Summary
Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.
Abstract
Pankreas adacıkları, ayrıca Langerhans Adacıkları denir, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik fonksiyonlar için hormonüreten endokrin hücrelerin bir küme vardır. Adacıklar öncelikle beş tür hormon salgılayan hücreden oluşur: α hücreleri glukagon salgılar, β hücreleri insülin salgılar, δ hücreleri somatostatin salgılar, ε hücreleri ghrelin salgılar, ve PP hücreleri pankreas polipeptidi salgılar. Adacıklarda hücrelerin %60-80'i insülin salgısını inceleyen en önemli hücre popülasyonu olan β hücreleridir. Pankreas adacıkları ex vivo insülin salgısını incelemek için önemli bir model sistemidir. Yüksek kaliteli adacıklar elde diyabet araştırma için büyük önem taşımaktadır. Çoğu adacık izolasyon prosedürleri kollajenaz enjeksiyon, sert ve karmaşık sindirim prosedürleri ve birden fazla yoğunluk gradyan arıtma adımları siteye erişmek için teknik olarak zor gerektirir. Bu kağıt ayrıntılı açıklamalar ve gerçekçi gösteriler ile basit bir yüksek verimli fare adacık izolasyon yöntemi özellikleri, aşağıdaki özel adımları gösteren: 1) Vater ampulla kollajenaz P enjeksiyonu, pankreas kanalı katılmadan küçük bir alan ve ortak safra kanalı, 2) enzimatik sindirim ve eknotrin pankreas mekanik ayırma, ve 3) tek bir degrade arıtma adımı. Bu yöntemin avantajları Vater daha erişilebilir ampulla kullanarak sindirim enzim enjeksiyonu, enzimomatik ve mekanik yaklaşımlar kombinasyonu kullanarak daha eksiksiz sindirim ve basit bir tek degrade arıtma adımı vardır. Bu protokol fare başına yaklaşık 250-350 adacık üretir; ve adacıklar çeşitli ex vivo çalışmalar için uygundur. Bu prosedürün olası uyarılar potansiyel olarak enzimatik sindirim ve / veya uzun gradyan kuluçka nedeniyle adacıklar zarar görmüş, tüm bunlar büyük ölçüde kuluçka süresi dikkatli reklam gerekçesi ile önlenebilir.
Introduction
Pankreas adacık izolasyonu için literatürde iki ortak yöntem vardır. Bir pankreas excising ve cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrama gerektirir, ve sonra bir kollajenaz çözeltisi içinde sindirerek1,2,3. Başka bir daha kesin yöntem sindirim enzimi tanıtmak için pankreas mevcut kanalların ağ kullanmaktır. Aşağıdaki siteler sindirim enzim enjeksiyonu için kullanılmıştır: safra ve kistik kanal kavşağı, ortak safra kanalı içine safra kesesi, ya da ortak safra kanalı kendisi1,4,5. Bu adacıklar eşit pankreas dağıtılan olmadığı bilinmektedir; dalak bölgesi en çok adacık içerir6. Sindirim enzimleri sunmak için anatomik yolları kullanarak ikinci yöntem pankreas daha tam bir perfüzyon sağlar iken, dalak bölgesi de dahil olmak üzere, Bu prosedür genellikle teknik olarak Vater ampulla sıkma veya dikiş gerektirir Zorlu. Adacık arınma açısından, birden fazla yoğunluk gradyanları yanı sıra hücre süzgeçleri ve manyetik geri çekme adacıkları arındırmak için kullanılmıştır3,7. Bu degradelerin kullanımı zaman alıcı olabilir ve Ficoll gradyanları adacıklarıntoksik hasarına neden olabilir 8.
Mevcut protokol Li ve ark.7tarafından açıklanan yöntem üzerine inşa edilmiştir , ek değişiklikler kendimizi ve başkalarının deneyimine dayalı eklendi1,4. Protokolümüzün en kritik adımları karaciğer ucuna yakın ortak safra kanalı nın kenetlenme, eknotrin dokuyu sindirmek için Vater ampulla kolajenaz P enjekte ve sonra mekanik sindirim hızlandırmak için sallayarak su banyosu kullanarak1, 4,7. Daha sonra, adacıkların daha fazla sindirimini engellemek için bir 'STOP' çözeltisi uygulanır; HBSS kalan kollajenaz P ve STOP çözeltisini yıkamak için kullanılır. Ficoll yöntemi insan adacıkları arındırmak için kullanıldığında, verim iki kat daha fazla fonksiyonel yeteneği (örneğin, insülin salgılanma) percoll gradyanların kullanımı ile karşılaştırıldığında adacıklar olduğu bildirilmiştir9. Ancak, çalışmalar ficoll gradient adacıklar üzerindeki toksik etkisi nedeniyle kullanımını sorguladı1,10. Bu Histopaque gradyan fare adacık izolasyon için optimum arıtma kinetiği sağlar bildirilmiştir, hangi basit adımlar ve daha düşük maliyet ile yüksek kaliteli adacıklar iyi verim üretir1. Protokolümüzde, Histopaque-1077 diğer artık doku8,11adacıkları arındırmak için kullanılır. Hasat adacıkları tam RPMI-1640 ortamiçinde kültürlenebilir veya doğrudan RNA/protein nicelemesinde kullanılabilir.
Bizim protokol, kollajenaz P sindirim ve tek bir degrade arıtma adımı bir arada kullanarak, diğer yayınlanan protokolleri daha basittir. Yöntemimiz zorlu cerrahi prosedürler gerektirmez ve sadece birkaç basit adımvardır. Daha da önemlisi, bu protokol sürekli olarak yüksek kaliteli fonksiyonel adacıklar iyi bir verim üretir (250-350/fare) olarak biz12bildirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Texas A&M Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Cerrahi aletlerin ihtiyacı Şekil 1'de, yöntemin şematik diyagramı şekil2'de gösterilmiştir.
1. Çözümler
- 1 L HBSS (1X) yapmak için 900 mL distile suya 100 mL 100 mL (stoktan) ekleyerek Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) hazırlayın.
- STOP çözeltisini hazırlayın (taze yapılmalı ve 1 saat içinde kullanılmalıdır) 100X fetal büyükbaş serumun (FBS) 50 mL'si ilave edilerek 450 mL buz gibi 1X HBSS; bu 500 mL STOP çözeltisi yapar. STOP çözeltisini 4 °C'de tutun.
- 1 mg/mL kollajenaz P ilave edilerek 1 mg/mL buz soğuğu 1X HBSS'ye kollajenaz P çözeltisini hazırlayın (kullanıldıktan sonra 1 saat içinde taze yapılmalıdır); 6 mL/fare kullanın.
- Kollajenaz P çözeltisine %0.05 (w/v) sığır serum albumini (BSA) ekleyin (bu izole adacıklara besin sağlar). Örneğin, 6 mL kollajenaz P çözeltisi 3 mg BSA kullanın. Buzdakal.
- Bir 50 mL tüpteki tüm fareler için gerekli kollajenaz P miktarını hesaplayın ve hazırlayın.
- %10 FBS ekleyerek komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, INS-1 hücre takviyesi (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 0.05 mM 2-mercaptoetanol) 500 mL RPMI 1640 ortam içeren 5,5 mM glukoz kullanılacak gece kültür ve kuluçka için.
2. Hazırlık
- 25 mL RNase inhibe çözeltisi, %70 etanol veya distile H2O olmak üzere üç 50 mL tüp doldurun. Bu çözümler ameliyat öncesi ve sırasında cerrahi aletlerin temizliğinde kullanılacaktır.
- Protokolü başlatmadan önce 30 dakika boyunca RNase inhibe çözeltisindeki aletlerin uçlarını ıslatın; bu araçlar üzerinde herhangi bir potansiyel RNase ortadan kaldırır.
- Ameliyat sırasında kullanılmak üzere x 6 boyutunda 6'ya önceden kesilmiş emici pedler.
- 1X HBSS çözeltisi önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Ameliyat tan önce STOP çözeltisini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Ameliyattan hemen önce kollajenaz P çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
NOT: Bu hazırlık 2 saat içinde kullanılmalıdır. - Sindirim ve arınma için etiket 50 mL tüpler; her fare için 2 tüpler hazırlamak, sindirim için bir ve adacık arıtma için diğer. Hayvan kimliğinin her iki tüpte de olduğundan emin olun.
- İlk 50 mL tüp içine 3 mL kollajenaz P çözeltisi ekleyin. Kalan 3 mL kollajenaz P enjekte edilecektir.
- Kollajenaz çözeltisinin kalan 3 mL'ini iğnede 30 G 1/2 ile monte edilmiş 3 mL'lik şırıngaya çekin. Şırıngayı buza yerleştirin.
3. Prosedür
- RNase inhibe çözeltisi tüm araçları çıkarın, sonra tüp ilk daldırma 70% etanol, sonra distile H2O içeren tüp, sonra temiz kağıt havlu üzerinde hava-kuru.
- Fare derinden uyuşturuluyana kadar fareyi 0,5 mL izofluran içeren bir hazne yerleştirin.
- Fareyi odadan çıkarın ve bir ayak yastığını forceps ile çimdikleyerek anestezi durumunu kontrol edin. Derin anestezi, nefes almanın giderek yavaşladığını ve farenin ayak çimdiklemesine tepkisiz olduğu gözlemine dayanır. Farenin derinden uyuşturulmuş olduğunu doğruladıktan sonra, servikal çıkığı ile fareyi ötenazi edin ve fareyi emici altlık üzerine yerleştirin.
- Uyuşturulan fareyi midesine yerleştirin, boyuna basınç uygulayın ve kuyruğunu çekerek omurilik ten inip beyinden uzakdur.
- Emici ped için supine pozisyonda farenin uzuvları Bant,% 70 etanol ile vücut sprey, ve aşırı etanol aşırı silin.
- Kesi yapmak için kapak cam çerkes ve kavisli cerrahi makas kullanın. Önce karın bölgesinin derisinde yatay bir kesi yapın (~3 cm), karın duvarını ortaya çıkarmak için deriyi geniş bir şekilde çekin. Daha sonra karın boşluğundaki pankreası tam olarak ortaya çıkarmak için abdominal periton üzerinde dikey bir kesi (~3–4cm) yapın (Şekil3).
- Safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğer ingenlerini üstün bir şekilde itin, soluk pembe bir tüp olarak görünür (Şekil 3).
- Bağırsakları karın boşluğunun sağ lomber/iliak bölgesinden sağa doğru dikkatlice hareket ettirin, safra kanalı ve hepatik arteri teşhir edin (Şekil3).
- Schwartz mikro serrefines (Şekil 1) kullanarakortak safra kanalını mümkün olduğunca karaciğere yakın bir şekilde dikkatlice kenetle.
- Pankreas kanalı ve ortak safra kanalının birleşmesi ile oluşan duodenal papillada bulunan Vater ampulla tanımlayın. Vater ampulla ortak safra kanalı giriş noktası olan bir diseksiyon mikroskobu altındabakıldığında şişmiş görünür (Şekil 4).
NOT: Diseksiyonu mikroskobunun ışığının yoğunluğunu/açısını ayarlamak, bulunmayı kolaylaştırabilir. - Şırıngayı 3 mL kollajenaz P çözeltisi ile Vater ampulla içine yerleştirin. İğneyi, Şekil5'te gösterildiği gibi, ortak safra kanalının uzunluğunun yaklaşık 1/4'ü için kanala itin (ampulla kanala yol açar).
- İğne ampulla bir kez, iğnenin yönünün kanala paralel olduğundan emin olun.
- İğneyi mikro Adson forceps ile kenetleyerek sabitleyin vekanalı delmesini önleyin (Şekil 5).
- Yavaş ve sürekli olarak şekil6'da gösterildiği gibi şırıngadan 3 mL kollajenaz P çözeltisini ortak safra kanalına enjekte edin (direnci hissetmeye yetecek kadar). Amaç pankreas kanalı girmek için kollajenaz zorlamak için geri akış basıncı oluşturmaktır. Pankreasın baş, boyun, vücut ve kuyruk bölgesi tamamen şişirilmişse enjeksiyon başarılı kabul edilir.
NOT: Pankreas tam olarak şişirilmiş değilse veya dalak alanı tam olarak şişirilmiş değilse adacık verimi düşük olacaktır. Dalak alanı en yüksek adacıksayısını içerir 6. Enflasyon çözelti ile doldurulur pankreas dokusu arasında açık alanlarda görünümü ile teyit edilebilir. - Şişirilmiş pankreası dikkatlice inceleyin ve 3 mL buz gibi kollajenaz P çözeltisi içeren 50 mL'lik bir sindirim tüpüne yerleştirin.
- 2 forceps (kavisli ve Mikro Adson kullanarak pankreas çıkarın; Bkz. Şekil 1): (dalaktan başlayarak pankreası dalaktan uzaklaştırın ve mideden ve duodenum boyunca çıkarmaya devam edin.
NOT: Kesi gerekmez. - İnce cerrahi makas kullanarak 3 mL buz gibi kollajenaz P çözeltisi ile sindirim tüpünde 3-5 s için pankreas doğrayın (Şekil7A).
- 2 forceps (kavisli ve Mikro Adson kullanarak pankreas çıkarın; Bkz. Şekil 1): (dalaktan başlayarak pankreası dalaktan uzaklaştırın ve mideden ve duodenum boyunca çıkarmaya devam edin.
- Tüpü 37 °C su banyosunda bir rafa sabitleyin ve yaklaşık 12-13 dakika boyunca 100-120 rpm'de sallayın.
- Kuluçkadan sonra, kollajenaz P sindirim çözeltisi homojen hale gelene kadar dokuyu bozmak için tüpleri hafifçe elle sallayın (Şekil7B). Homojenlik pankreas ince parçacıkların kum gibi bir görünüm ile doğrulanır. Yaklaşık 30 s nazik el sallayarak genellikle yeterlidir. Doku iyi homojenize olup olmadığını incelemek için ışığa kadar tüp tutun; gerekirse başka bir ~ 15 s için sallamak.
- Sindirildikten sonra, tüpleri hemen buza yerleştirin ve enzimatik sindirimi sonlandırmak için 40 mL buz gibi STOP çözeltisi ekleyin.
NOT: Bu noktada sindirim tüpleri birden fazla fare üzerinde çalışıyorsa, 2 saate kadar buz üzerinde bırakılabilir. - Tüpü 30 s (santrifüj sıcaklığı esnektir) için 300 x g'de sallanan kova santrifüjünde santrifüj edin.
NOT: Doku peletinin tüpün duvarında değil, 50 mL borunun altında oluşması için sallanan kova santrifüjü kullanın; bu daha iyi adacık verimi için çok önemlidir. - Stop çözeltisi ile santrifüjüsasyonu 2 kez daha ayırın ve her spinden sonra çözeltiyi ayırın. Sonraki her yıkama için 20 mL STOP çözeltisi kullanın.
- Her dönüşten önce, 20 mL STOP çözeltisinde 50 mL tüpteki doku peletini hafifçe sallayarak peleti bozun.
- 30 s için 300 x g buz gibi HBSS ve santrifüj 40 mL ile doku pelet yeniden askıya.
- Decant ve her spin sonra çözelti decanting, IKI kez HBSS çözeltisi ile bir sallanan kova santrifüj kullanarak santrifüj tekrarlayın. Her yıkama için 20 mL HBSS kullanın.
- Her spinden önce, 20 mL HBSS çözeltisi içeren tüpü hafifçe sallayarak tüpün altından ayırmak için peleti bozun.
- Son santrifüjden sonra tüm HBSS kaldırın.
- Daha sonra pelet içeren 50 mL tüpe 5 mL oda sıcaklığında yoğunluk degradesi ekleyin. Vortex homojenize kadar düşük hızda kısaca.
- 50 mL'lik tüpe oda sıcaklığı yoğunluğu degradesinin 5 mL'sini daha ekleyin. Girdap/karıştırma.
NOT: Daha iyi degradenin bozulmadan oluşmasına izin verecek şekilde sabit ve hareketsiz kalmak çok önemlidir. - Pipet 10 mL oda sıcaklığında HBSS tampon tüp içine (yoğunluk gradyanı içeren), damla-by-drop yavaşça ve yavaş yavaş bir degrade oluşmasını sağlamak için. HBSS damla cıkı eklemek için 10 mL pipetli bir pipet tabancası kullanın.
- Bir sallanan kova santrifüj kullanarak, 15 dakika boyunca 1700 x g spin tüpleri. Degradeyi korumak için hem hızlanma/yavaşlama hızını en düşük ayara değiştirdiğinden emin olun (Şekil 7C).
- Döndükten sonra, degradeyi bozmadan tüpleri dikkatlice çıkarın. Soğuk HBSS (pipet HBSS yukarı ve aşağı) ile önceden ıslak bir pipet tabancası kullanarak, yoğunluk gradyanı ile HBSS arasında oluşan adacık tabakasını (5-10 mL) yeni 50 mL adacık toplama tüpüne yerleştirin.
NOT: Adacıkların pipetin iç duvarlarına yapışmasını önlemek için pipetleri pipetlemeden önce pipetin soğuk HBSS ile ıslatMası faydalıdır.- Ayırmanın eksik olması durumunda, adacıklar yoğunluk gradyan tabakasında görünür, yoğunluk degradesinin (alt tabaka) 10 mL'sinin tamamını arabirimde oluşan adacık tabakasıile birlikte (sadece HBSS üst katmanının yaklaşık 8-10 mL'sini geride bırakmak için) çıkaracaktır.
NOT: Hem adacık tabakasının hem de yoğunluk gradyan tabakasının (alt tabaka) toplanması, adacık çekme süresini uzatabilecek enkaz toplanmasıyla sonuçlanabilir, ancak başka hiçbir adım değiştirilmez. Adacık katmanı iyi biçimlendirildiğinde bu katmanları n için toplamaya gerek yoktur.
- Ayırmanın eksik olması durumunda, adacıklar yoğunluk gradyan tabakasında görünür, yoğunluk degradesinin (alt tabaka) 10 mL'sinin tamamını arabirimde oluşan adacık tabakasıile birlikte (sadece HBSS üst katmanının yaklaşık 8-10 mL'sini geride bırakmak için) çıkaracaktır.
- Adacıklar içeren yeni 50 mL tüpe 20 mL buz gibi HBSS ekleyin, ardından 350 x g'de 3 dk'lık bir sallanan kova santrifüjünde santrifüj yapın.
- Spin sonra, dikkatle pipet(decantyok) supernatant dışarı (altta ~ 3 mL bırakın) alta adacıklar içeren pelet rahatsız etmeden. Supernatant atın.
- Yıkamayı ve santrifüjleri en az 3 kez tekrarlayın. Her seferinde 20 mL HBSS ekleyin ve her dönüşten önce peleti askıya aldığından emin olun.
- RPMI-1640 tam ortam şişesini kullanmadan önce 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın. Son santrifüjden sonra, HBSS'nin tamamını çıkarın ve pelete daha önce hazırlanmış komple RPMI-1640 ortamının (FBS, INS-1 hücre takviyesi ve penisilin/streptomisin içeren) 4 mL'sini ekleyin.
- Tüpü yavaşça döndürerek peleti yerinden çıkarve RPMI-1640 ortamını hemen 100 mm'lik petri kabına dökün. Tüpe 5 mL daha RPMI-1640 ortam ekleyin ve kalan adacıkları yıkamak için yavaşça döndürün, sonra da medyayı aynı Petri kabına dökün.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, 20 μL pipet kullanarak Petri kabından sağlıklı adacıklar seçin ve 10 mL tam RPMI 1640 ortam içeren yeni bir Petri kabına koyun. Bir diseksiyon mikroskobu altında bakıldığında, adacıklar nispeten şeffaf, ince ekroz doku ile karşılaştırıldığında pürüzsüz bir yüzey ile küresel / dikdörtgen ve altın-kahverengi renk görünmelidir.
NOT: Diseksiyonu büyütme mikroskobu genellikle 12.5-16x olarak ayarlanır. Adacık verimi, farenin yaşı ve cinsiyeti gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. Bu protokol genellikle sağlıklı C57BL/6J fare yaşı 4-10 aylık 250-350 sağlıklı adacık verir.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, 20 μL pipet kullanarak Petri kabından sağlıklı adacıklar seçin ve 10 mL tam RPMI 1640 ortam içeren yeni bir Petri kabına koyun. Bir diseksiyon mikroskobu altında bakıldığında, adacıklar nispeten şeffaf, ince ekroz doku ile karşılaştırıldığında pürüzsüz bir yüzey ile küresel / dikdörtgen ve altın-kahverengi renk görünmelidir.
- Adacıkları steril bir kuluçka makinesinde 37 °C'de %5 CO2 infüzyonu ve ertesi gün deneyler için bir gecede %95 nemlendirilmiş hava ile inkübe edin veya adacıkları daha sonra istenilen analiz için dondurun.
- Adacıklar dondurulduktan sonra, sadece RNA veya protein niceliği olan salgı tahlilleri için kullanılamazlar. Hücreleri donduracak hücreleri toplamak için, HBSS arabelleğine yerleştirin, tüm adacıkları 200-500 μL tamponda toplayın, 1,5 mL tüpe aktarın, 1-2 dk için santrifüj 350 x g aktarın, 30-40 μL çözeltiden fazla bırakmadan süpernatantı çıkarın, kısa süreli depolama için -20 °C'ye yerleştirin ( birkaç gün) veya uzun süreli depolama için -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu işlemin doğru tamamlanması karın boşluğunda fare anatomisi bazı anlayış gerektirir. Bu Vater ampulla doğru belirlenmesi ve ortak safra kanalı nın kelepçeleme sağlar. Tüm prosedür normalde 1-2 saat sürer. Adacıkları aynı anda 4-6 fareden ayırmak daha etkilidir, bu nedenle çeşitli örnekler birlikte santrifüj edilebilir. Adacık toplama süresi, adacık ların sayısına ve sindirim in verimliliğine bağlı olarak değişir; 1 fareden 250-350 adacık almak yaklaşık bir saat sürebilir.
Bu yazıda, çok gerçekçi görüntüler bir dizi dahildir: Şekil 3 farenin karın boşluğu gösterir, ortak safra kanalı ve hepatik arter açığa. Şekil 4, pankreas ve duodenum arasındaki kavşak (iğne nin takıldığı yer) yakınında daha büyük ve daha parlak olan Vater'in ampullasının yanı sıra, daha açık bir renk gibi görünen ortak safra kanalının tüm uzunluğunu gösterir. Bir kıskaç karaciğer içine kollajenaz P akışını engellemek için karaciğeryakın ortak safra kanalı ve hepatik arter demeti yerleştirilir. Safra kanalının doğru veya yeterince sıkı kenetlenememesi pankreasın sızmasına ve eksik perfüzyonuna neden olur. Şekil 5, Vater ampulla ortak safra kanalına yerleştirilen iğneyi gösterir. İğne ortak kanala girdiğinde, iğnenin enjekte edilirken kanalı delmesini önlemek için iğneyi stabilize etmek için forceps kullanılır. Enjeksiyon başladıktan sonra, pankreas distal sonuna proksimal ucundan şişmeye başlayacak; kollajenaz enjeksiyonunun yaklaşık 1 mL sonra dalak bölgesi şişmeye başlamalıdır. Bağırsakiçine backflow duodenum istenmeyen bir şişme yol açabilir; bu, iğnenin yerleşimini yeniden yapılandırarak (biraz dışarı çekin veya biraz daha derine doğru tekrar takın) ve iğneyi forceps kullanarak düzgün bir şekilde stabilize ederek giderilebilir. Pankreasın tüm bölgeleri (duodenal, gastrik ve dalak lobları) Şekil6'da gösterildiği gibi şişirilirse enjeksiyon başarılı kabul edilir. Pankreasın çıkarılması dalak bölgesinden başlamalıdır. Şişirilmiş pankreas ince cerrahi makas kullanılarak parçalar halinde doğranır (Şekil7A). 12-13 dk sindirim ve elle titreme ile karıştırma sonra, doku içeren süspansiyon daha homojen görünür (Şekil 7B). Daha sonra, adacıklar santrifüjden sonra yoğunluk gradyanı ile saflaştırılır. Şekil 7C, HBSS ile santrifüj sonrası yoğunluk gradyanı arasında bir adacık süspansiyon tabakası oluştuğunu göstermektedir. İyi/sağlıklı adacıklar düzgün yuvarlak şekilli olarak görünür; kötü/hasarlı adacıklar pürüzlü kenarlar gösterir ve sindirilmemiş ekzonrin doku düzensiz şekil gösterir ve Şekil8'de gösterildiği gibi daha yarı saydam görünür.
Şekil 1: Cerrahi aletler.
Kavisli cerrahi makas, kapak cam çerterler, mikro Adson forceps, kavisli çerseps, küçük cerrahi makas ve Schwartz mikro serrefines (mikrovasküler kelepçe) gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Protokolün şematik çizimi.
Bu işlemin en kritik adımları karaciğer yakınındaki ortak safra kanalının kenetlenme, ve pankreas sindirmek için ortak safra kanalı içine Vater ampulla yoluyla kollajenaz P enjekte. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ortak safra kanalının yeri.
Forceps ortak safra kanalı ve hepatik arter demeti tutun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vater'in ortak safra yolu ve ampulla İllüstrasyonu.
Bir kıskaç karaciğer yakınında ortak safra kanalı ve hepatik arter demeti yerleştirilir. Siyah oklar, iğnenin takıldığı Vater'in ampullasını işaret ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ortak safra kanalının kanülasyonu.
Ortak safra kanalının düzgün kanülasyonundan sonra, Vater ampulla daha iyi ortak safra kanalının yerleşimvurgulamak için trypan mavi (sadece gösteri amaçlı) enjekte edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tamamen şişirilmiş pankreas.
Noktalı çizgi tam perfüzyon pankreas sınırını gösterir. Forceps adacıkların en yoğun olduğu dalak bölgesini tutar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Adacık izolasyon ve arınma adımları.
(A) Mekanik sindirim önce pankreas doku parçaları doğranmış. (B) Sindirilmiş pankreas-37 °C'de sallayarak su banyosunda 13 dakika kuluçka dan sonra kollajenaz perfüzyon pankreas homojen doku süspansiyon, elle karıştırma 30 s takip. (C) HbSS ile santrifüj sonrası yoğunluk gradyanı arasında adacık süspansiyon tabakası oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Floresan Hücre-Görüntüleyici'den temsili adacık görüntüleri.
(A) İyi adacıklar, kötü adacıklar ve ekzonkrin doku görülür. (B) İyi adacıklar kümesi gösterilir. (C) Panel iyi bir adacık bağlı sindirilmemiş ekroz dokusu gösterir. İyi/sağlıklı adacıklar, kırmızı harf "G" ile gösterilen düzgün yuvarlak kenarları gösterir; kötü/hasarlı adacıklar düzensiz şekil ve pürüzlü kenarları gösterir ve mavi harf "B" ile gösterilir. Sindirilmemiş ekzonrin dokular yarı saydam görünür, genellikle adacıklara bağlı, ve yeşil harf ile gösterilir "E". Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol kollajenaz perfüzyon ve sindirim, adacıkların arınma izledi içerir. Bu protokolün en kritik adımları etkili enjeksiyon ve pankreas tam perfüzyonvardır 1,4,7. Bu protokolün teslim yöntemi enzim daha iyi adacıklar çevreleyen ekzonrin doku sindirmek için anatomik yolları çapraz sağlar1. Buna ek olarak, bu teknik de adacıkların en yüksek konsantrasyona sahip dalak bölgesi, tam sindirim için uygundur4,6. Bu protokol, iyi kontrollü sindirim süresi ve özenle yürütülen arıtma adımları ile, 250-350 sağlıklı adacıklar üretebilir. Bu protokolden izole adacıklar glikoz uyarılmış insülin salgısı ex vivo12'yi incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Deneyimlerimize göre, insülin salgısı yüksek glukoz stimülasyonu (22.2 mM) üzerine 5.5 mM glukoz içeren RPMI-1640 komple ortamda bir gecede kuluçka sonrası bazin (3.3 mM) ile karşılaştırıldığında 4 kat artmıştır. Uzun süreli kuluçka dönemindeki adacıkların hayatta kalma/işlevselliği (2-7 gün) test edilmemiştir.
Sunulan protokol ayrıntılı notlar ve görsel gösteriler içerse de, yüksek verim ve yüksek kaliteli adacıklar için en uygun koşulları sağlamak için bazı ayarlamalar gereklidir. Başarıyı engelleyebilecek en sık karşılaşılan iki sorun, Vater ampulla nın yanlış kanülasyonu veya kanalın kazara delinmesidir. Bunları önlemek için, penetrasyon alanının ampulla duodenum ile tam olarak buluştuğu yer olduğundan emin olmak gerekir. Bu alan daha büyük ve nispeten tanımlamak kolaydır, hangi ciddi kanalın bütünlüğünü ödün vermeden birden fazla delinme sağlar. Ampulla içine girdikten sonra iğnenin yönü açılı yerine kanalla paralel olmalıdır. Bu noktada, kanal uzunluğu yaklaşık 1/4 için kanal içine iğne itin ve yavaş yavaş kollajenaz enjekte ederken daha sonra forseps ile iğne stabilize; bu, iğnenin basınç altında bükülmesini ve kazara kanalı delmesini önlemeye yardımcı olur. Diğer sorunlar pankreas over-veya under-sindirim içerebilir; bu, farelerin yaş, gerginlik ve cinsiyetine göre değişiklik gerektirebilir. Aşırı sindirim (enzimatik ve mekanik) nedeniyle hasarlı adacıklar veya yoğunluk gradyan uzun süreli maruz kalma oluşabilir. Bunlar benzer yöntemler için var olan yaygın sorunlardır; bazı küçük ayarlamalar önemli iyileştirmeler sağlamalıdır. Bu tür sorunlarla uğraşırken bir öneri, bir seferde değiştirmek için bir değişken seçmektir (örneğin, sindirim zamanı veya kollajenaz konsantrasyonu).
Bu protokolün ana avantajı enzim teslim yoludur: doğrudan sindirim verimliliğini artırır daha kolay bir anatomik rota kullanarak ekonrin pankreas sindirmek için kollajenaz P sahip1. Bu yöntem pankreas çıkarma yöntemi ile karşılaştırıldığında adacık sayısında% 50 artış verim bildirilmiştir, doğrama, ve kollajenazmaruz 13. Bu protokol sadece tek bir yoğunluk gradyanı nın kullanılmasını gerektirir, bu da farklı yoğunluklarda birden fazla degrade hazırlanmasını gerektiren diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az emek yoğun ve daha uygun maliyetli olmasını sağlar. Ek zaman1,8,11gerektiren Percoll yöntemi . Bu protokolde kullanılan degrade yöntemi de diğerleri tarafından adacık yalıtımı kullanılmıştır4. Adacık izolasyon Bu yöntem pankreas adacıkları incelemek için geliştirilmiş bir araç ile bilim adamı sağlar. Bu protokolün gelecekteki uygulamaları diyabetik fareler ile uğraşırken etkinliğini artırmak için değişiklik içerir. Do ve ark.'nın gözlemlediği gibi, diyabetik fareler, glikoz düzeylerine bağlı olarak, daha az adacık (100'den az) verim, azaltılmış boyutu ve adacıkların görünümü4. Bu fenomeni gözlemledik ve diyabetik adacıkların özel bakım gerektiren enzimatik ve mekanik sindirime karşı daha savunmasız olduğuna inanıyoruz. Ayrıca, adacık yoğunluğu yoğunluk gradyan görünümünü değiştirebilir, protokolün daha fazla optimizasyon diyabetik adacıkların verimini artırmak için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz şematik diyagramonu sanatsal illüstrasyon için Bayan Jennifer Munguia son derece müteşekkiriz. Biz Bay Michael R. Honig Houston Topluluk Kamu Radyo İstasyonu KPFT onun editoryal yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma Amerikan Diyabet Derneği #1-15-BS-177 (YS) ve NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma usda Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch projesi 1010840 (YS) ve R01 DK095118 (SG) tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
