 밀도 그라데이션(bottom layer)의 전체 10 mL을 밖으로 내보피낼 것이다(HBSS 최상위 층의 약 8-10 mL만 뒤에 남을 뿐).
- 20 mL의 얼음 차가운 HBSS를 작은 섬이 들어있는 새로운 50 mL 튜브에 추가 한 다음 스윙 버킷 원심 분리기에서 3 분 동안 350 x g의 원심 분리기를 넣습니다.
- 스핀 후, 조심스럽게 피펫(decant하지않음) 상급 (하단에 ~ 3 mL을 두고) 하단에 있는 섬을 포함하는 펠릿을 방해하지 않고. 상급제는 버리십시오.
- 세탁과 원심분리를 3회 이상 반복합니다. 매번 20 mL의 HBSS를 추가하고 각 스핀 전에 펠릿을 일시 중단해야합니다.
- 사용 전에 RPMI-1640 완전 미디어 병을 수조에서 37°C로 데우면 됩니다. 마지막 원심분리 후, HBSS를 모두 제거하고 이전에 준비된 완전한 RPMI-1640 매질(FBS, INS-1 세포 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신 포함)의 4 mL를 펠릿에 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 소용돌이치면서 펠릿을 빼내고 즉시 RPMI-1640 용지를 100mm 페트리 접시에 붓습니다. 튜브에 RPMI-1640 용지 5mL를 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 남은 섬을 씻어낸 다음 동일한 페트리 접시에 미디어를 붓습니다.
- 해부 현미경으로, 20 μL 파이펫을 사용하여 페트리 접시에서 건강한 섬을 선택하고 완전한 RPMI 1640 용지 10 mL을 포함하는 새로운 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 볼 때, 섬은 상대적으로 투명한, 간결한 외분비 조직에 비해 매끄러운 표면과 구형 / 직사각형 과 황금 갈색 색상을 표시해야합니다.
참고 : 해부 현미경의 배율은 일반적으로 12.5-16x로 설정됩니다. 아일렛 수율은 마우스의 균주, 연령 및 성별을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적으로 건강한 C57BL/6J 마우스 나이 4-10 개월에서 250-350 건강한 섬을 산출합니다.
- 해부 현미경으로, 20 μL 파이펫을 사용하여 페트리 접시에서 건강한 섬을 선택하고 완전한 RPMI 1640 용지 10 mL을 포함하는 새로운 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 볼 때, 섬은 상대적으로 투명한, 간결한 외분비 조직에 비해 매끄러운 표면과 구형 / 직사각형 과 황금 갈색 색상을 표시해야합니다.
- 다음날 실험을 위해 37°C에서 멸균 인큐베이터에 5% CO2 주입 및 95% 가습 공기를 밤새 인큐베이션하거나, 나중에 원하는 분석을 위해 섬을 동결한다.
- 일단 섬이 동결되면, 분비 성 어세이, RNA 또는 단백질 정량화에만 사용할 수 없습니다. 동결 세포를 수집하려면, HBSS 버퍼에 배치, 버퍼의 200-500 μL에 있는 모든 섬을 수집, 1.5 mL 튜브로 전송, 원심 분리기 350 x g 1-2 분, 이상 을 떠나 상층체를 제거 30-40 μL 용액을 떠나, 단기 저장을위한 -20 °C에 배치 ( 장기간 보관할 수 있도록 며칠) 또는 -80°C.
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Representative Results
이 절차의 적절한 완료는 복강에서 마우스 해부학의 일부 이해가 필요합니다. 이것은 Vater의 암풀라의 적절한 식별과 일반적인 담관의 클램핑을 허용합니다. 전체 절차는 일반적으로 1-2 시간이 걸립니다. 4-6 마우스에서 동시에 작은 섬을 분리하는 것이 더 효율적이므로 여러 샘플을 함께 원심 분리 할 수 있습니다. 섬 따기의 시간은 작은 섬의 수와 소화의 효율성에 따라 다릅니다. 1개의 마우스에서 250-350개의 섬을 선택하는 데 약 1시간이 걸릴 수 있습니다.
이 백서에는 매우 사실적인 이미지가 다수 포함되어 있습니다: 그림 3은 일반적인 담관 및 간 동맥을 노출하는 마우스의 복강을 보여줍니다. 그림 4는 더 밝은 색상으로 보이는 일반적인 담관의 전체 길이뿐만 아니라 췌장과 십이지장 사이의 (바늘이 삽입 될 곳) 근처 더 크고 빛나는 Vater의 암풀을 보여줍니다. 클램프는 간으로 콜라게나제 P의 흐름을 차단하기 위해 간 가까이에 일반적인 담관과 간 동맥 번들에 배치됩니다. 담관을 올바르게 또는 충분히 단단히 고정하지 않으면 췌장의 누출및 불완전한 관류가 발생합니다. 도 5는 바터의 암풀라에 삽입된 바늘을 일반적인 담관 내로 나타낸다. 바늘이 일반적인 덕트에 있으면, 집게는 주입하는 동안 덕트구멍을 뚫는 것을 방지하기 위하여 바늘을 안정시키기 위하여 이용됩니다. 일단 주입이 시작되면, 췌장은 근시 끝에서 말단 끝까지 팽창하기 시작할 것입니다; 비장 부위는 콜라게나아제 주사의 약 1 mL 후에 팽창하기 시작해야합니다. 장으로 의역은 십이지장의 바람직하지 않은 인플레이션으로 이어질 수 있습니다; 이것은 바늘의 배치를 재조정 (조금 당기거나 약간 더 깊게 삽입)하고 집게를 사용하여 바늘을 적절하게 안정화시킴으로써 해결할 수 있습니다. 주사는 그림6에 나타난 바와 같이 췌장의 모든 부위 (십이지장, 위 및 비장 엽)가 팽창되면 성공으로 간주됩니다. 췌장의 제거는 비장 부위에서 시작해야합니다. 팽창된 췌장은 미세한 외과 용 가위를 사용하여 덩어리로 자른다 (그림7A). 12-13분 소화 및 손떨림에 의해 혼합한 후, 조직 함유 현탁액이 보다 균질하게 나타난다(도7B). 이어서, 작은 섬은 원심 분리 후 밀도 구배에 의해 정제된다. 도 7C는 원심분리 후 HBSS와 밀도 구배 사이에 아일렛 현탁액층이 형성되는 것을 보여준다. 좋은 /건강한 섬은 부드러운 둥근 모양으로 나타납니다; 불량/손상된 섬은 거친 가장자리를 표시하고 소화되지 않은 외분비 조직은 불규칙한 모양을 나타내며 그림8과 같이 더 반투명으로 나타납니다.
그림 1: 외과 도구.
곡면 수술 가위, 커버 유리 집게, 마이크로 Adson 집게, 곡선 집게, 작은 수술 가위, 슈워츠 마이크로 serrefines (마이크로 혈관 클램프)가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 개략적 그림입니다.
이 절차의 가장 중요한 단계는 간 근처의 일반적인 담관의 클램핑이며, 췌장을 소화하기 위해 일반적인 담관에 Vater의 ampulla를 통해 콜라게나아제 P를 주입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 일반적인 담관의 위치.
집게는 일반적인 담관 및 간 동맥 번들을 붙들고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 바터의 일반적인 담관과 암풀라의 그림.
클램프는 간 근처의 일반적인 담관 및 간 동맥 번들에 놓입니다. 검은 색 화살표는 바늘이 삽입 될 Vater의 암풀라를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 일반적인 담관의 통조림.
일반적인 담관의 적절한 통조림 후, Vater의 ampulla는 더 나은 일반적인 담관의 배치를 강조하기 위해 (데모 목적으로만) 트라이판 블루로 주입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 완전히 팽창된 췌장.
점선은 완전히 교응된 췌장의 경계를 표시합니다. 집게는 섬이 가장 집중되어 있는 비장 부위를 들어 올려줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 아일렛 분리 및 정화 단계.
(A) 소화 전에 췌장의 조직 조각을 기계적으로 다진. (B) 소화된 췌장-콜라게나아제-교류 췌장의 균질조직 현탁액은 37°C에서 수욕장에서 13분 간 배양한 후, 30초의 손으로 혼합하였다. (C) 원심분리 후 HBSS와 밀도 구배 사이에 아일렛 서스펜션 층이 형성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 형광 세포 이미저에서 대표적인 아일렛 이미지.
(A) 좋은 섬, 나쁜 섬 및 외분비 조직이 보입니다. (B) 양호한 섬들의 클러스터가 도시된다. (c) 패널은 좋은 아일렛에 부착된 소화되지 않은 외분비 조직을 나타낸다. 좋은 / 건강한 섬은 빨간색 문자 "G"로 표시된 부드러운 둥근 가장자리를 보여줍니다. 불량/손상된 섬은 불규칙한 모양과 거친 가장자리를 표시하고 파란색 문자 "B"로 표시됩니다. 소화되지 않은 외분비 조직은 종종 섬에 부착 된 반투명하게 나타나며 녹색 문자 "E"로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에는 콜라게나아제 관류와 소화가 포함되며, 그 다음에는 섬의 정화가 뒤따릅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 췌장 1,4,7의효과적인 주입 및 완전한 관류입니다. 이 프로토콜의 전달 방법은 효소가 아일렛 1을 둘러싼 외분비 조직을 더잘 소화하기 위해 해부학 적 경로를 통과하는 것을 허용합니다. 또한,이 기술은 섬4,6의가장 높은 농도를 가지는 비장 영역의 완전한 소화에 적합합니다. 이 프로토콜은 잘 제어 된 소화 시간과 신중하게 실행 된 정화 단계로 250-350 개의 건강한 섬을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜로부터 분리된 섬은 포도당 자극된 인슐린 분비 ex vivo12를연구하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 우리의 경험에서, 인슐린 분비는 5.5 mM 포도당 함유 RPMI-1640 완전한 매체에 있는 밤새 배양 후에 기준선 (3.3 mM)에 비해 높은 포도당 자극 (22.2 mM)에 따라 4 배 증가했습니다. 장기간 배양(2-7일)에 따라 작은 섬의 생존/기능은 테스트되지 않았습니다.
제시된 프로토콜에는 상세한 메모와 시각적 데모가 포함되어 있지만, 높은 수율과 고품질의 섬을 위한 최적의 조건을 달성하기 위해 일부 조정이 필요합니다. 성공을 방해 할 수있는 두 가지 가장 일반적인 문제는 Vater의 암풀라의 부적절한 통조림 또는 덕트의 우발적 인 천자입니다. 이를 방지하려면 침투 부위가 암풀라가 십이지장과 만나는 정확한 위치인지 확인해야 합니다. 이 영역은 더 크고 상대적으로 식별하기 쉽기 때문에 덕트의 무결성을 심각하게 손상시키지 않으면서 여러 개의 구멍을 뚫을 수 있습니다. 일단 ampulla 내에서, 바늘의 방향은 각이 아닌 덕트와 평행해야 한다. 이 시점에서, 덕트의 길이의 약 1/4에 대 한 덕트에 바늘을 밀어, 다음 천천히 콜라게 나아제 주입 하는 동안 집게와 바늘을 안정화; 이것은 바늘이 압력하에서 구부러지고 실수로 덕트를 뚫는 것을 방지하는 데 도움이 될 것입니다. 그밖 문제는 췌장의 과잉 또는 과소 소화를 포함할 수 있습니다; 이것은 마우스의 나이, 긴장 및 성에 근거를 둔 수정을 요구할 수 있습니다. 과다 소화 (효소 및 기계적) 또는 밀도 구도에 장기간 노출로 인해 손상된 섬이 발생할 수 있습니다. 이들은 유사한 메서드에 대 한 존재 하는 일반적인 문제; 약간의 조정은 상당한 개선을 낳아야합니다. 이러한 유형의 문제를 다룰 때 제안은 한 번에 수정할 하나의 변수를 선택하는 것입니다(예: 소화 시간 또는 콜라게나제 농도).
이 프로토콜의 주요 장점은 효소 전달경로입니다: 소화 효율을 증가시키는 쉬운 해부학적 경로를 사용하여 외분비 췌장을 직접 소화하는 콜라게나아제 P를 갖는1. 이 방법은 췌장을 절제하고, 자르고, 콜라주나아제13에노출시키는 방법에 비해 작은 섬수가 50% 증가하는 것으로 보고되었다. 이 프로토콜은 단일 밀도 그라데이션을 사용해야 하므로 서로 다른 밀도또는 복합체에서 여러 그라데이션을 준비해야 하는 다른 방법에 비해 노동 집약적이고 비용 효율적입니다. 추가 시간 1,8,11을필요로 하는 Percoll 방법 . 이 프로토콜에 사용되는 그라데이션 방법은 다른 사람에 의해 섬 격리에 사용된다4. 이 췌도 격리 방법은 과학자에게 췌도 연구를 위한 개선된 도구를 제공합니다. 이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 당뇨병 마우스를 다룰 때 효능을 향상시키기 위해 변경을 포함한다. Do et al. 관찰한 바와 같이, 당뇨 마우스는 포도당 수준에 따라, 작은 섬 (100 미만)을 산출하고, 작은 섬들의 크기와 외관을감소시4. 우리는 이 현상을 관찰하고 당뇨병 작은 섬이 특별한 주의를 필요로 하는 효소및 기계적인 소화에 더 취약하다는 것을 믿습니다. 추가적으로, 섬 밀도는 밀도 구배에서의 외관을 바꿀 수 있으며, 프로토콜의 추가 최적화는 당뇨병 아일의 수율을 높이는 데 도움이 될 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 회로도의 그녀의 예술적 그림에 대한 제니퍼 Munguia 씨에게 매우 감사드립니다. 휴스턴의 지역 공영 라디오 방송국 KPFT의 마이클 R. 호니그(Michael R. Honig) 씨에게 편집 지원을 부탁드립니다. 이 연구는 미국 당뇨병 협회 #1-15-BS-177 (YS) 및 NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS)에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 1010840 (YS) 및 R01 DK095118 (SG)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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