Summary
כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.
Abstract
מאז הפיתוח של בהירות, bioelectrochemical פינוי טכניקה המאפשרת למיפוי פנוטיפ תלת מימדי בתוך רקמות שקוף, שפע של מתודולוגיות סליקה הרומן כולל מעוקב (הדמיה מוחית ברור, בלא הפרעה קוקטיילים וניתוח חישובית), מתג (פקד-מערכתיות של אינטראקציה עם הזמן) וקינטיקה של כימיקלים, מפה (מוגדל ניתוח של פרוטאום) ו ברית (טכניקה בהירות פסיבי), הוקמו להרחיב את ערכת הכלים הקיימים עבור ניתוח מיקרוסקופי של רקמות ביולוגיות. מטרות המחקר הנוכחי כדי לשפר ולמטב את הנוהל ההסכם המקורי עבור מערך של רקמות מכרסמים שלם, כולל את כל מערכת העצבים המרכזית (CNS), הכליות, הטחול העכבר כל העוברים. כינה psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), טכניקות הרומן אלה מספקים אמצעי מניעה תכופה מיפוי תא המעגלים והצגה של מבנים subcellular ברקמות נורמליים ופתולוגיים ללא פגע. בפרוטוקול הבא, אנו מספקים מתווה מפורט, צעד אחר צעד כיצד להשיג סיווג רקמות מקסימלי עם הפלישה מינימלי של המבנית שלהם דרך psPACT ו- mPACT.
Introduction
המטרה הבסיסית חקירה מדעית וקלינית כרוכה השגת הבנה מלאה של איבר מבנה ותפקוד; עם זאת, האופי המורכב ביותר של איברים יונקים לעתים קרובות מגישה כמחסום להשגת המטרה הזו1באופן מלא. בהירות (החלפת השומנים ברור hybridized אקרילאמיד נוקשה הדמיה תואמי Tisssue-הידרוג)2,3,4, הכוללת בנייה של היברידית הידרוג מבוססי אקרילאמיד רקמות ללא פגע, משיגה סיווג אופטי מגוון רחב של איברים, כולל את המוח, הכבד, הטחול, תוך שמירה על שלמות המבנה שלהם5. בהירות אפשרה ובכך לא רק ויזואליזציה, אלא גם הזדמנות דק לנתח רשתות הסלולר מורכבות מורפולוגיות רקמות ללא צורך חלוקתה.
כדי להשיג את סיווג רקמות, בהירות מעסיקה electrophoretic שיטות להסרת התוכן השומנים המדגם בהישג יד. בעוד בהירות נרשמה לייצור רקמות במצב יציב-הידרוג כלאיים, מחקרים הראו כי בזכות השימוש בשיטות ניקוי (וכו ') רקמת electrophoretic מפיקה את התוצאות משתנה מבחינת איכות לרקמות, לרבות, בראונינג, נזק epitope, ו איבוד חלבון5,6. כדי לטפל בבעיות אלה, ששונה פרוטוקולים כגון ברית (טכניקה פסיבי של בהירות), אשר מחליף את הטיפול וכד' עם טכניקה הפסיבי, חומרי יוניים delipidation מבוסס, כבר מפותחת7,8,9. למרות השגת עקביות יותר תוצאות, עם זאת, ההסכם דורש יותר זמן כדי לקבל אישור מקסימלי. יתר על כן, אף אחת משיטות אלה טרם הוחלו את כל הטופס CNS או לפי דגמים גדולים מכרסמים כגון עכברים, שרקנים.
המחקר הנוכחי מבקשת להתייחס הגבלות אלה על-ידי מציע מתודולוגיות הרומן, psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), להקלה על פינוי מהיר של כל מערכת העצבים המרכזית ואיברים פנימיים מודלים גם העכבר וגם עכברוש10. באופן ספציפי, psPACT מעבד רקמות אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג; mPACT בעיקרו של דבר כרוך אותם שלבים, אבל תוספי תזונה פתרון סליקה מבוססי מרחביות עם 0.5% α-thioglycerol כמו מפתח תגובה כימית. בשתי הטכניקות לרתום את אנדוגני מערכתית cerebrospinal הדם ומערכות תפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לייצר סיווג אופטי. מהווה הוכחה של עיקרון, נדגים את השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לנתח כלי דם דפוסים רקמות שנוקה10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר מתאים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. כל החיות ניסיוני מוקרבים בהתאם לקווים המנחים של הוועדה טיפול בבעלי חיים מעבדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei.
1. הכנת נוגדנים
התראה: Paraformaldehyde (PFA), אקרילאמיד ו נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; חלוק, כפפות, מגן eyewear).
- 4% אקרילאמיד (א. א) פתרון (A4P0): להוסיף 20 מ של 40% אקרילאמיד פתרון עד 180 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS).
- 0.25% VA-044 פתרון: להוסיף 0.5 גר' 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] אבקת dihydrochloride (VA-044) עד 200 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS). אמנם ניתן לאחסן את האבקה VA-044 בטמפרטורת החדר, זה להיות מאוחסן ב 4 ° C על solubilization ב- PBS. לקבלת תוצאות מיטביות, להכין רק את כמות פתרון לצורך הניסוי.
- פתרון קוקטייל ברית: להוסיף 10 גרם של אקרילאמיד 225 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון ולכוונן את העוצמה עד 200 מ"ל עם 4% מחברים. לפני השימוש, להוסיף 100 מ ג של אבקת VA-044 40 מ"ל של תערובת צינור חרוטי 50 מ.
- הסכם סליקה מאגר פתרון: להוסיף 40 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 350 מ של 0.1 M PBS ולכוונן את העוצמה עד 500 מ"ל עם PBS 0.1 M. עבור mPACT ניקוי פתרון, להוסיף 0.5% α-thioglycerol ההסכם ניקוי מאגר פתרון.
- העכברים השתמשו במחקר זה היו עכברים זכרים BALB בת שבוע-2; החולדות השתמשו במחקר זה היו עכברי-SD זכר 2 בן שבועיים.
2. הרדמה וניתוח זלוף
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
- עזים ומתנגד החיה בחדר נטול הפתוגן עם 30 מ"ג/ק"ג של zoletil באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. לפקח על החיה עבור 5-10 דקות.
- ברגע החיה הגיעה מטוס כירורגי של הרדמה, השתמש בשיטה הבוהן-קמצוץ תגובה כדי לקבוע את העומק של הרדמה. לאשר בעיית חוסר.
הערה: השלבים הבאים לערב עכבר ועכברוש, ניתוח בצע דומה פרוטוקול המשמש במחקר הקודם11. - עושים חתך 5-6 ס מ מתחת לצלעות, דרך דופן הבטן בעור.
- להשתמש במספריים מעוגלים, בוטה לבצע חתך הסרעפת, palpating את אזור בית החזה כדי לאתר את האתר של החתך מראש.
- להרחיב את החתך מעבר לכל אורכה של קשת הצלעות לחשוף את חלל הצדר.
- תחסיר בקפידה את הריאות. לעשות חתך דרך. קשת הצלעות עד לעצם הבריח. באמצעות מספריים איריס, לבצע חתך קטן בקצה האחורי של החדר השמאלי. הכנס של המחט אל תדאגי בלאנט או זית-שקצהו זלוף אבי העורקים, עובר דרך החדר חתוכה.
- לאבטח את המחט ולמנוע זליגת מאת מחבר חובק למעקה הלב עם עוצר דימום. לחלופין, השתמש עוצר דימום ששונה כדי לצבוט העורקים סביב קצה המחט.
- עושים חתך גדול באטריום ימין, מטפל על מנת להבטיח מינימום נזק העורקים. העכברוש מוכן כעת זלוף.
3. כל זלוף, דיסקציה של עכברוש
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
הערה: השלבים הבאים זלוף כל דומים פרוטוקול המשמש במחקר הקודם מאת Woo ואח. (2016) 10 , 11.
- לצרף את העלייה הימנית של הלב מחט בקוטר 18, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר.
- באמצעות מזרק 50 מ ל, במהירות ובצורה שווה לשאוב 50 מ של קר 0.1 M PBS לאודנום הפארין (היחידות 10/mL).
- לחבר את המחט אל תדאגי הצינור של המשאבה ממברנות.
- לשטוף עם 200 מ של 0.1 M קר PBS פתרון המכיל הפארין (היחידות 10/mL) במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה.
- לתקן עם 250 מ של 4% קר PFA פתרון במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה. העכברוש צריך להיות נוקשה בשלב זה.
- לאסוף ולאחסן את הפתרון PFA הנותרים עבור סילוק.
- עבור ברית, perfuse רקמות עם פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 אבקה עם מחט בקוטר 18 ולאחר מכן הסר את הראש ועמוד השדרה. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך קו האמצע של הצוואר האף. שלב נוסף זלוף זה מיותר עבור השיטות psPACT ו- mPACT; לאחר קיבוע, מיד לבודד את הראש ועמוד השדרה ולחשוף את הגולגולת.
- לחשוף את בסיס הגולגולת על-ידי הסרת כל שריר עמוד השדרה והצוואר שיורית.
- השתמש rongeurs ומספריים כדי לקלף את הגולגולת. הסר את המוח ואת חוט השדרה.
- לאחסן את הרקמה 4% מחברים ב 4 ° C; רקמות ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.
4. הידרוג מונומר אינפוזיה, פלמור של מערכת העצבים עכבר ועכבר
התראה: אקרילאמיד, למען חברה דמוקרטית, α-thioglycerol ו- PFA המגרים, וכך צריך להיות מטופל ברדס fume ועם שתן המתאים.
-
ברית (פסיב פינוי טכניקה)
- לבודד, תרבות של כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) מ קבוע עכברים וחולדות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4%, ו- 0.25% VA-044 אבקה, חנות ב 4 ° C עבור ה 24 ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין ה-s olution.
- להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל מערכת הכלאה מחובר למיכל חנקן: הגדר את המערכת 37 מעלות צלזיוס. להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) ברית פתרון קוקטייל, להתחבר עם הצינורית, לאחר מכן את הריב.
- כדי פולימריזציה של הידרוג, במקום הצינור המכיל את מדגם חממה חזק (150 סל ד, 37 ° C) במשך 3 שעות, או עד הפילמור הושלם.
- באמצעות נייר סופג (ראה טבלה של חומרים), הסר הידרוג polymerized הנותרים של הרקמות הסובבות.
- להעביר את רקמת צינור 50 מ ל המכיל פתרון סליקה (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).
- מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח בערך 20 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.
-
psPACT (תהליך נפרד טכניקת ניקוי פסיבי)
- לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.
- העברת רקמות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל 4% מחברים, וחנות ב 4 ° C עבור 24h. להבטיח כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין מקבע.
- לשטוף את הרקמה קבוע עבור 1 h ב- PBS 0.1 M, ולאחר מכן להעביר A4P0 פתרון (4% אקרילאמיד ב- PBS 0.1 M). חנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS 0.1 M.
- לטבול את הרקמה ב- 0.25% VA-044 ב- PBS 0.1 M. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-24 שעות, ולאחר מכן להעביר לפתרון VA-044/PBS טריים של 0.25%.
- להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל הכלאה המערכת (ראה טבלה של חומרים) מחובר למיכל חנקן: להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) פתרון VA-044/PBS 0.25%, ולהתחבר עם הצינורית. הפעל את שואב האבק.
- העבר את הרקמה ניקוי פתרון (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).
- דגירה על מדגם חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כ- 17 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.
-
mPACT (ששונה פסיבי פינוי טכניקה)
- לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.
- בצע את שלבים 4.2.2 - 4.2.8 של הפרוטוקול psPACT.
- העבר את הרקמה ניקוי פתרון. שים לב כי בניגוד הפרוטוקולים ברית ו- psPACT, mPACT מחייב פתרון סליקה בהיקף של 0.5% α-thioglycerol בנוסף מרחביות 8% ב- 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות רקמות יותר במהירות וביעילות. ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין הפתרון.
- מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כשבועיים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.
5. מקדם שבירה התאמה ו Immunostaining של CNS שנוקה
הערה: nחישוקים (מבוסס-Nycodenz השבירה התאמת פתרון) מורכב אבקת Nycodenz 0.8 g/mL מומס מאגר הבסיס 30 מ ל (אזיד הנתרן 0.01% ו- Tween-20 ב 0.1 M PBS, pH 8.0). מומלץ כי הפתרון נמצא במחלקה של 37 ° C רועד חממה כדי לאפשר יוצרות נאותה של האבקה.
- דגירה רקמות ב- 0.1% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS כבר שעתיים, ואז לחסום עם 2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS 0.1 M עבור 6-אייץ '.
- לשטוף את סעיפים 3 פעמים ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS 0.1 M) עבור ה 2 כתם מקטעים עם נוגדנים הראשי (במקרה זה, נוגדן אנטי-ארנב PECAM-CD31, אשר את כתמי הדם) במשך יומיים.
- כתם מקטעים עם נוגדנים משניים (בבמקרה זה, עז ארנב אנטי Cy3 אג פלורסנט המספר המשלים) ב- 2% BSA במשך יומיים.
- שטיפת בתווית רקמות שלוש פעמים ב- PBST עבור 2 h, חנות 15 מ"ל חישוקים n2-10 ימים.
- לפני הדמיה, להעביר רקמות שכותרתו כמות קטנה של nחישוקים על מנות תרביות רקמה 35 או 60-מ מ. לתקן עם סיליקון סביב הקצה התחתון של המנה.
- להוסיף 1.5-2 מ"ל של המכון טריים n.
6. עיבוד תמונה
- לרכוש תמונות של רקמות שנוקה עם אריח סריקה באמצעות של קונפוקלי סורק לייזר microscopewith 10 x הגדלה (ראה טבלה של חומרים). עבור התווית על-ידי Cy3 רקמות, השתמש אורכי הגל של 550-600 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדור של דגם שקוף של מערכת העצבים כל באמצעות טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי
סיווג אופטי של עכבר, חולדה רקמות CNS כל הושג במהירות תוך שימוש בטכניקות שונות סליקה פסיבי (איור 1). תיאור סכמטי של רקמות ניקוי במשך הזמן מוצג באיור 2A. שלא כמו שיטת ההסכם המקורי, psPACT (ברית נפרדת בתהליך) כרוך בטיפול דגימות עם 4% אקרילאמיד (A4P0) והפתרון יוזם VA-044 0.25% בשני שלבים נפרדים כדי ליצור את הידרוג היברידית. mPACT (ששונה הסכם) משפר עוד יותר על psPACT על-ידי שכשהם זמנים תוססים 8% ניקוי פתרון עם 0.5% α-thioglycerol. דוגמאות מעובד דרך ברית, psPACT, mPACT בגיל 14 יום בהשוואה, המוצגים באיור 2B.
במחקר הקודם, דיווחנו כי פרוטוקול ההסכם המקורי נקבע סיווג אופטי בימים 23, psPACT, mPACT פינה והעכבר כולו CNS רק 20 ו-14 ימים, בהתאמה10. במחקר הנוכחי, כאשר נתייחס בעכבר דגימות המוח באמצעות פרוטוקול mPACT, מצאנו כי השיגו שקיפות אופטית לאחר 14 ימים (איור 2B). דגימות CNS כל עכברוש מעובד באמצעות psPACT, mPACT גם הראה שאת mPACT מושגת סיווג מקסימלי עם היעילות ביותר, כמו רקמות נוקתה 30 ו- 20 ימים, בהתאמה (איור 3 א, ב'). עכברים בוגרים את המוח לבדו, לעומת מערכת העצבים כולה, נוקתה עם mPACT בימים 5 גרידא (איור 4A). דפוסי כלי דם של המוח עכברוש שנוקה נותחו באמצעות immunofluorescence לאחר psPACT ועיבוד mPACT כדי להדגים את התועלת של הליכים אלה סליקה עבור ניתוח אנטומי פונקציונלי של המוח (איור 4B, mPACT נתונים מוצג בוו ואח 2016)10.
באמצעות אלה ממוטב רקמות פסיביות ניקוי פרוטוקולים, היינו מסוגל לדמיין ללא פגע, שקוף מודלים של מערכת העצבים כל, למרות הזמנים סליקה שונה בין שלושת הפרוטוקולים. אופטימיזציה פסיבית ניקוי שיטות מושגת בהירות איבר באורך קצר יותר של זמן. יחדיו, תוצאות אלה מראים כי mPACT שיטת ניקוי יכול לייצר יותר stably, מאשר הקודם במהירות פסיבי ניקוי שיטות ברור CNS. לפיכך, mPACT בעל פוטנציאל גדול לשימוש ניתוח אנטומי מבניים עתידיים של איברים יונקים ומספק יתרון משמעותי על פני שיטות הקיימות מבחינת היעילות והבטיחות.
הדור של שטיחות שנוקה איברים פנימיים, העוברים באמצעות mPACT
בנוסף כל רקמות CNS, עכברים בוגרים טחול וכליות נוקתה עם mPACT בימים 19, 23, בהתאמה (איור 5 אב'). העכבר העוברים על E10.5 ועל E13.5 נוקתה גם אחרי 3 ימים של עיבוד באמצעות פרוטוקול mPACT. איור 5C -E מציג את הפריט החזותי של דפוסי כלי דם העובר כולו, כמו גם את microvasculature של האזור הזנב של העובר העכבר, העכברוש תסמונת הרכיבה, הטחול חולדה. תוצאות אלו מראים שאת mPACT הזה יכול לשמש כדי ליצור דגמים שקופים של מגוון רחב של רקמות ואיברים לצורך ניתוח אנטומי תלת-ממד.
איור 1: ייצוג סכמטי של טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי (ברית). חלוקה לרמות של מעורב כל אחד מהפרוטוקולים ברית שלושה צעדים בודדים מסופק לצד ריאגנטים הדרושים עבור כל שלב. פרוטוקול ההסכם המקורי הוא רקמה פלמור של הידרוג היווצרות בתערובת קר של 4% מחברים, פתרון אקרילאמיד (א. א) 4% ו- 0.25% VA-044 יוזם פתרון. לאחר רקמות היא polymerized באמצעות גז חנקן, שינוקה פסיבי עם 8% מרחביות ניקוי פתרון. PsPACT (ברית נפרדת תהליך) משתמשת תהליכי טיפול נפרד פתרון שושי מילר-אליוביץ 4% ו- 0.25% VA-044 יוזם פתרון להיווצרות הידרוג הרקמה; תנאים אלו שונים מאלו של פרוטוקול ההסכם המקורי. MPACT (ששונה הסכם) נוספים מוסיפה 0.5% α-thioglycerol 8% זמנים תוססים ניקוי פתרון של הפרוטוקול psPACT. עבור כל שלושת הפרוטוקולים, הרקמות שלמים מודגרת > = 37 מעלות צלזיוס חממה חזק עד iss סיווג מקסימלי הושג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שקיפות אופטית של העכבר כל מערכת העצבים המרכזית (CNS) על-ידי ניקוי רקמות פסיבי. (א) Schematization של כל רקמה CNS ניקוי באמצעות שיטות מבוססות-ברית לאורך זמן. השוואה (B) של שלושת הפרוטוקולים סליקה פסיבי (ההסכם המקורי, psPACT, mPACT) ב- CNS כל עכבר-14 ימים לאחר העיבוד. (ג) אישור אופטי של המוח העכבר לאמירה mPACT עיבוד במשך 14 ימים. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. האותיות ג' 2 הם 3 מ מ גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שקיפות אופטית של עכברוש שלם CNS רקמות פוסט-psPACT ו- mPACT. (א) רקמות CNS כל עכברוש למבוגרים השיגה אישור אופטי מקסימלי עם psPACT לאחר 30 ימים. (B) רקמות CNS כל עכברוש למבוגרים השיגו אישור אופטי מקסימלי עם mPACT אחרי 20 ימים. לפני ואחרי דיאגרמות לציין את הגודל של מערכת העצבים כל לפני ואחרי טיפול, כפי שנמדד לפי העין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ויזואליזציה עיבוד של microvasculature mPACT של מוח משרטוטי עכברוש למבוגרים. (א) השוואה של מוח עכברוש למבוגרים בעובי 4 מ מ. סעיפים לאחר mPACT עיבוד ב- 3 ו- 5 ימים. (B) הקרנה תלת-ממד של דפוסי כלי דם במוח עכברים בוגרים דמיינו נוגדן anti-CD31 לאחר העיבוד psPACT. גודל ברים, 1,500 מיקרומטר, 100 מיקרומטר. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: עיבוד mPACT של איברים מכרסמים, העכבר כל העוברים. mPACT להשיג שקיפות אופטית עכברים בוגרים (א) טחול וכליות (B) בימים 19, 23, בהתאמה. (ג) mPACT המיוצר עוברי העכבר שקוף של E10.5 ו- E13.5 אחרי 3 ימים. (ד) ויזואליזציה של microvasculature עם אנטי-CD31 באזור הזנב של העובר העכבר לאחר ניקוי עם mPACT. (ה) 3D השלכה של להערכת העכברוש תסמונת הרכיבה, הטחול עכברוש (נ) עם אנטי-CD31, לאחר עיבוד באמצעות mPACT. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד בשיטות חילוץ פאסיביים, שאינם electrophoretic המועסקים ברית לשפר באופן משמעותי את עקביות מושגת עם רקמת הקודם ניקוי שיטות כגון בהירות2,3,4,7 , 8, הטכניקה עדיין נושאת מספר חסרונות, הקשה ביותר של אשר הוא משך הזמן הדרוש להשגת בהירות רקמות מקסימלי12. במחקר הנוכחי, אנו מציגים ששונה פרוטוקולים ברית להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש בשביל לרקמות ניקוי תוך עדיין שמירה על רקמות תקינות ומבנה6,10. יתר על כן, בפעם הראשונה, נדגים את היישום של רקמות ניקוי פרוטוקולים ברקמות CNS שלם, במודל של מיומנויות מכרסמים, עכברים10.
באופן ספציפי, psPACT כרוך בעיבוד מדגם אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג, בעוד mPACT עוד יותר מתבססת על psPACT, תוספי תזונה זמנים תוססים 8% ניקוי פתרון עם 0.5% α-thioglycerol10. הפרדת את אקרילאמיד ואת העוקבות וירג'יניה-044 צעד מונע את הצורך הסרת שנותרו מונומרים הידרוג unpolymerized המקיפים את הרקמה, אשר יכולים להתפשר רקמת הסופי לאחר השגת שקיפות עם ההסכם; בנוסף, זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הדרוש להפקת אישור אופטי מקסימלי. התוספת של α-thioglycerol בשיטה mPACT נוספות מאיצה קרחת היער לעבד13, כמו α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות אזורים של הרקמה שהם פחות נגישים באמצעות רק את ריאגנטים בשיטה ההסכם המקורי 7 , 8 , 9.
השוואה של ברית, psPACT ו- mPACT על רקמת מכרסמים הדגימו כי בעוד psPACT משפר את שקיפות אופטית ביחס פרוטוקול ההסכם המקורי, mPACT באופן היעיל ביותר מאפשר עבור סליקה ודימות ברזולוציה עוקבות של שני שלם בתרבית של איברים, פרוסות המחולקת למקטעים, כפי שהוכח איור 2, איור 3, באיור 4. Α-thioglycerol מבוססי השומנים הכשלון של איברים מעובד המפתח השיטה הוכיחה mPACT ההבדלים יציבות שקיפות, יעילות, רקמות בהשוואה סליקה שתי השיטות האחרות. פעולה זו מותרת לניתוח 3D מהיר של איברים מעובד, ספציפית לגבי דם להערכת המורפולוגיה, דרך immunofluorescence ומיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 5DE).
בעוד התוספת של α-thioglycerol לפתרון סליקה מבוססי מרחביות הוא קריטי עבור האצת שקיפות אופטית, זה גם מעט מגבירה את השבריריות רקמות והופכת אותו יותר רגישים לנזק שלאחר עיבוד. עליונות ברורה mPACT לגבי היעילות שלה עולה מגבלה זו; עם זאת, כיום מבוצעת עבודה כדי להבטיח כי ניקוי מקסימלי תושג עם מינימלי כדי בהוצאות של רקמות תקינות.
לכן, התוצאות שלנו להקים mPACT כמו כלי חקירה רב עוצמה עבור מתן ניתוח תלת-ממד מתכונות אנטומי פונקציונלי או בתרבית של איברים, כולל אך לא מוגבל רשתות עצביים, דם להערכת ואדריכלות מטריקס רקמות. . להתקדם, אנו מאמינים mPACT יכול להיות שימושי במיוחד בחקירת מנגנונים ביולוגיים מיומנויות שתורמים הפתופיזיולוגיה של המחלה, כגון פגיעה ברקמות, מומים התפתחותיים, סרטן, ניווניות מחלת14,15,16,17. בשילוב עם מחקר של עדין המנגנונים הסלולר מעורב במחלה, mPACT יש פוטנציאל לספק מידה מרובה יותר מלאה, הבנה של מחלה שונים איך שונים מנגנוני אינטראקציה כדי להצמיח פנוטיפ שנצפו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המוח קוריאה 21 פלוס למדעי הרפואה, אוניברסיטת Yonsei. בנוסף, עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ה-NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
