Summary
نقدم هنا، منهجيات رواية اثنين وبسباكت و mPACT، لتحقيق أقصى حد من الشفافية الضوئية والتحليل المجهري اللاحقة للمفرج الأنسجة في القوارض سليمة كامل الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
منذ وضع الوضوح، بيويليكتروكهيميكال مسح تقنية تسمح لتعيين النمط الظاهري ثلاثية الأبعاد داخل أنسجة شفافة، العديد من منهجيات رواية المقاصة بما في ذلك مكعب (تصوير الدماغ واضحة ودون عائق الكوكتيل والتحليل الحسابي)، ميثاق (تقنية الوضوح السلبي)، وخريطة (تحليل المكبرة البروتين) والتبديل (مراقبة وقت تفاعل المنظومة) وحركية من المواد الكيميائية قد أنشئت مجموعة الأدوات القائمة لتوسيع التحليل المجهري للأنسجة البيولوجية. هذه الدراسة تهدف إلى تحسين بناء وتحسين الإجراء الأصلي للميثاق لمجموعة أنسجة القوارض سليمة، بما في ذلك كامل الجهاز العصبي المركزي (CNS) والكليتين والطحال والأجنة الماوس كله. وصف بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) و mPACT (تعديل ميثاق)، توفر هذه التقنيات الجديدة وسيلة فعالة جداً لرسم خرائط الدوائر الخلية وتصور الهياكل سوبسيلولار في الأنسجة العادية والمرضية سليمة. في بروتوكول التالية، ونحن نقدم عرضاً تفصيلاً، خطوة بخطوة حول كيفية تحقيق إزالة الأنسجة القصوى مع الحد الأدنى من غزو سلامتهم الهيكلي عن طريق بسباكت و mPACT.
Introduction
هدفا أساسيا للتحقيق العلمي والسريري ويشمل تحقيق فهم كامل لهيكل الجهاز ووظيفة؛ ومع ذلك، غالباً ما تخدم طبيعة معقدة للغاية لأجهزة الثدييات كحاجز أمام تحقيق هذا الهدف1. يحقق الوضوح (تبادل "الدهن واضحة" تهجين الاكريلاميد جامدة المتوافقة مع تصوير تسسو-hYdrogel)2،3،4، الذي يشمل بناء هجين المائية القائمة على مادة اكريلاميد من أنسجة سليمة، إزالة البصرية لمجموعة متنوعة من الأجهزة، بما في ذلك الدماغ والكبد، والطحال، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية على5. وهكذا مكن الوضوح التصور ليس فقط ولكن أيضا الفرصة لتشريح ناعما الشبكات الخلوية المعقدة والأنسجة مورفولوجيس دون الحاجة لتمزيقها.
وبغية تحقيق إزالة الأنسجة، توظف الوضوح أساليب الغرواني الكهربي إزالة المحتوى الدهني للعينة في متناول اليد. بينما قد لوحظ الوضوح لإنتاج هجن المائية الأنسجة استقرارا ماديا، وقد أظهرت الدراسات أن استخدام أساليب المقاصة (إلخ) الأنسجة الغرواني الكهربي يثمر نتائج متغير من حيث نوعية الأنسجة، بما في ذلك براوننج، حانمه الضرر، و فقدان البروتين5،6. لمعالجة هذه القضايا، تم تعديل البروتوكولات مثل ميثاق (تقنية الوضوح السلبي)، الذي يحل محل العلاج إلخ مع تقنية ديليبيديشن استناداً إلى المبنى للمجهول، والمنظفات الأيونية، نمواً7،،من89. على الرغم من تحقيق قدر أكبر من اتساق في النتائج، بيد أن الميثاق يتطلب المزيد من الوقت للحصول على التصريح القصوى. وعلاوة على ذلك، أيا من هذه الأساليب بعد لم تطبق بشكل كامل الجهاز العصبي المركزي، أو في أكبر نماذج القوارض مثل الفئران وخنازير غينيا.
وتسعى الدراسة الحالية لمعالجة هذه القيود باقتراح منهجيات جديدة، بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) و mPACT (تعديل ميثاق)، لتسهيل إزالة سريعة لكامل الجهاز العصبي المركزي والأجهزة الداخلية في نماذج الماوس وفار10. على وجه التحديد، بسباكت عمليات الأنسجة في الاكريلاميد 4% و 0.25% خامسا-044 في خطوتين منفصلة أثناء تشكيل المائية؛ mPACT أساسا ينطوي على نفس الخطوات ولكن يكمل الحل القائم على الحزب الديمقراطي الصربي المقاصة مع 0.5% α-ثيوجليسيرول ككاشف رئيسية. كلا أساليب تسخير نظم الدورة الدموية الجهازية واو الذاتية لخفض الوقت اللازم لإنتاج التخليص الضوئية. كدليل على المبدأ، نحن شرح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحليل أنماط الأوعية الدموية في الأنسجة المجازين10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع إجراءات أقرتها لجنة أخلاقيات البحوث المناسبة في "كلية الطب في جامعة يونسي". يتم التضحية بجميع الحيوانات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات المختبرية في "كلية الطب في جامعة يونسي".
1-إعداد الكواشف
تنبيه: بارافورمالدهيد (PFA)، الاكريلاميد والصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) المهيجات السامة وهكذا ينبغي التعامل معها في غطاء دخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية؛ مختبر معطف، قفازات، نظارات واقية).
- الحل اكريلاميد (A.A) 4% (A4P0): إضافة 20 مل من محلول الاكريلاميد 40% إلى 180 مل من 0.1 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- حل خامسا-044 0.25%: إضافة 0.5 غ 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] مسحوق هيدروكلوريد (خامسا-044) إلى 200 مل من 0.1 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). بينما يمكن تخزين المسحوق خامسا-044 في درجة حرارة الغرفة، يجب تخزينه في 4 درجات مئوية عند solubilization في برنامج تلفزيوني. للحصول على أفضل النتائج، تعد فقط مقدار الحل اللازم لهذه التجربة.
- حل ميثاق كوكتيل: إضافة 10 جرام من مادة اكريلاميد إلى 225 مل محلول بارافورمالدهيد (PFA) 4%، وضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع 4% منهاج عمل بيجين. قبل الشروع في الاستخدام، إضافة 100 ملغ مسحوق خامسا-044 إلى 40 مل مخلوط في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- ميثاق مسح المخزن المؤقت الحل: إضافة 40 غ من دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) إلى 350 مل من 0.1 م برنامج تلفزيوني وضبط مستوى الصوت إلى 500 مل مع برنامج تلفزيوني 0.1 متر. لمسح الحل mPACT، إضافة 0.5% α-ثيوجليسيرول إلى ميثاق مسح المخزن المؤقت للحل.
- الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت منذ 2 أسابيع بالب الفئران الذكور؛ وكانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة SD-الفئران الذكور 2 أسبوع من العمر.
2-التخدير والجراحة التروية
تنبيه: منهاج عمل بيجين ومادة اكريلاميد المهيجات السامة وهكذا ينبغي التعامل معها في غطاء دخان مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
- تخدير الحيوان في غرفة خالية من العوامل الممرضة مع 30 ملغ/كغ زوليتيل استخدام المحاقن 1 مل بإبرة مقياس 26. رصد هذا الحيوان 5-10 دقيقة.
- مجرد الحيوان وصلت طائرة جراحية التخدير، استخدم الأسلوب تو-رشة استجابة لتحديد عمق التخدير. تأكيد مشكلة عدم استجابة.
ملاحظة: اتبع الخطوات التالية التي تنطوي على عملية جراحية الماوس وفار بروتوكول مماثل المستخدمة في دراسة سابقة11. - جعل شق 5-6 سم تحت القفص الصدري، عن طريق أهاب وجدار البطن.
- استخدام مقص منحنى، كليلة جعل شق في الحجاب الحاجز، بالباتينج منطقة الصدر لتحديد موقع شق مسبقاً.
- تمديد الشق عبر طول القفص الصدري لفضح التجويف الجنبي.
- تحل محل الرئتين بعناية. قم بقطع من خلال القفص الصدري ما يصل إلى الترقوة. باستخدام مقص آيريس، جعل شق صغير إلى نهاية الخلفي البطين الأيسر. إدراج إبرة 18-قياس التروية بلانت أو الزيتون مقلوب في الشريان الاورطي تصاعدي، مرورا قطع بطين.
- تأمين الإبرة ومنع التسرب لقط القلب مع هيموستات. بدلاً من ذلك، استخدم هيموستات معدلة المشبك الشريان الاورطي حول تلميح إبرة.
- إجراء شق كبير في الاذين الأيمن، مع الحرص على ضمان الحد الأدنى من الضرر للشريان الاورطي تنازلي. الفئران جاهز الآن التروية.
3-كله نضح وتشريح الفئران
تنبيه: منهاج عمل بيجين ومادة اكريلاميد المهيجات السامة وهكذا ينبغي التعامل معها في غطاء دخان مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
ملاحظة: الخطوات التالية نضح كله مماثلة لبروتوكول يستخدم في دراسة سابقة من قبل وو وآخرون. (2016) 10 , 11.
- إرفاق الاذين الأيمن للقلب إلى إبرة عيار 18، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات الهواء.
- باستخدام حقنه 50 مل، بسرعة وبشكل متساو ضخ 50 مل من البرد م 0.1 برنامج تلفزيوني الحل التي تحتوي على الهيبارين (10 وحدات/mL).
- قم بتوصيل الإبرة 18-قياس أنبوب مضخة تمعجية.
- يغسل مع 200 مل من البرد م 0.1 برنامج تلفزيوني الحل التي تحتوي على الهيبارين (10 وحدات/mL) سرعة دوران من 10 مل/دقيقة.
- فيكس مع 250 مل من 4% الباردة PFA الحل سرعة دوران من 10 مل/دقيقة. ينبغي أن تكون الفئران شديدة في هذه المرحلة.
- جمع وتخزين حل منهاج العمل المتبقي للتخلص منها.
- للميثاق، نتخلل الأنسجة مع حل ميثاق كوكتيل مبردة 4% منهاج عمل بيجين، والاكريلاميد 4% ومسحوق خامسا-044 0.25% مع إبرة عيار 18، ومن ثم قم بإزالة الرأس والعمود الفقري. كشف الجمجمة عن طريق إجراء شق خط الوسط من الرقبة إلى الآنف. هذه الخطوة نضح إضافية غير ضرورية لأساليب بسباكت و mPACT؛ بعد التثبيت، على الفور عزل في الرأس والعمود الفقري وفضح الجمجمة.
- تعرض قاعدة الجمجمة بإزالة أي بقايا الرقبة والعمود الفقري العضلات.
- استخدم رونجيورس ومقص لقشر بعيداً في الجمجمة. إزالة المخ والحبل الشوكي.
- تخزين الأنسجة في 4% منهاج العمل عند 4 درجة مئوية؛ ويمكن تخزين الأنسجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
4-Hydrogel مونومر ضخ والبلمره CNS الجرذ والفأر
تنبيه: اكريلاميد، والحزب الديمقراطي الصربي، α-ثيوجليسيرول ومنهاج عمل بيجين المهيجات وهكذا ينبغي التعامل معها بغطاء دخان وتبول المناسبة.
-
ميثاق (المنفعلة مسح تقنية)
- عزل وثقافة كامل الجهاز العصبي المركزي (المخ والحبل الشوكي) من الثابت لدى الفئران والجرذان إلى أنبوب 50 مل تحتوي على حل ميثاق كوكتيل مبردة 4% منهاج عمل بيجين والاكريلاميد 4%، ومسحوق خامسا-044 0.25% ومخزن في 4 درجات مئوية عن 24 h. ضمان أن الأنسجة هي مغمورة تماما في ليالي أولوتيون.
- تضمين العينة في غاز النيتروجين لجل 10 دقيقة باستخدام أنسجة نظام التهجين متصلة بخزان نيتروجين: تعيين النظام إلى 37 درجة مئوية. نقل الأنسجة إلى أنبوب 50 مل الطازجة الباردة (4 درجة مئوية) ميثاق يتضمن الحل كوكتيل والاتصال مع غطاء الأنبوبة، ثم اتجه في الفراغ.
- بلمرة المائية، ضع الأنبوبة التي تحتوي على العينة في حاضنة تهز (150 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية) ح 3، أو حتى اكتمال البلمرة.
- باستخدام ورق نشاف (انظر الجدول للمواد)، إزالة المائية مبلمرة المتبقية المحيطة بالانسجة.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 50 مل المحتوية على إزالة الحل (الحزب الديمقراطي الصربي 8% في م 0.1 برنامج تلفزيوني، pH 8.0).
- ضع العينة في حاضنة تهتز تعيين إلى 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى تم تطهير الأنسجة. وفي المتوسط، يستغرق حوالي 20 يوما للماوس الجهاز العصبي المركزي لتحقيق الوضوح الكامل.
-
بسباكت (عملية منفصلة تقنية مسح السلبي)
- عزل كامل الجهاز العصبي المركزي (المخ والحبل الشوكي) مع قطع العظام ومقص من منهاج عمل بيجين--الثابتة لدى الفئران والجرذان على مقاعد البدلاء نظيفة.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 50 مل يحتوي على 4% ضمان منهاج عمل بيجين، ومخزن في 4 درجات مئوية ل 24 h. أن الأنسجة هي مغمورة تماما في مثبت.
- غسل الأنسجة الثابتة ح 1 في برنامج تلفزيوني 0.1 M، وثم نقل إلى حل A4P0 (الاكريلاميد 4% في برنامج تلفزيوني 0.1 M). مخزن في 37 درجة مئوية ح 24.
- غسل الأنسجة لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 0.1 متر.
- تزج الأنسجة في 0.25% خامسا-044 في برنامج تلفزيوني 0.1 متر. تخزين في 37 درجة مئوية ح 6-24 ومن ثم نقل إلى حل خامسا-044/برنامج تلفزيوني 0.25% الطازجة.
- تضمين العينة في غاز النيتروجين لجل 10 دقيقة باستخدام أنسجة التهجين النظام (انظر الجدول للمواد) متصل بخزان نيتروجين: نقل الأنسجة إلى أنبوب 50 مل تتضمن الطازجة الباردة (4 درجة مئوية) حل خامسا-044/برنامج تلفزيوني 0.25%، والاتصال مع غطاء الأنبوبة. بدوره على الفراغ.
- نقل الأنسجة لإزالة الحل (الحزب الديمقراطي الصربي 8% في م 0.1 برنامج تلفزيوني، pH 8.0).
- احتضان العينة في حاضنة تهتز تعيين إلى 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى تم تطهير الأنسجة. وفي المتوسط، فإنه يأخذ حوالي 17 يوما للماوس الجهاز العصبي المركزي لتحقيق الوضوح الكامل.
-
mPACT (تم التعديل السلبي مسح تقنية)
- عزل كامل الجهاز العصبي المركزي (المخ والحبل الشوكي) مع قطع العظام ومقص من منهاج عمل بيجين--الثابتة لدى الفئران والجرذان على مقاعد البدلاء نظيفة.
- اتبع الخطوات 4-2-2-4.2.8 بروتوكول بسباكت.
- نقل الأنسجة لإزالة الحل. ملاحظة خلافا للبروتوكولات ميثاق وبسباكت، mPACT يتطلب حلاً مقاصة تتألف من 0.5% α-ثيوجليسيرول بالإضافة إلى 8% الحزب الديمقراطي الصربي في م 0.1 برنامج تلفزيوني، pH 8.0. Α-ثيوجليسيرول هو عامل إنضاج الأمم المتحدة التي تساعد على إزالة الأنسجة أكثر سرعة وفعالية. ضمان أن الأنسجة هي مغمورة تماما في الحل.
- ضع العينة في حاضنة تهتز تعيين إلى 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى تم تطهير الأنسجة. وفي المتوسط، فإنه يأخذ حوالي 2 أسابيع للماوس الجهاز العصبي المركزي لتحقيق الوضوح الكامل.
5-معامل الانكسار مطابقة وإيمونوستينينج لمسح الجهاز العصبي المركزي
ملاحظة: nدواليب (نيكودينز "الحل" القائم على الانكسار مطابقة) يتكون من مسحوق نيكودينز 0.8 g/mL حله في المخزن المؤقت قاعدة 30 مل (0.01 ٪ أزيد الصوديوم و 20 توين في م 0.1 برنامج تلفزيوني، pH 8.0). من المستحسن أن يتم وضع الحل في 37 درجة مئوية تهز الحاضنة للسماح المذيب المناسب من المسحوق.
- احتضان الأنسجة في 0.1% كتلة X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 0.1 م عن ح 2، ثم مع 2% الأبقار ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني 0.1 م عن ح 6.
- تغسل أقسام ثلاث مرات في ببست (0.1% 20 توين في برنامج تلفزيوني 0.1 M) ل 2 حاء وصمة عار الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية (في هذه الحالة، جسم CD31 بيكم أرنب المضادة، التي بقع الأوعية الدموية) لمدة يومين.
- وصمة عار الأقسام مع الأجسام المضادة الثانوية (في هذه حالة، ماعز أرنب المضادة Cy3 مفتش فلورسنت المتقارن) في جيش صرب البوسنة 2% لمدة يومين.
- المسمى غسل الأنسجة ثلاث مرات في ببست ح 2، ومخزن في 15 مل دواليب ن2-10 أيام.
- قبل التصوير، ونقل الأنسجة المسمى إلى كمية صغيرة من دواليب نعلى الأطباق 35-60 ملم أو زراعة الأنسجة. فيكس مع سيليكون حول الحافة السفلي للطبق.
- إضافة 1.5-2 مل دواليب جديدة ن.
6. معالجة الصور
- الحصول على صور أنسجة تطهير بلاط أثناء المسح الضوئي باستخدام تكبير 10 x ميكروسكوبيويث المسح الضوئي ليزر [كنفوكل] (انظر الجدول للمواد). للنسيج المسمى Cy3، استخدام أطوال موجية 550-600 نيوتن متر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توليد نموذج شفاف لاستخدام الجهاز العصبي المركزي كله الأمثل تقنيات إزالة المبنى للمجهول
سرعة تحقق إزالة البصرية الماوس وفار كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي باستخدام تقنيات مختلفة لإزالة المبنى للمجهول (الشكل 1). طيطي أنسجة المقاصة مع مرور الوقت يظهر في الشكل 2 ألف. على عكس الأسلوب الميثاق الأصلي، ينطوي بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) علاج عينات مع 4% مادة اكريلاميد (A4P0) وحل البادئ خامسا-044 0.25% في خطوتين منفصلة من أجل تشكيل هجين المائية. mPACT (تعديل ميثاق) يحسن كذلك عند بسباكت باستكمال مسح الحل مع 0.5% α-ثيوجليسيرول الحزب الديمقراطي الصربي 8%. مقارنة العينات التي تتم معالجتها عن طريق الاتفاق، بسباكت، و mPACT في يوم 14 وقدم في الشكل 2.
في دراسة سابقة، أبلغنا أنه حين يتحقق بروتوكول الاتفاق الأصلي إزالة البصرية في 23 يوما، بسباكت ومسح mPACT الماوس كامل الجهاز العصبي المركزي في فقط 20 و 14 يوما على التوالي10. في هذه الدراسة، عندما نعامل عينات المخ الماوس عبر بروتوكول mPACT، وجدنا أنها تحقق الشفافية الضوئية بعد 14 يوما (الشكل 2). عينات الجهاز العصبي المركزي كله الفئران معالجتها عن طريق بسباكت و mPACT أظهرت أيضا أن mPACT تحقيق إزالة القصوى بأكبر قدر من الكفاءة، كما أزيلت الأنسجة في 20 و 30 يوما، على التوالي (الشكل 3 أ، ب). تم مسح أدمغة الفئران الكبار وحدهم، خلافا للجهاز العصبي المركزي أكملها، مع mPACT في مجرد 5 أيام (الشكل 4 أ). تم تحليل أنماط الأوعية الدموية في أدمغة الفئران تم مسحها عن طريق الفلورة بعد بسباكت وتجهيز mPACT لإثبات جدوى هذه الإجراءات المقاصة لتحليل التشريحية والوظيفية للمخ (الشكل 4 باء، البيانات mPACT كما هو موضح في وو et al. عام 2016)10.
باستخدام هذه الأمثل السلبي الأنسجة إزالة البروتوكولات، كنا قادرين على تصور نماذج سليمة وشفافة للجهاز العصبي المركزي كاملة، على الرغم من أن تختلف أوقات المقاصة بين البروتوكولات الثلاثة. محسن السلبي مسح أساليب تحقيق الوضوح الجهاز في فترة أقصر من الوقت. أخذت معا، توحي هذه النتائج أن mPACT تطهير أسلوب يمكن أن تولد CNS الواضح ستابلي أكثر وأسرع من السابق السلبي تطهير الطرق. وهكذا، mPACT يحمل إمكانيات كبيرة لاستخدام تحليلات في المستقبل هيكلية والتشريحية لأجهزة الثدييات ويوفر ميزة كبيرة على الطرق القائمة من حيث الفعالية والسلامة.
جيل من الأجهزة الداخلية تم مسحها ضوئياً والأجنة باستخدام mPACT
بالإضافة إلى كل أنسجة الجهاز العصبي المركزي، الفئران الكبار الطحال والكلى أزيلت مع mPACT في 19 و 23 يوما، على التوالي (الشكل 5 أ، ب). كما تم تطهير أجنة الفأر في E10.5 و E13.5 بعد 3 أيام معالجة عن طريق بروتوكول mPACT. الشكل 5 ه- يظهر تصور أنماط الأوعية الدموية في الجنين كله، فضلا عن ميكروفاسكولاتوري لمنطقة الذيل الجنين الماوس وفار كودا الخيول والطحال الفئران. هذه النتائج تشير إلى أن mPACT يمكن استخدامها لتوليد نماذج شفافة من مجموعة متنوعة واسعة من الأنسجة والأعضاء لتحليل تشريحية ثلاثية الأبعاد.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لتقنيات إزالة السلبي الأمثل (ميثاق). ويرد موجز للخطوات الفردية التي تنطوي عليها كل من ثلاثة بروتوكولات اتفاق جنبا إلى جنب مع الكواشف اللازمة لكل خطوة. بروتوكول الاتفاق الأصلي هو البلمرة الأنسجة من تشكيل المائية مع خليط باردة من 4% منهاج عمل بيجين، والحل اكريلاميد (A.A) 4% 0.25% خامسا-044 البادئ الحل. بعد يتم بلمرة الأنسجة باستخدام غاز النيتروجين، فإنه يتم إلغاء تحديد سلبية مع مسح حل الحزب الديمقراطي الصربي 8%. بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) يستخدم عمليات معالجة منفصلة 0.25% خامسا-044 البادئ حل والحل A.A 4% لتشكيل المائية من النسيج؛ تختلف هذه الشروط من بروتوكول الاتفاق الأصلي. ويضيف mPACT (تعديل ميثاق) إضافية 0.5% α-ثيوجليسيرول لمسح الحل بروتوكول بسباكت الحزب الديمقراطي الصربي 8%. لكافة البروتوكولات الثلاثة، هي المحتضنة أنسجة سليمة في > = 37 درجة مئوية في حاضنة هز حتى حققت المحطة الفضائية الدولية إزالة القصوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الشفافية الضوئية للماوس كامل الجهاز العصبي المركزي (CNS) بإزالة الأنسجة السلبي. (أ) شيماتيزاتيون أنسجة الجهاز العصبي المركزي كله مسح عن طريق الأساليب المستندة إلى اتفاق مع مرور الوقت. (ب) مقارنة لتطهير السلبي ثلاثة بروتوكولات (الميثاق الأصلي، بسباكت، mPACT) في الماوس CNS كله في 14 يوما بعد المعالجة. (ج) إزالة البصري في الدماغ الماوس يتعرض لتجهيز mPACT أكثر من 14 يوما. لقد تم تعديل هذا الرقم من وو et al. عام 201610. حروف ج 2 3 ملم طويل القامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الشفافية الضوئية للفئران كله CNS الأنسجة وظيفة-بسباكت و mPACT. (أ) أنسجة الجهاز العصبي المركزي كله الفئران الكبار تحقيق إزالة البصرية القصوى مع بسباكت بعد 30 يوما. (ب) تحقيق الفئران الكبار كله أنسجة الجهاز العصبي المركزي إزالة البصرية القصوى مع mPACT بعد 20 يوما. قبل وبعد رسومات تخطيطية تبين حجم CNS كاملة قبل وبعد العلاج، مقاسا بالعين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التصور mPACT التجهيز وميكروفاسكولاتوري من الدماغ الفئران الكبار مقسمة. (أ) مقارنة للدماغ 4 مم سميكة الكبار الفئران الفرعين بعد mPACT التجهيز في 3 و 5 أيام. (ب) الإسقاط 3D من أنماط الأوعية الدموية في الدماغ الفئران الكبار تصور مع الأجسام المضادة CD31 بعد المعالجة بسباكت. مقياس 100 ميكرومتر والحانات وميكرون 1,500. لقد تم تعديل هذا الرقم من وو et al. عام 201610. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تجهيز mPACT أجهزة القوارض والأجنة الماوس كله. mPACT تحقيق الشفافية الضوئية في الفئران الكبار (A) الطحال والكلى (ب) في 19 و 23 يوما على التوالي. MPACT (ج) إنتاج أجنة الفأر E10.5 و E13.5 شفافة بعد 3 أيام. (د) تصور ميكروفاسكولاتوري مع مكافحة--CD31 في منطقة الذيل الجنين الماوس بعد المقاصة مع mPACT. (ﻫ) 3D الإسقاط المفرج في الفئران كودا الخيول والطحال الفئران (F) مع مكافحة--CD31، بعد المعالجة عن طريق mPACT. لقد تم تعديل هذا الرقم من وو et al. عام 201610. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين استخدمت أساليب الاستخراج سلبية، غير الغرواني الكهربي في ميثاق تحسن كبير في اتساق تحقيقه مع الأنسجة السابقة تطهير الطرق مثل الوضوح2،3،،من47 , 8، التقنية لا تزال تحمل العديد من أوجه القصور، هو الأكثر إلحاحا منها طول الفترة الزمنية اللازمة لتحقيق الوضوح الأنسجة القصوى12. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم تعديل ميثاق البروتوكولات التي تقلل إلى حد كبير الوقت اللازم للأنسجة المقاصة مع المحافظة على النسيج النزاهة وهيكل6،10. وعلاوة على ذلك، للمرة الأولى، علينا أن نظهر تطبيق نسيج إزالة البروتوكولات في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي وفي رتب أعلى نموذج القوارض، الجرذ10.
على وجه التحديد، بسباكت يشمل تجهيز العينة في الاكريلاميد 4% و 0.25% خامسا-044 في خطوتين منفصلة أثناء تشكيل المائية، بينما mPACT كذلك يستند إلى بسباكت وملاحق صحيفة بيانات السلامة 8% تطهير الحل مع α-ثيوجليسيرول 0.5%10. فصل الاكريلاميد واللاحقة خامسا-044 خطوة يتجنب الحاجة إلى إزالة المتبقية مونومرات أونبوليميريزيد المائية التي تحيط الأنسجة، والتي يمكن أن تعرض للخطر سلامة النسيج النهائي بعد تحقيق الشفافية مع الميثاق؛ بالإضافة إلى ذلك، وهذا يقلل كثيرا من الوقت اللازم لإنتاج التخليص البصرية القصوى. إضافة α-ثيوجليسيرول في أسلوب mPACT زيادة تسارع تطهير العملية13، كما α-ثيوجليسيرول هو عامل إنضاج الأمم المتحدة تساعد على مسح مناطق الأنسجة التي يصعب الوصول إليها باستخدام فقط الكواشف في أسلوب الاتفاق الأصلي 7 , 8 , 9.
مقارنة بين الميثاق وبسباكت و mPACT على أنسجة القوارض أظهرت أن بينما بسباكت يحسن الشفافية الضوئية بالنسبة لبروتوكول الاتفاق الأصلي، mPACT الأكثر كفاءة تمكن المقاصة وتصوير عالي الدقة اللاحقة لكل أسرة أجهزة الثدييات ومقطعة شرائح، كما يتبين في الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4. تبييض الدهن α-ثيوجليسيرول-تعتمد الأجهزة المصنعة في مفتاح أسلوب ثبت mPACT للاختلافات في الشفافية والكفاءة، والأنسجة الاستقرار مقارنة بالأساليب الأخرى إزالة اثنين. وهذا يسمح لتحليل ثلاثي الأبعاد السريع أجهزة المعالجة، وعلى وجه التحديد فيما يتعلق بالدم المفرج مورفولوجيا، عبر الفلورة والفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 5، هاء).
بينما إضافة α-ثيوجليسيرول للحل القائم على الحزب الديمقراطي الصربي المقاصة حاسمة للتعجيل بالشفافية الضوئية، فإنه أيضا قليلاً يزيد من هشاشة الأنسجة ويجعلها أكثر عرضه للتلف في مرحلة ما بعد المعالجة. تفوق واضح ل mPACT فيما يتعلق كفاءة تفوق هذا القيد؛ على الرغم من ذلك، يجري العمل حاليا التأكد من أنه يمكن تحقيق المقاصة القصوى مع الحد الأدنى للا مصروفات لسلامة الأنسجة.
وهكذا، وضع نتائجنا mPACT كأداة تحقيق قوية لتوفير تحليل ثلاثي الأبعاد من السمات الوظيفية والتشريحية لأجهزة الثدييات، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على الشبكات العصبية والمفرج الدم والأنسجة مصفوفة الهندسة المعمارية. التحرك إلى الأمام، نرى mPACT يمكن أن يكون مفيداً بشكل خاص في التحقيق في أعلى ترتيب الآليات البيولوجية التي تساهم في الفسيولوجيا المرضية للمرض، مثل إصابة الأنسجة وتشوهات، والسرطان والأعصاب المرض14،15،،من1617. جنبا إلى جنب مع دراسة الدقيقة الآليات الخلوية المعنية بالمرض، mPACT لديه القدرة على توفير مقياس متعدد أكثر اكتمالا، فهم المرض المتباينة كيف مختلف آليات التفاعل إلى نشوء النمط الظاهري الملاحظ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد المشروع "الدماغ كوريا 21 زائد" "العلوم الطبية"، جامعة يونسي هذا العمل. وبالإضافة إلى ذلك، كان يؤيد هذا العمل بمنحه من "مؤسسة البحوث الوطنية كوريا" (جبهة الخلاص الوطني-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
