Summary
Her presenterer vi to nye metoder, psPACT og mPACT, for å oppnå maksimal optisk åpenhet og påfølgende microscopic analyse av vev blodkar i intakt gnager hele CNS.
Abstract
Siden utviklingen av KLARHET, en bioelectrochemical fjerne teknikk som gir tredimensjonale fenotypen kartlegging i gjennomsiktig vev, en rekke romanen clearing metoder inkludert KUBIKKMETER (klar og uhindret hjernen imaging cocktailer og beregningsorientert analyse), SWITCH (systemomfattende kontroll samhandling tid) og kinetics av kjemikalier, kart (forstørret analyse av proteom) og PAKTEN (passiv klarhet teknikk), er etablert for å ytterligere utvide et eksisterende verktøysett for mikroskopisk analyse av biologisk vev. Dagens studie sikte på å forbedre og optimalisere opprinnelige PAKTEN prosedyren for en rekke intakt gnager vev, inkludert hele sentralnervesystemet (CNS), nyrer, milt og hele mouse embryoer. Kalles psPACT (prosess-atskilt PAKTEN) og mPACT (endret PAKTEN), gir disse nye teknikkene svært effektiv måte å kartlegging celle krets og visualisere subcellular strukturer intakt normal og patologisk vev. I den følgende protokollen gir vi en detaljert, trinnvis oversikt på hvordan å oppnå maksimal vev klarering med minimal invasjonen av deres konstruksjonssikkerhet via psPACT og mPACT.
Introduction
En grunnleggende målet med vitenskapelige og kliniske forespørsel innebærer å oppnå en fullstendig forståelse av orgel struktur og funksjon; imidlertid fungerer meget komplisert natur pattedyr organer ofte som en barriere å fullt oppnå denne mål1. KLARHET (klart Lipid-byttet akrylamid-hybridiserte stive Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, som involverer en akrylamid-baserte hydrogel hybrid fra intakt vev, oppnår optisk klarering av forskjellige organer, inkludert hjernen, leveren og milten, samtidig som deres konstruksjonssikkerhet5. KLARHET har dermed aktivert ikke bare visualisering, men også muligheten til å fint dissekere komplekse mobilnettverk og vev morphologies uten behov for snitting.
For å oppnå vev klaring, sysselsetter KLARHET electrophoretic metodene for å fjerne lipid innholdet i utvalget for hånden. Mens KLARHET har vært nevnt for å produsere fysisk stabil vev-hydrogel hybrider, studier har vist at bruken av electrophoretic vev clearing (ETC) metoder gir variable resultater i vevet kvalitet, inkludert browning, epitope skade, og protein tap5,6. For å løse disse problemene, har endret protokoller som PAKTEN (passiv klarhet teknikk), som erstatter ETC behandling med en passiv, jonisk-rengjøringsmiddel basert delipidation teknikk, vært utviklet7,8,9. Til tross for å oppnå en mer konsekvent resultater, men krever PAKTEN mer tid å få maksimal klaring. Videre er ingen av disse teknikkene enda brukt i hele CNS-skjemaet eller i større gnager modeller som rotter og marsvin.
Studien søker å håndtere disse begrensningene ved å foreslå nye metoder, psPACT (prosess-atskilt PAKTEN) og mPACT (endret PAKTEN), for å tilrettelegge rask rydding av hele CNS og indre organer i både mus og rotte modeller10. Spesielt psPACT behandler vev i 4% akrylamid og 0,25% VA-044 i to separate trinn under hydrogel formasjon; mPACT i hovedsak innebærer de samme trinnene, men kosttilskudd SDS-baserte clearing løsningen med 0,5% α-thioglycerol som en nøkkel reagens. Begge teknikkene utnytte de endogene systemisk og cerebrospinal sirkulasjons systemene for å redusere tiden det tar å produsere optisk klaring. Som et bevis på prinsippet viser vi bruk av AC confocal mikroskopi analysere blodkar mønstre i ryddet vev10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av den aktuelle forskning etiske komiteen ved Yonsei University College of Medicine. Alle forsøksdyr er ofret i henhold til veiledning av laboratoriet dyr omsorg ved Yonsei University College of Medicine.
1. forberedelse av reagenser
Advarsel: Paraformaldehyde (PFA), akrylamid og natrium dodecyl sulfate (SDS) er giftig irritanter og dermed skal håndteres i avtrekksvifte med riktig personlig verneutstyr (PVU, laboratoriefrakk, hansker, vernebriller).
- 4% akrylamid (AA) løsning (A4P0): legge til 20 mL av 40% akrylamid løsning til 180 mL 0.1 M fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- 0.25% VA-044 løsning: Legg til 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride (VA-044) pulver til 200 mL 0.1 M fosfat-bufret saltvann (PBS). Mens VA-044 pulver kan lagres ved romtemperatur, må den lagres på 4 ° C ved solubilization i PBS. For best resultat, forberede bare mengden av løsning nødvendig for eksperimentet.
- PAKTEN cocktail løsning: Legg til 10 g av akrylamid 225 mL 4% paraformaldehyde (PFA) løsning og juster volumet til 200 mL med 4% PFA. Før bruk må legge 100 mg av VA-044 pulver til 40 mL blandingen i en 50 mL konisk rør.
- PAKTEN fjerne løsningen buffer: legger 40 g natrium dodecyl sulfate (SDS) til 350 mL 0.1 M PBS og juster volumet til 500 mL med 0.1 M PBS. For mPACT fjerne løsning, Legg til 0,5% α-thioglycerol PAKTEN fjerne løsningen buffer.
- Musene som brukes i denne studien var 2-uke-gamle BALB mannlige mus; rotter brukt i denne studien var 2 uker gamle SD-hannrotter.
2. anestesi og perfusjon kirurgi
Forsiktig: PFA og akrylamid er giftig irritanter og dermed skal håndteres i avtrekksvifte med passende PPE.
- Bedøve dyret i patogen-gratis rom med 30 mg/kg av zoletil med 1 mL sprøyte med en 26-gauge nål. Overvåke dyret for 5-10 min.
- Når Dyret har nådd et kirurgisk fly av anestesi, kan du bruke metoden tå-klype svar for å bestemme dybden av anestesi. Bekreft fungere bedre.
Merk: Følgende med musen og rotten kirurgi følge en lignende protokoll som brukes i en tidligere studie11. - Gjør en 5-6 cm snitt under ribbe buret, gjennom integument og bukveggen.
- Bruke buet, sløv saks for å gjøre et snitt i mellomgulvet, palpating thorax området for å finne stedet for snitt på forhånd.
- Utvide i snitt over hele lengden av brystkasse å avsløre pleural hulrom.
- Nøye fortrenge lungene. Gjøre en klippe gjennom brystkasse opp på kragebeinet. Bruker iris saks, lag et lite innsnitt til bakre enden av venstre ventrikkel. Sett inn en 18-gauge Butt - eller oliven-tipped perfusjon nålen i stigende aorta, passerer gjennom kutt ventrikkel.
- Sikre nålen og forhindre lekkasje av clamping hjertet med en hemostat. Alternativt bruke en modifisert hemostat for å klemme aorta rundt pinne-spissen.
- Gjør en stor snitt i høyre atrium, ta vare for å sikre minimal skade synkende aorta. Rotta er nå klar for perfusjon.
3. hele perfusjon og Disseksjon av rotte
Forsiktig: PFA og akrylamid er giftig irritanter og dermed skal håndteres i avtrekksvifte med passende PPE.
Merk: Følgende hele perfusjon er en lik en protokoll som brukes i en tidligere studie ved Woo et al. (2016) 10 , 11.
- Koble høyre atrium hjerte til en 18-gauge nål, ta vare å ikke innføre noen luftbobler.
- Bruker en 50 mL sprøyte, raskt og jevnt pumpe 50 mL kaldt 0.1 M PBS løsning som inneholder heparin (10 enheter/mL).
- Koble 18-gauge nålen til tube peristaltiske pumpen.
- Vask med 200 mL kaldt 0.1 M PBS inneholder heparin (10 enheter/mL) på en sirkulasjon hastighet på 10 mL/min.
- Fikse med 250 mL kaldt 4% PFA på en sirkulasjon hastighet på 10 mL/min. Rotta bør være stiv på dette stadiet.
- Samle og lagre gjenværende PFA løsningen for avhending.
- Perfuse vev med en avkjølt PAKTEN cocktail løsning på 4% PFA, 4% akrylamid og 0,25% VA-044 pulver med en 18-gauge nål for PAKTEN, og fjern deretter hodet og ryggraden. Utsett skallen ved å gjøre en midtlinjen snitt fra nakken til nesen. Dette ekstra perfusjon er unødvendig for de psPACT og mPACT metodene; etter fiksering, umiddelbart isolere hodet og ryggraden og utsette skallen.
- Utsett bunnen av skallen ved å fjerne eventuelle gjenværende halsen og ryggen muskler.
- Bruk rongeurs og saks til å skrelle bort skallen. Fjern hjernen og ryggmargen.
- Lagre vevet i 4% PFA på 4 ° C; vev kan lagres i opptil 1 uke.
4. Hydrogel Monomer infusjonen og av rotte og mus CNS
Forsiktig: Akrylamid, SDS, α-thioglycerol og PFA er irriterende og dermed skal håndteres i avtrekksvifte og med riktig TISSE.
-
PAKTEN (passiv fjerne teknikk)
- Isolere og kultur hele CNS (hjernen og ryggmarg) fra fast mus og rotter til en 50 mL tube som inneholder en kjølt PAKTEN cocktail løsning 4% PFA, 4% akrylamid, og 0,25% VA-044 pulver og butikk på 4 ° C for 24 h. Kontroller at vevet er helt nedsenket i s lett løsning.
- Bygge inn prøven i nitrogen gass for 10 min bruker en vev gel hybridisering systemet koblet til en nitrogen tank: sette systemet å 37 ° C. Overføre vev til en 50 mL tube med frisk kaldt (4 ° C) PAKTEN cocktail løsning og koble med rør cap, så slå på vakuum.
- Du danner hydrogel, sett røret som inneholder utvalget i en risting inkubator (150 rpm, 37 ° C) 3 h eller til polymerisasjon er fullført.
- Bruke blotting papir (se Tabell for materiale), fjerne de gjenværende polymerized hydrogel omkringliggende vev.
- Overføre vev til en 50 mL tube som inneholder clearing løsning (8% SDS i 0.1 M PBS, pH 8.0).
- Plass prøven i en risting inkubator satt til 37 ° C og 150 rpm til vev er tømt. Det tar i gjennomsnitt ca 20 dager for musen CNS å oppnå full klarhet.
-
psPACT (prosessen separat Passive Clearing teknikk)
- Isolere hele CNS (hjernen og ryggmarg) med bein kutte og saks fra PFA-fast mus og rotter på en ren benk.
- Overføre vev til en 50 mL tube som inneholder 4% PFA, og butikken på 4 ° C for 24 h. sikre at vevet er helt oppslukt i bindemiddel.
- Vask fast vev 1t i 0.1 M PBS, og deretter overføre til A4P0 løsning (4% akrylamid i 0.1 M PBS). Butikken på 37 ° C i 24 timer.
- Vask vevet i 5 min i 0.1 M PBS.
- Fordype vevet i 0.25% VA-044 i 0.1 M PBS. Lagre ved 37 ° C i 6-24 h, og deretter overføre til frisk 0,25% VA-044/PBS løsning.
- Bygge inn prøven i nitrogen gass for 10 min bruker en vev gel hybridisering systemet (se Tabellen for materiale) koblet til en nitrogen tank: overføre vev til en 50 mL tube med frisk kaldt (4 ° C) 0,25% VA-044/PBS løsning, og koble med rør cap. Slå på vakuum.
- Overføre vevet til fjerne løsning (8% SDS i 0.1 M PBS, pH 8.0).
- Inkuber eksemplet i en risting inkubator satt til 37 ° C og 150 rpm til vev er tømt. Det tar i gjennomsnitt ca 17 dager for mus CNS å oppnå full klarhet.
-
mPACT (endret Passive Clearing Technique)
- Isolere hele CNS (hjernen og ryggmarg) med bein kutte og saks fra PFA-fast mus og rotter på en ren benk.
- Følg trinnene 4.2.2 - 4.2.8 av psPACT-protokollen.
- Overføre vevet til fjerne løsningen. Merk at i motsetning til PAKTEN og psPACT protokollene, mPACT krever en lysning løsning med 0,5% α-thioglycerol i tillegg til 8% SDS i 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol er en un browning agent som hjelper fjerne vev raskere og effektivt. Kontroller at vevet er helt oppslukt i løsningen.
- Plass prøven i en risting inkubator satt til 37 ° C og 150 rpm til vev er tømt. Det tar i gjennomsnitt ca 2 uker for musen CNS å oppnå full klarhet.
5. brytningsindeks matchende og immunostai-av ryddet CNS
Merk: nFELGER (Nycodenz-baserte brytningsindeks matchende løsning) består av 0,8 g/mL Nycodenz pulver oppløst i 30 mL base buffer (0,01% Natriumazid og Tween-20 i 0.1 M PBS, pH 8.0). Det anbefales at løsningen er plassert i en 37 ° C risting inkubator for å gi riktig solvation av pulver.
- Inkuber vev i 0,1% Triton X-100 i 0.1 M PBS 2 h, da blokkere med 2% bovin serum albumin (BSA) i 0.1 M PBS 6 h.
- Vask deler tre ganger i PBST (0,1% Tween-20 i 0.1 M PBS) for 2 h. flekken seksjoner med primære antistoffer (i dette tilfellet et anti-kanin PECAM-CD31 antistoff, som flekker blodkar) for 2 dager.
- Stain seksjoner med sekundær antistoffer (i dette tilfellet en geit anti-kanin IgG Cy3 fluorescerende konjugert) i 2% BSA for 2 dager.
- Vask merket vev tre ganger på PBST for 2t og butikken i 15 mL nFELGER for 2-10 dager.
- Før bildebehandling, flytte merket vev til en liten mengde nFELGER på 35 eller 60 mm vev kultur retter. Fikse med silikon rundt kanten av parabolen.
- Legge til 1,5-2 mL frisk nFELGER.
6. bildebehandling
- Hente bilder av ryddet vev med flis skanning ved hjelp av en AC confocal laser-skanning microscopewith 10 x forstørrelse (se Tabell for materiale). Av Cy3-merket vev, bruke bølgelengder av 550-600 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av en gjennomsiktig modell av hele CNS bruker optimalisert passiv clearing teknikker
Optisk klarering av mus og rotten hele CNS vev ble raskt oppnådd ved hjelp av ulike passiv clearing teknikker (figur 1). En skjematisk av vev fjerne over tid vises i figur 2A. I motsetning til den opprinnelige pakt metoden innebærer psPACT (prosess-atskilt PAKTEN) behandling av prøver med 4% akrylamid (A4P0) og 0,25% VA-044 initiatoren løsning i to separate trinn for å danne hydrogel hybrid. mPACT (endret PAKTEN) ytterligere forbedrer på psPACT ved supplere 8% SDS fjerne løsning med 0,5% α-thioglycerol. Prøver behandles via PAKTEN, psPACT og mPACT på dag 14 er forhold og presentert i figur 2B.
I en tidligere studie rapporterte vi at mens den opprinnelige pakt protokollen oppnådd optisk klarering i 23 dager, psPACT og mPACT fjernet hele musen CNS i bare 20 og 14 dager, henholdsvis10. I studien, når vi behandlet musen hjernen prøver via mPACT-protokollen, fant vi at de oppnådd optisk åpenhet etter 14 dager (figur 2B). Rotte hele CNS prøver behandles via psPACT og mPACT viste også at mPACT oppnådde maksimal klarering med størst effektivitet, vev ble fjernet i 30 og 20 dager, henholdsvis (figur 3A, B). Voksen rotte hjerner alene, i motsetning til hele CNS ble tømt med mPACT i bare 5 dager (figur 4A). Blod fartøy mønstre ryddet rotte hjerner ble analysert via immunofluorescence etter psPACT og mPACT behandling å demonstrere nytten av disse clearing prosedyrer for anatomiske og funksjonell analyse av hjernen (figur 4B, mPACT data vist i Woo et al. 2016)10.
Bruke disse optimalisert passiv vev fjerne protokoller, vi klarte å visualisere intakt, gjennomsiktig modeller av hele CNS selv om clearing ganger forskjellig blant de tre protokollene. Optimalisert passiv fjerne metoder oppnådd orgel klarhet i et kortere tidsrom. Sammen tyder disse resultatene på at mPACT fjerne metoden kan generere klare CNS mer stabilt og enn forrige passiv fjerne metoder. Dermed mPACT har stort potensial for bruk i fremtidige strukturelle og anatomisk analyser av pattedyr organer og gir en betydelig fordel over eksisterende metoder både effekt og sikkerhet.
Generasjon av optisk ryddet indre organer og embryo bruker mPACT
I tillegg til hele CNS vev, voksen rotte milten og nyre ble tømt med mPACT i 19 og 23 dager, henholdsvis (figur 5AB). Mouse embryoer på E10.5 og E13.5 ble også tømt etter 3 dager for behandling via mPACT-protokollen. Figur 5C -E viser effekten av blod fartøy mønstre i hele fosteret, i tillegg til microvasculature av hale regionen musen fosteret, rotte cauda jevndøgn og rotten milten. Disse resultatene tyder på at mPACT kan brukes til å generere gjennomsiktig modeller av en rekke vev og organer for 3D anatomiske analyse.
Figur 1: skjematisk fremstilling av optimalisert passiv clearing teknikker (pakt). En oversikt over de individuelle trinnene involvert i hver av de tre pakt protokollene gis sammen med reagensene kreves for hvert trinn. Opprinnelige PAKTEN protokollen er vev polymerisasjon fra hydrogel formasjon med en kald blanding av 4% PFA, 4% akrylamid (AA) løsning og 0,25% VA-044 initiatoren løsning. Når vev er polymerized bruk av nitrogen gass, fjernes den passivt med 8% SDS fjerne løsningen. PsPACT (prosess-atskilt PAKTEN) bruker separate prosesser på 4% AA løsning og 0,25% VA-044 initiatoren løsning for hydrogel dannelsen av vev; disse forholdene er forskjellige fra de opprinnelige PAKTEN protokollen. MPACT (endret PAKTEN) ekstra legger til 0,5% α-thioglycerol 8% SDS fjerne løsningen av psPACT-protokollen. For alle tre protokoller, intakt vev er ruges på > = 37 ° C i en risting inkubator til maksimal klaring iss oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: optisk gjennomsiktigheten til musen hele sentralnervesystemet (CNS) av passiv vev clearing. (A) Schematization av hele CNS vev fjerne via pakt-baserte metoder over tid. (B) sammenligning av tre passiv clearing protokoller (opprinnelige PAKTEN, psPACT, mPACT) i musen hele CNS på 14 dager etter behandling. (C) optisk klarering av musen hjernen utsatt for mPACT behandling over 14 dager. Dette tallet er endret fra Woo et al. 201610. Bokstavene i 2C er 3 mm høy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: optisk åpenhet av rotte hele CNS vev innlegg-psPACT og mPACT. (A) voksen rotte hele CNS vev oppnådde maksimal optisk klarering med psPACT etter 30 dager. (B) voksen rotte hele CNS vev oppnådde maksimal optisk klarering med mPACT 20 dager. Den før og etter diagrammer angi størrelsen på hele CNS før og etter behandling, målt av øyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mPACT behandling og microvasculature visualisering av appa voksen rotte hjernen. (A) sammenligning av 4 mm tykt voksen rotte hjernen seksjoner etter mPACT behandling på 3 og 5 dager. (B) 3D projeksjon av blod fartøy mønstre i voksen rotte hjernen visualisert med anti-CD31 antistoff etter psPACT behandling. Skalere barer, 1500 µm og 100 µm. Dette tallet er endret fra Woo et al. 201610. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: mPACT behandling av gnager organer og hele mouse embryoer. mPACT oppnådd optisk åpenhet i voksen rotten (A) milten og (B) nyre i 19 og 23 dager, henholdsvis. (C) mPACT produsert gjennomsiktig E10.5 og E13.5 mouse embryoer etter 3 dager. (D) visualisering av microvasculature med anti-CD31 i regionen halen av musen embryoet etter avregning med mPACT. (E) 3D projeksjon av blodkar i rotte cauda jevndøgn og (F) rotte milt med anti-CD31, etter behandling via mPACT. Dette tallet er endret fra Woo et al. 201610. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens metodene passive, ikke-electrophoretic utvinning ansatt i forbedret PAKTEN konsistens med tidligere vev fjerne metoder som KLARHET2,3,4,7 , 8, teknikken fortsatt bærer flere svakheter, de mest presserende som er tiden som kreves for å oppnå maksimal vev klarhet12. I denne studien presenterer vi endret PAKTEN protokoller som reduserer tiden som kreves for vev fjerne samtidig bevare vev integritet og struktur6,10. Videre, for første gang viser vi anvendelsen av vev fjerne protokoller i hele CNS vev og en høyere orden gnager modell, rat10.
Spesielt psPACT omfatter prøve behandling i 4% akrylamid og 0,25% VA-044 i to separate trinn under hydrogel formasjon, mens mPACT ytterligere bygger på psPACT og kosttilskudd 8% SDS fjerne løsning med 0,5% α-thioglycerol10. Utskilling av akrylamid og påfølgende VA-044 trinnet unngår behovet for å fjerne gjenværende unpolymerized hydrogel monomerer som omgir vev, som kan kompromittere siste vev integritet etter å oppnå åpenhet med PAKTEN. i tillegg reduserer dette tiden det tar å produsere maksimal optisk klaring. Tillegg av α-thioglycerol i mPACT-metoden ytterligere akselererer clearing behandle13, som α-thioglycerol er en un browning agent som hjelper fjerne områder av vev som er mindre tilgjengelig ved hjelp av bare reagenser i den opprinnelige pakt metoden 7 , 8 , 9.
En sammenligning av PAKTEN, psPACT og mPACT på gnager vev viste at mens psPACT forbedrer optisk åpenhet i forhold til den opprinnelige pakt protokollen, mPACT mest effektivt tillater for clearing og påfølgende oppløsning bildebehandling av både hele pattedyr organer og inndelte skiver, som vist i figur 2, Figur 3, Figur 4. Α-thioglycerol-baserte lipid bleke behandlet organer i nøkkelen mPACT metoden viste seg forskjellig åpenhet, effektivitet og vev stabilitet i forhold til de andre to clearing metodene. Dette tillot for rask 3D analyse av behandlet organer, spesielt når det gjelder blod blodkar morfologi, via immunofluorescence og AC confocal mikroskopi (figur 5 dE).
Mens tillegg av α-thioglycerol SDS-baserte clearing løsningen er avgjørende for akselererende optisk åpenhet, det også litt øker vev skjørhet og gjør det mer utsatt for skade etterbehandling. Klar overlegenhet mPACT med hensyn til effektiviteten enn denne begrensningen, Likevel, arbeidet nå blir gjort for å sikre at maksimal clearing kan oppnås med minimal å ingen regning vev integritet.
Dermed etablere resultatene mPACT som et kraftig undersøkende verktøy for å gi en 3D analyse av funksjonene funksjonelle og anatomisk pattedyr organer, inkludert men ikke begrenset til nevrale nettverk, blod blodkar og vev matrix arkitektur. Fremover, tror vi mPACT kan være spesielt nyttig i etterforskningen av høyere orden biologiske mekanismer som bidrar i Patofysiologien ved sykdom, som vev skade, utviklingsmessige misdannelser, kreft og nevrodegenerative sykdom14,15,16,17. Kombinert med en studie av de finere cellulære mekanismene involvert i sykdom, har mPACT potensial til å gi en mer komplett, multi-skala forståelse av hvordan ulike ulike sykdom mekanismer samhandle for å gi opphav til observert fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av hjernen Korea 21 pluss prosjektet for medisinsk vitenskap, Yonsei universitet. I tillegg ble dette arbeidet støttet av et stipend fra det nasjonale Research Foundation av Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
