Summary
इस आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल exocrine ऊतक को पचाने के लिए कोलैडेज इंजेक्शन के एक उपन्यास मार्ग और चूहों से islets को शुद्ध करने के लिए एक सरलीकृत ढाल प्रक्रिया का वर्णन किया। यह एंजाइमी पाचन, ढाल जुदाई / शुद्धीकरण, और आइलेट हाथ उठा शामिल है। सफल अलगाव 250-350 उच्च गुणवत्ता और माउस प्रति पूरी तरह कार्यात्मक islets उपज कर सकते हैं.
Abstract
अग्नाशयis, भी Langerhans के Islets कहा जाता है, अंत: स्रावी कोशिकाओं का एक समूह है जो ग्लूकोज विनियमन और अन्य महत्वपूर्ण जैविक कार्यों के लिए हार्मोन का उत्पादन कर रहे हैं. इसलेट्स में मुख्य रूप से पांच प्रकार की हार्मोन-स्रावित कोशिकाएं होती हैं: जेड कोशिकाएं ग्लूकागन को स्रावित करती हैं, जेड कोशिकाएं इंसुलिन को स्रावित करती हैं, जेड कोशिकाओं को सोमेटोस्टेटिन, जेड कोशिकाओं को स्रावित करता है। इस्लेट्स में 60 से 80% कोशिकाएं हैं- कोशिकाएं, जो इंसुलिन स्राव का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कोशिका जनसंख्या हैं। अग्नाशयी आइलेट्स पूर्व विवो इंसुलिन स्राव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। मधुमेह अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता islets प्राप्त बहुत महत्व का है. अधिकांश आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं कोकोलैनेज इंजेक्शन, कठोर और जटिल पाचन प्रक्रियाओं, और कई घनत्व ढाल शुद्धि कदम की साइट का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल की आवश्यकता होती है। इस कागज विस्तृत विवरण और यथार्थवादी प्रदर्शनों के साथ एक सरल उच्च उपज माउस आइलेट अलगाव विधि सुविधाएँ, निम्नलिखित विशिष्ट चरणों दिखा: 1) Vater के ampulla पर collagenase पी का इंजेक्शन, एक छोटा सा क्षेत्र अग्नाशय ीduct में शामिल होने और आम पित्त नली, 2) एंजाइमी पाचन और एक्सोक्रिन अग्न्याशय के यांत्रिक जुदाई, और 3) एक एकल ढाल शुद्धि कदम. इस विधि के लाभ Vater के अधिक सुलभ ampulla का उपयोग कर पाचन एंजाइम के इंजेक्शन, एंजाइमी और यांत्रिक दृष्टिकोण के संयोजन का उपयोग कर अधिक पूरा पाचन, और एक सरल एकल ढाल शुद्धि कदम हैं. यह प्रोटोकॉल प्रति माउस लगभग 250-350 islets उत्पन्न करता है; और islets विभिन्न पूर्व vivo अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं. इस प्रक्रिया के संभावित चेतावनी एंजाइमी पाचन और/या लंबे समय तक ढाल ऊष्मायन के कारण संभावित रूप से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, जिनमें से सभी को ऊष्मायन समय के सावधानीपूर्वक विज्ञापन औचित्य से काफी हद तक बचा जा सकता है।
Introduction
अग्नाशयी आइलेट अलगाव के लिए साहित्य में दो आम तरीके हैं. एक अग्न्याशय excising और यह शल्य कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में dicing की आवश्यकता है, और फिर यह एक कोलैजा समाधान में पचा1,2,3. एक और अधिक सटीक विधि पाचन एंजाइम परिचय करने के लिए अग्न्याशय में मौजूद नलिकाओं के नेटवर्क का उपयोग करने के लिए है। निम्नलिखित साइटों पाचन एंजाइम इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है: पित्त और सिस्टिक नलिका के जंक्शन, सामान्य पित्त नली में पित्ताशय की थैली, या आम पित्त नली ही1,4,5. यह ज्ञात है कि islets समान रूप से अग्न्याशय में वितरित नहीं कर रहे हैं; स्प्लेनिक क्षेत्र में सबसे अधिक आइलेट्स6होते हैं। जबकि पाचन एंजाइमों को वितरित करने के लिए शारीरिक मार्गों का उपयोग करने की दूसरी विधि अग्न्याशय का एक अधिक पूर्ण प्रसार के लिए अनुमति देता है, प्लीहा क्षेत्र सहित, इस प्रक्रिया को अक्सर शिकंजा या Vater के ampulla के suturing की आवश्यकता है कि तकनीकी रूप से है चुनौतीपूर्ण. आइलेट शोधन के संदर्भ में अनेक घनत्व प्रवणता तथा कोशिका प्रभेदकतथा चुंबकीय प्रत्याकर्षण का प्रयोग आइलेट्स3,7को शुद्ध करने के लिए किया गया है। इन प्रवणताओं का उपयोग समय लगता है और फिकॉल ग्रेडिएंट के परिणामस्वरूप आइलेट्स8की विषाक्त क्षति हो सकती है .
वर्तमान प्रोटोकॉल ली एट अल द्वारा वर्णित विधि पर बनाया गया है,अतिरिक्त संशोधनों के साथ अपने आप को और दूसरों के अनुभव के आधार पर जोड़ा1,4. हमारे प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम जिगर के अंत के पास आम पित्त नली के clamping रहे हैं, Vater के ampulla के माध्यम से कोलैनाज पी इंजेक्शन एक्सोक्रिन ऊतक पचाने के लिए, और फिर एक मिलाते हुए पानी स्नान का उपयोग करने के लिए पाचन यंत्रवत्1, 4,7. बाद में, आइलेट्स के आगे पाचन को बाधित करने के लिए एक 'STOP' समाधान लागू किया जाता है; HBSS शेष collagenase पी और बंद करो समाधान धोने के लिए प्रयोग किया जाता है. जब फिकॉल विधि का उपयोग मानव आइलेट्स को शुद्ध करने के लिए किया गया था, तो पर्कॉल ग्रेडिएंट्स9के उपयोग की तुलना में उपज को अधिक कार्यात्मक क्षमता (उदाहरण के लिए, इंसुलिन स्राव) के साथ दो बार आइलेट्स होने की सूचना दी गई थी। तथापि, अध्ययनों से आईलेट्स1,10पर इसके जहरीले प्रभाव के कारण फिकॉल ग्रेडिएंट के उपयोग पर प्रश्न उठाया गया है। यह सूचित किया गया है कि हिस्टोपैकी प्रवणता माउस आइलेट आइसोलेशन के लिए इष्टतम शुद्धि गतिज प्रदान करती है, जो सरल चरणों और कम लागत1के साथ उच्च गुणवत्ता वाले आइलेट्स की अच्छी उपज पैदा करती है। हमारे प्रोटोकॉल में, हिस्टोपाक-1077 का उपयोग अन्य अवशिष्ट ऊतक8,11से आइलेट्स को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। काटा islets पूर्ण RPMI-1640 मीडिया में सुसंस्कृत किया जा सकता है, या सीधे आरएनए में उपयोग /
हमारे प्रोटोकॉल, collagenase पी पाचन और एक एकल ढाल शुद्धि कदम का एक संयोजन का उपयोग कर, अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में सरल है. हमारी विधि शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की मांग की आवश्यकता नहीं है और बस कुछ ही सरल कदम है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल लगातार उच्च गुणवत्ता कार्यात्मक islets (250-350/
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Protocol
यहाँ वर्णित सभी तरीकों टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है. शल्य चिकित्सा उपकरणों की आवश्यकता चित्र 1 में दिखाई गई है और प्रक्रिया का योजनाबद्ध आरेख चित्र 2 में दर्शाया गया है।
1. समाधान
- 1 एल एचबीएस (1X) बनाने के लिए आसुत पानी के 900 एमएल में 10X HBSS (स्टॉक से) के 100 एमएल जोड़कर हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) तैयार करें।
- STOP समाधान तैयार करें (ताजा किया जाना चाहिए और 1 h के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए) 100X भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 50 एमएल बर्फ ठंड 1X HBSS के 450 एमएल को जोड़कर; यह 500 एमएल STOP समाधान बनाता है। STOP समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- कोलैडेज़ पी समाधान तैयार करें (उपयोग किए जाने वाले 1 एच के भीतर ताजा किया जाना चाहिए) कोलैजानेस पी के 1 मिलीग्राम/एमएल को बर्फ ठंड 1X HBSS में जोड़कर; 6 एमएल/
- कोलेजाइनस पी समाधान में 0.05% (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) जोड़ें (यह अलग आइलेट्स को पोषक तत्व प्रदान करता है)। उदाहरण के लिए, 6 एमएल कोलैजा पी समाधान में 3 मिलीग्राम बीएसए का उपयोग करें। बर्फ पर रखें.
- गणना और एक 50 एमएल ट्यूब में सभी चूहों के लिए आवश्यक कोलाजनेस पी की राशि तैयार करते हैं।
- 10% FBS जोड़कर पूरा RPMI 1640 माध्यम तैयार करें, 100 U/mL पेनिसिलिन, 100 डिग्री ग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, आईएन-1 सेल पूरक (10 एमएम हैप्स, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, और 0.05 एमएम 2-मरकैप्टोएथेनोल) से 500 एमएल आरपीएमआई 1640 मीडिया जिसमें 5.5 एम एम ग्लूकोज का उपयोग किया जाता है। रात भर संस्कृति और ऊष्मायन के लिए.
2. तैयारी
- 25 एमएल आरनेस अवरोध समाधान, 70% इथेनॉल या आसुत एच2हे के तीन 50 एमएल ट्यूब भरें। इन समाधानों का उपयोग शल्य चिकित्सा उपकरणों की सफाई से पहले और प्रक्रिया के दौरान किया जाएगा।
- प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए RNase बाधा समाधान में उपकरणों के सुझावों को भिगो दें; यह उपकरणों पर किसी भी संभावित RNase समाप्त.
- सर्जरी के दौरान उपयोग के लिए आकार में एक्स 6 में 6 करने के लिए पूर्व कटौती शोषक पैड।
- 1X HBSS समाधान अग्रिम में तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सर्जरी से पहले STOP समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- सर्जरी से तुरंत पहले कोलैजाज़ पी समाधान तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें।
नोट: यह तैयारी के 2 एच के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. - पाचन और शुद्धि के लिए लेबल 50 एमएल ट्यूब; प्रत्येक माउस के लिए 2 ट्यूब तैयार, पाचन के लिए एक और islet शुद्धि के लिए अन्य. सुनिश्चित करें कि पशु आईडी दोनों ट्यूबों पर है.
- पहले 50 एमएल ट्यूब में कोलैजानेस पी समाधान के 3 एमएल जोड़ें। कोलैजापी पी के शेष 3 एमएल इंजेक्शन लगाए जाएंगे।
- सुई में 3 0 जी 1/ बर्फ पर सिरिंज रखें.
3. प्रक्रिया
- RNase बाधा समाधान से सभी उपकरण निकालें, तो उन्हें 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब में पहले डुबकी, तो आसुत एच2ओ युक्त ट्यूब में, तो साफ कागज तौलिया पर हवा सूखी.
- माउस को 0.5 एमएल isoflurane युक्त कक्ष में रखें जब तक माउस गहराई से एनेस्थेट किया जाता है।
- कक्ष से माउस निकालें और forceps के साथ एक पैर पैड pinching द्वारा संज्ञाहरण की स्थिति की जाँच करें. गहरी एनेस्थेटाइजेशन इस अवलोकन पर आधारित है कि श्वास लगातार धीमी हो जाती है और माउस पैर चुटकी लेने के लिए निष्क्रिय है। यह पुष्टि करने के बाद कि माउस गहराई से एनेस्थेटाइज़ किया गया है, गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें, और फिर माउस को शोषक पैड पर रखें।
- अपने पेट पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें, गर्दन पर दबाव लागू करें और पूंछ खींच कर मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी के कॉलम को स्थानांतरित करें।
- शोषक पैड के लिए सुपाच्य स्थिति में माउस के अंगों को टेप करें, 70% इथेनॉल के साथ शरीर को स्प्रे करें, और अतिरिक्त इथेनॉल से अधिक मिटा दें।
- चीरों बनाने के लिए कवर ग्लास संदंश और घुमावदार सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। सबसे पहले पेट के क्षेत्र की त्वचा पर एक क्षैतिज चीरा बनाने के लिए ($ 3 सेमी), त्वचा व्यापक पेट की दीवार का पर्दाफाश करने के लिए खुला खींच. फिर उदर की गुहा में अग्न्याशय को पूरी तरह से उजागर करने के लिए उदर परितोनम पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा ($3-4 सेमी) बनाएं (चित्र 3)।
- पित्त नली को बेनकाब करने के लिए यकृत के खण्डों को बेहतर ढंग से पुश करें, यह एक पीली गुलाबी ट्यूब के रूप में दिखाई देगा (चित्र 3)।
- पेट की गुहा के दाहिने कटि/इलिक क्षेत्र से आंतों को दाईं ओर ले जाने के लिए सावधानी से पित्त नलिका और यकृत धमनी को उजागर करता है (चित्र 3)।
- ध्यान से Schwartz माइक्रो serrefines का उपयोग कर आम पित्त नली दबाना (चित्र 1) के रूप में संभव के रूप में जिगर के करीब.
- वेटर के ampulla की पहचान, जो डुओडेनल पिप्पल में स्थित है, अग्नाशयी नलिका और आम पित्त नली के संघ द्वारा गठित. वटर का ऐम्पुला विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखे जाने पर सूज जाता है जो सामान्य पित्त नलिका का प्रवेश बिंदु होता है (चित्र 4)।
नोट: विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के प्रकाश की तीव्रता/कोण समायोजित करना आसान हो सकता है। - Vater के ampulla में कोलैजापी पी समाधान के 3 एमएल के साथ सिरिंज डालें. सामान्य पित्त नलिका की लंबाई में से लगभग 1 धूँटी के लिए सुई को धकेलें (एम्पुला नलिका में ले जाता है) जैसा कि चित्र 5में दर्शाया गया है।
- एक बार सुई ampulla में है, सुनिश्चित करें कि सुई का अभिविन्यास ऐसा है कि यह नलिका के साथ समानांतर है.
- वाहिनी को दंड देने से रोकने के लिए सूक्ष्म आडोसन संदंश के साथ दबाना सुई को स्थिर करें (चित्र 5)।
- धीरे-धीरे और लगातार कोलैनेस पी समाधान के 3 एमएल को सिरिंज से सामान्य पित्त नली में इंजेक्ट किया जाता है (प्रतिरोध महसूस करने के लिए) जैसा कि चित्र 6में दिखाया गया है। लक्ष्य कोलैजानेस अग्नाशय ी वाहिनी में प्रवेश करने के लिए मजबूर करने के लिए backflow दबाव बनाने के लिए है। इंजेक्शन सफल माना जाता है अगर अग्न्याशय के सिर, गर्दन, शरीर और पूंछ क्षेत्र सभी पूरी तरह से फुलाया जाता है।
नोट: अगर या तो अग्न्याशय पूरी तरह से फुलाया नहीं है, या प्लीहा क्षेत्र पूरी तरह से फुलाया नहीं है तो Islet उपज कम हो जाएगा। स्प्लेनिक क्षेत्र में आइलेट्स6की सर्वाधिक संख्या होती है। मुद्रास्फीति अग्नाशय के ऊतकों है कि समाधान के साथ भर रहे हैं के बीच खुले स्थान की उपस्थिति से पुष्टि की जा सकती है. - फुलाया अग्न्याशय को सावधानी से काट ें और इसे 50 एमएल पाचन ट्यूब में रखें जिसमें 3 एमएल बर्फ-ठंडा कोलेजापी पी समाधान होता है।
- 2 संदंश का उपयोग कर के अग्न्याशय निकालें (वक्रित और माइक्रो Adson; चित्रा 1देखें : (प्लीहा से शुरू, अग्न्याशय तिल्ली से दूर खींच और पेट से और ग्रहणी के साथ हटाने जारी है.
नोट: कोई चीरों की आवश्यकता है. - पाचन ट्यूब में 3-5 s के लिए अग्न्याशय काट नानखत 3 एमएल बर्फ-ठंडा कोलाजनास पी समाधान के साथ ठीक शल्य कैंची का उपयोग कर (चित्र 7A)।
- 2 संदंश का उपयोग कर के अग्न्याशय निकालें (वक्रित और माइक्रो Adson; चित्रा 1देखें : (प्लीहा से शुरू, अग्न्याशय तिल्ली से दूर खींच और पेट से और ग्रहणी के साथ हटाने जारी है.
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक रैक के लिए ट्यूब को सुरक्षित करें और लगभग 12-13 मिनट के लिए 100-120 आरपीएम पर हिला।
- ऊष्मायन के बाद, धीरे से हाथ से ट्यूब हिला ने ऊतक को बाधित करने के लिए जब तक कोलाजना पी पाचन समाधान समरूप हो जाता है (चित्र 7ख)। एकहोरोजीनिटी अग्न्याशय के ठीक कणों की एक रेत की तरह उपस्थिति द्वारा पुष्टि की है। कोमल हाथ से हिला के बारे में 30 s आमतौर पर पर्याप्त है. ऊतक अच्छी तरह से homogenized है, तो जाँच करने के लिए प्रकाश के लिए ट्यूब पकड़ो; एक और $ 15 s के लिए हिला अगर जरूरत है.
- एक बार पचाने के बाद, ट्यूब को तुरंत बर्फ पर रखें और एंजाइमी पाचन को समाप्त करने के लिए बर्फ-ठंडा स्टॉप समाधान के 40 एमएल जोड़ें।
नोट: इस बिंदु पर पाचन ट्यूब बर्फ पर छोड़ दिया जा सकता है 2 ज, अगर कई चूहों पर काम कर रहे. - 30 s के लिए 300 x ग्राम पर एक झूलते-बकेट सेंट्रीफ्यूज में ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें (सेन्चुरी का तापमान लचीला होता है)।
नोट: ऊतक गोली 50 एमएल ट्यूब के तल पर और ट्यूब की दीवार पर नहीं गठन किया है ताकि एक झूलते-बकेट अपकेंद्रित्र का उपयोग करें; यह बेहतर islet उपज के लिए महत्वपूर्ण है. - Decant और STOP समाधान के साथ centrifugation दोहराएँ 2 और अधिक बार, प्रत्येक स्पिन के बाद समाधान decanting. प्रत्येक बाद धोने के लिए STOP समाधान के 20 एमएल का प्रयोग करें.
- प्रत्येक स्पिन से पहले, 20 एमएल STOP समाधान में 50 एमएल ट्यूब में ऊतक गोली को धीरे से हिलाकर गोली को बाधित करें।
- 30 एस के लिए 300 x ग्राम पर 40 एमएल बर्फ ठंड एचबीएसएस और अपकेंद्रित्र के साथ ऊतक गोली को फिर से निलंबित करें।
- Decant और HBSS समाधान के साथ एक झूल-बकेट centrifuge का उपयोग कर centrifugation दोहराने दो बार, प्रत्येक स्पिन के बाद समाधान decanting. प्रत्येक धोने के लिए HBSS के 20 एमएल का प्रयोग करें.
- प्रत्येक स्पिन से पहले, गोली को बाधित, धीरे 20 एमएल HBSS समाधान युक्त ट्यूब मिलाते हुए ट्यूब के नीचे से अलग करने के लिए.
- पिछले centrifugation के बाद सभी HBSS हटा दें.
- फिर गोली युक्त 50 एमएल ट्यूब के लिए कमरे के तापमान घनत्व ढाल के 5 एमएल जोड़ें। भंवर कम गति पर संक्षेप में जब तक homogenized.
- 50 एमएल ट्यूब के लिए कमरे के तापमान घनत्व ढाल का एक और 5 एमएल जोड़ें। भ्रमिल मत करो /
नोट: यह स्थिर रहने के लिए महत्वपूर्ण है और अभी भी इतनी के रूप में बेहतर ढाल व्यवधान के बिना फार्म के लिए अनुमति देने के लिए. - पिपेट 10 एमएल कमरे के तापमान HBSS बफर ट्यूब में (घनत्व ढाल युक्त), ड्रॉप-बाय-ड्रॉप धीरे और धीरे-धीरे एक ढाल के रूप में अनुमति देने के लिए। HBSS dropwise जोड़ने के लिए एक 10 एमएल पिपेट के साथ एक पिपेट बंदूक का प्रयोग करें।
- एक झूलते-बकेट अपकेंद्रित्र का उपयोग करते हुए, 15 मिनट के लिए 1700 x ग्राम पर स्पिन ट्यूबों को घुमाएं। ढाल को बनाए रखने के लिए दोनों त्वरण/डिसेलरेशन की गति को सबसे कम सेटिंग में परिवर्तित करना सुनिश्चित करें (चित्र 7C)।
- स्पिन के बाद, ग्रेडिएंट को परेशान किए बिना ट्यूबों को सावधानी से हटा दें। ठंड HBSS (पिपेट HBSS ऊपर और नीचे) के साथ पूर्व गीला एक पिपेट बंदूक का उपयोग करना, आइलेट्स की परत बाहर pippette (5-10 एमएल) घनत्व ढाल और HBSS के बीच नए 50 एमएल आइलेट संग्रह ट्यूब में गठन किया।
नोट: यह पिपेट की भीतरी दीवारों से चिपके रहने से आइलेट्स को रोकने के लिए आइलेट्स को पाइपकरने से पहले ठंडे एचबीएसएस के साथ पिपेट गीला करने के लिए उपयोगी है।- यदि पृथक्करण अधूरा है, तो आइलेट्स घनत्व प्रवणता परत में दिखाई देंगे, पूरे 10 एमएल घनत्व ढाल (नीचे परत) के साथ-साथ इंटरफ़ेस पर गठित आइलेट परत (केवल HBSS शीर्ष परत के पीछे लगभग 8-10 एमएल छोड़ने के लिए)।
नोट: दोनों islet परत और घनत्व ढाल परत (नीचे परत) एकत्रित मलबे जो islet उठा समय लंबा कर सकते हैं के संग्रह में परिणाम कर सकते हैं, लेकिन कोई अन्य कदम बदल जाएगा. इन दोनों परतों को इकट्ठा करना आवश्यक नहीं है जब islet परत अच्छी तरह से गठन किया है.
- यदि पृथक्करण अधूरा है, तो आइलेट्स घनत्व प्रवणता परत में दिखाई देंगे, पूरे 10 एमएल घनत्व ढाल (नीचे परत) के साथ-साथ इंटरफ़ेस पर गठित आइलेट परत (केवल HBSS शीर्ष परत के पीछे लगभग 8-10 एमएल छोड़ने के लिए)।
- islets युक्त नए 50 एमएल ट्यूब में बर्फ ठंड HBSS के 20 एमएल जोड़ें, तो एक झूलते-बकेट सेंट्रीफ्यूज में 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- स्पिन के बाद, ध्यान से पिपेट (decant नहीं )supernatant बाहर (तल पर $ 3 एमएल छोड़) नीचे islets युक्त गोली परेशान किए बिना. महादलित को त्याग दें।
- कम से कम 3 बार धोने और centrifuging दोहराएँ. हर बार HBSS के 20 एमएल जोड़ें, और प्रत्येक स्पिन से पहले गोली निलंबित करने के लिए सुनिश्चित हो.
- उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में RPMI-1640 पूरा मीडिया बोतल गर्म करें। पिछले centrifugation के बाद, HBSS S के सभी निकालें और पहले से तैयार पूरा RPMI-1640 मीडिया के 4 एमएल जोड़ें (FBS, आईएनएस-1 सेल पूरक और पेनिसिलिन /
- धीरे ट्यूब घूमता द्वारा गोली दूर और तुरंत एक 100 मिमी पेट्री डिश में RPMI-1640 मीडिया डालना. ट्यूब के लिए RPMI-1640 मीडिया का एक और 5 एमएल जोड़ें और धीरे से यह घूमता है किसी भी शेष islets धोने के लिए, तो भी एक ही पेट्री डिश में मीडिया डालना.
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक 20 डिग्री एल पिपेट का उपयोग पेट्री डिश से स्वस्थ islets लेने के लिए, और उन्हें पूरा RPMI 1640 मीडिया के 10 एमएल युक्त एक नया पेट्री डिश में डाल दिया। जब एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है, islets अपेक्षाकृत पारदर्शी, wispy एक्सोक्रिन ऊतक की तुलना में एक चिकनी सतह के साथ गोलाकार /
नोट: विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी का आवर्धन आमतौर पर 12ण्5-16x पर सेट किया जाता है। Islet उपज तनाव, उम्र और माउस के सेक्स सहित विभिन्न कारकों के आधार पर अलग अलग होंगे. इस प्रोटोकॉल आमतौर पर पैदावार 250-350 स्वस्थ C57BL/6J माउस उम्र 4-10 महीने पुराने से स्वस्थ islets.
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक 20 डिग्री एल पिपेट का उपयोग पेट्री डिश से स्वस्थ islets लेने के लिए, और उन्हें पूरा RPMI 1640 मीडिया के 10 एमएल युक्त एक नया पेट्री डिश में डाल दिया। जब एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है, islets अपेक्षाकृत पारदर्शी, wispy एक्सोक्रिन ऊतक की तुलना में एक चिकनी सतह के साथ गोलाकार /
- 5% सीओ2 जलसेक और 95% आर्द्र हवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में islets अगले दिन प्रयोगों के लिए रात भर, या एक बाद में समय पर वांछित विश्लेषण के लिए islets फ्रीज इनक्यूबेट।
- एक बार islets जमे हुए हैं, वे स्राव परख के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, केवल आरएनए या प्रोटीन परिमाणीकरण. फ्रीज करने के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, उन्हें HBSS बफर में जगह, बफर के 200-500 $L में सभी islets इकट्ठा, 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण, 1-2 मिनट के लिए centrifuge 350 x ग्राम, supernatant कोई अधिक से अधिक छोड़ने को हटा 30-40 $L समाधान, में जगह -20 डिग्री सेल्सियस लघु अवधि के भंडारण के लिए ( कई दिनों) या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस।
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Representative Results
इस प्रक्रिया के उचित पूरा होने के पेट की गुहा में माउस शरीर रचना विज्ञान की कुछ समझ की आवश्यकता है. यह Vater के ampulla की उचित पहचान और आम पित्त नली के clamping के लिए अनुमति देता है. संपूर्ण प्रक्रिया सामान्यतः 1-2 ज लेती है। यह एक ही समय में 4-6 चूहों से islets को अलग करने के लिए और अधिक कुशल है, तो कई नमूने एक साथ centrifuged किया जा सकता है. आइलेट-पिकिंग के लिए समय भिन्न होता है, आइलेट्स की संख्या और पाचन की दक्षता के आधार पर; यह मोटे तौर पर एक घंटे लेने के लिए ले जा सकते हैं 250-350 islets से 1 माउस.
इस कागज में, बहुत यथार्थवादी छवियों की एक संख्या शामिल हैं: चित्र 3 माउस के पेट की गुहा से पता चलता है, आम पित्त नली और यकृत धमनी को उजागर. चित्रा 4 सामान्य पित्त नली की पूरी लंबाई से पता चलता है, जो एक हल्का रंग प्रतीत होता है, साथ ही Vater के ampulla, जो समय के पास बड़ा और shinier है (जहां सुई डाला जाएगा) अग्न्याशय और ग्रहणी के बीच. यकृत में कोलैजा पी के प्रवाह को रोकने के लिए यकृत के निकट सामान्य पित्त नलिका और यकृत धमनी बंडल पर एक क्लैम्प रखा जाता है। पित्त नली को सही ढंग से या काफी तंग करने में विफलता के परिणामस्वरूप अग्न्याशय के रिसाव और अपूर्ण भ्रम में परिणाम होगा। चित्र 5 आम पित्त नली में वेटर के ampulla में डाला सुई से पता चलता है. एक बार सुई आम नलिका में है, forceps सुई को स्थिर करने के लिए यह नली puncturing जबकि इंजेक्शन से रोकने के लिए उपयोग किया जाता है. एक बार इंजेक्शन शुरू होता है, अग्न्याशय निकट अंत करने के लिए निकट अंत से प्रफुल्लित करने के लिए शुरू हो जाएगा; स्प्लेनिक क्षेत्र कोलैजाइन इंजेक्शन के बारे में 1 एमएल के बाद फुलाना शुरू कर देना चाहिए। आंतों में बैकफ्लो ग्रहणी की अवांछनीय मुद्रास्फीति का कारण बन सकता है; इस सुई की नियुक्ति को पुनर्समायोजित करके उपाय किया जा सकता है (यह एक छोटे से बाहर खींच, या थोड़ा गहरा reinsert) और ठीक से संदंश का उपयोग कर सुई स्थिर द्वारा. इंजेक्शन एक सफलता माना जाता है अगर अग्न्याशय के सभी क्षेत्रों फुलाया जाता है (डुओडेनल, गैस्ट्रिक, और प्लीहा lobes) के रूप में चित्र 6में दिखाया गया है. अग्न्याशय को हटाने प्लीनिक क्षेत्र से शुरू करना चाहिए. फुलाया अग्न्याशय ठीक शल्य कैंची का उपयोग कर खंड में कटा हुआ है (चित्र 7A) . 12-13 मिनट पाचन और हाथ से हिलाद्वारा मिश्रण के बाद, ऊतक युक्त निलंबन अधिक सजातीय प्रतीत होता है (चित्र 7ख)। बाद में, islets centrifugation के बाद घनत्व ढाल द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. चित्र 7C से पता चलता है कि एचबीएसएस और अपकेंद्रण के बाद घनत्व प्रवणता के बीच एक islet निलंबन परत का गठन किया है। अच्छा / स्वस्थ islets चिकनी दौर के आकार के रूप में दिखाई देते हैं; बुरा/क्षतिग्रस्त आइलेट्स किसी न किसी किनारों को दिखाते हैं, और अपाच्य एक्सोक्रिन ऊतक अनियमित आकार दिखाता है और चित्र 8में दिखाए गए अनुसार अधिक पारदर्शी दिखाई देता है।
चित्रा 1: सर्जिकल उपकरण।
घुमावदार सर्जिकल कैंची, कवर ग्लास संदंश, माइक्रो एडसन संदंश, घुमावदार संदंश, छोटे सर्जिकल कैंची, और श्वार्ट्ज माइक्रो सेरेफिन्स (माइक्रोवास्कुलर क्लैम्प) दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण.
इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम जिगर के पास आम पित्त नली के clamping हैं, और अग्न्याशय को पचाने के लिए आम पित्त नली में Vater के ampulla के माध्यम से collagenase पी इंजेक्शन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: सामान्य पित्त नली का स्थान।
फोर्सप्स सामान्य पित्त नलिका और यकृत धमनी बंडल को पकड़ते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: सामान्य पित्त नली और वेटर के ampulla का चित्रण|
यकृत के निकट सामान्य पित्त नलिका और यकृत धमनी बंडल पर एक क्लैम्प रखा जाता है. काले तीर वेटर के ampulla जहां सुई डाला जाएगा करने के लिए इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: सामान्य पित्त नली का कनफल।
आम पित्त नली के उचित कैनुलेशन के बाद, वेटर के ampulla trypan नीले रंग के साथ इंजेक्शन है (प्रदर्शन उद्देश्य के लिए केवल) बेहतर आम पित्त नली की नियुक्ति पर जोर देने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ाााला 6: फुला हुआ अग्न्याशय।
डॉटेड लाइन पूरी तरह से perfused अग्न्याशय की सीमा से पता चलता है. फोर्सप्स प्लीहा क्षेत्र को पकड़ते हैं जहां आइलेट्स सबसे अधिक केंद्रित होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ााालां 7: आइलेट अलगाव और शुद्धि चरण।
(ए) पाचन से पहले अग्न्याशय के यांत्रिक रूप से कटा हुआ ऊतक टुकड़े। (बी) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में ऊष्मायन के 13 मिनट के बाद कोलैडेस-पर्फस अग्न्याशय के पाचन क्रिया-समुत्थान ऊतक निलंबन, हाथ से मिश्रण के 30 s द्वारा पीछा किया। (ग) ईलेट निलंबन परत एचबीएसएस और अपकेंद्रण के बाद घनत्व प्रवणता के बीच बनाई जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8: प्रतिनिधि फ्लोरोसेंस सेल-इमेजर से islet छवियों।
(ए) अच्छा आइलेट्स, खराब आइलेट्स और एक्सोक्रिन ऊतक देखे जाते हैं। (बी) अच्छे आइलेट्स का एक समूह दिखाया गया है। (सी) पैनल एक अच्छा islet से जुड़े ungested एक्सोक्रिन ऊतक से पता चलता है. अच्छा / स्वस्थ islets चिकनी दौर किनारों दिखाने के लिए, लाल पत्र "जी" द्वारा संकेत दिया; बुरा / क्षतिग्रस्त islets अनियमित आकार और किसी न किसी किनारों को दिखाने के लिए, और नीले अक्षर "बी" द्वारा संकेत दिया जाता है। अपाच्य एक्सोक्रिन ऊतक पारदर्शी दिखाई देते हैं, अक्सर आइलेट्स से जुड़े होते हैं, और हरे अक्षर "ई" द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में कोलाजनेस भ्रम और पाचन शामिल है, इसके बाद आइलेट्स की शुद्धि की जाती है। इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रभावी इंजेक्शन और अग्न्याशय के पूर्ण भ्रमहैं 1,4,7. इस प्रोटोकॉल की वितरण विधि एंजाइम को इसलेट्स 1 के आस - पास के एक्सोक्रिन ऊतक को बेहतर ढंग से पचाने के लिए शारीरिक मार्गों को पार करने की अनुमति देतीहै. इसके अतिरिक्त, यह तकनीक प्लीहा क्षेत्र के पूर्ण पाचन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जिसमें आइलेट्स4,6की उच्चतम सांद्रता होती है। इस प्रोटोकॉल, अच्छी तरह से नियंत्रित पाचन समय और ध्यान से निष्पादित शुद्धि कदम के साथ, 250-350 स्वस्थ islets का उत्पादन कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल से अलग किए गए आइलेट्स का उपयोग ग्लूकोज से प्रेरित इंसुलिन स्राव एक्स विवो12का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। हमारे अनुभव से, इंसुलिन स्राव उच्च ग्लूकोज उत्तेजना पर 4 गुना वृद्धि हुई (22.2 एमएम) आधार रेखा की तुलना में (3.3 एमएम) में रात भर ऊष्मायन के बाद 5.5 एमएम ग्लूकोज युक्त RPMI-1640 पूरा मीडिया. लंबे समय तक ऊष्मायन (2-7 दिनों) के तहत आइलेट्स की survivability/कार्यक्षमता का परीक्षण नहीं किया गया है।
हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल विस्तृत नोट्स और दृश्य प्रदर्शनभीत शामिल है, कुछ समायोजन के लिए उच्च उपज और उच्च गुणवत्ता islets के लिए इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने की जरूरत है. दो सबसे आम समस्याओं है कि सफलता में बाधा हो सकती है Vater के ampulla या वाहिनी के आकस्मिक पंचर के अनुचित cannulation हैं. इन से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रवेश की साइट ठीक है जहां ampulla ग्रहणी के साथ मिलता है। इस क्षेत्र की पहचान करने के लिए बड़ा और अपेक्षाकृत आसान है, जो गंभीरता से वाहिनी की अखंडता समझौता किए बिना कई punctures के लिए अनुमति देता है. एक बार एम्पुला के भीतर, सुई का अभिविन्यास कोण के बजाय नलिका के साथ समानांतर होना चाहिए। इस बिंदु पर, वाहिनी की लंबाई के बारे में 1 डिग्री 4 के लिए नली में सुई धक्का, और फिर धीरे धीरे कोलैजा इंजेक्शन जबकि forceps के साथ सुई को स्थिर; यह सुई को दबाव में झुकने से रोकने में मदद करेगा और गलती से नलिका को puncturing. अन्य समस्याओं में अग्न्याशय के अधिक या अंडर-पाचन शामिल हो सकते हैं; यह उम्र के आधार पर संशोधन की आवश्यकता हो सकती है, तनाव और चूहों के सेक्स. अधिक पाचन (एंजाइमी और यांत्रिक) या घनत्व ढाल के लिए लंबे समय तक जोखिम के कारण क्षतिग्रस्त आइलेट्स हो सकता है। ये समान विधियों के लिए मौजूद सामान्य समस्याएँ हैं; कुछ मामूली समायोजन महत्वपूर्ण सुधार उपज चाहिए. एक सुझाव है जब मुद्दों के इन प्रकार के साथ काम करने के लिए एक समय में संशोधित करने के लिए एक चर का चयन करने के लिए है (उदा., पाचन या collagenase की एकाग्रता के समय).
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ एंजाइम वितरण का मार्ग है: कोलाजनेस पी होने से एक आसान शारीरिक मार्ग का उपयोग करके एक्सोक्रिन अग्न्याशय को सीधे पचाने के लिए जो पाचन क्षमता1को बढ़ाता है। इस विधि के लिए अग्न्याशय excising की विधि की तुलना में islets की संख्या में 50% की वृद्धि उपज की सूचना दी गई है, यह काट, और यह कोलैजा में उजागर13. इस प्रोटोकॉल केवल एक घनत्व ढाल के उपयोग की आवश्यकता है, यह काफी कम श्रम गहन और अधिक लागत प्रभावी बनाने, अन्य तरीकों जो विभिन्न घनत्व पर कई gradients की तैयारी की आवश्यकता की तुलना में, या जटिल पर्कॉल विधि के लिए अतिरिक्त समय1,8,11की आवश्यकता होती है . इस प्रोटोकॉल में कार्यरत ग्रेडिएंट पद्धति का उपयोग अन्य4के आइलेट पृथक्करण में भी किया गया है . आइलेट अलगाव की इस विधि अग्नाशय islets का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर उपकरण के साथ वैज्ञानिक प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल के भविष्य अनुप्रयोगों जब मधुमेह चूहों के साथ निपटने प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए परिवर्तन शामिल हैं. के रूप में एट अल मनाया है, मधुमेह चूहों, ग्लूकोज के स्तर के आधार पर, कम islets उपज (कम से कम 100), कम आकार और islets की उपस्थिति के साथ4. हम इस घटना को देखा है और विश्वास है कि मधुमेह islets एंजाइमी और यांत्रिक पाचन जो विशेष देखभाल की आवश्यकता के लिए और अधिक कमजोर कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, आइलेट घनत्व घनत्व ढाल में अपनी उपस्थिति को बदल सकता है, प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन मधुमेह islets की उपज को बढ़ाने में मदद मिलेगी.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम योजनाबद्ध आरेख के अपने कलात्मक चित्रण के लिए सुश्री जेनिफर Munguia के लिए अत्यंत आभारी हैं. हम अपने संपादकीय सहायता के लिए ह्यूस्टन के सामुदायिक सार्वजनिक रेडियो स्टेशन KPFT में श्री माइकल आर Honig धन्यवाद. इस अध्ययन अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन #1-15-बीएस-177 (वाईएस), और NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS) द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य एवं कृषि संस्थान, हैच परियोजना 1010840 (वाईएस) और आर01 डीके095118 (एसजी) द्वारा भी सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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