Summary
MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。
Abstract
明快さの開発以来らせんの技術をクリアできる透明な組織内三次元表現型写像立方 (明確な遮るもののない脳イメージングを含む新規クリア方法論の多数カクテルと解析) スイッチ (対話時間のシステム全体にわたるコントロール) および化学物質の体内動態、マップ (拡大、プロテオーム解析)、および協定 (受動的な明快さテクニック)、更なる拡大のため既存のツールキットに確立されています。生体組織の顕微解析。本研究の目的を改善し、全体の中枢神経系 (CNS)、腎臓、脾臓、および全体のマウス胚を含む無傷の齧歯動物組織の配列の元の協定の手順を最適化します。PsPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定) と呼ばれる、これらの手法は、細胞回路をマッピングとそのまま正常および病的組織における細胞内の構造を視覚化する非常に有効な手段を提供します。次のプロトコルの psPACT と mPACT を介して構造完全性の最小の侵入と最大組織クリアランスを実現する方法について詳細なステップバイ ステップの概要を提供します。
Introduction
科学的・臨床的調査の基本的な目的を含む器官の構造と機能の完全な理解を達成します。ただし、哺乳類の器官の非常に複雑な性質はしばしば完全に1この目的を達成するために障壁として機能します。透明度 (明確な脂質交換アクリルアミド ハイブリダイズ剛体イメージング互換かみしめハイドロゲル)2,3,4、そのまま組織からアクリルアミド ベース ハイドロゲル ハイブリッドを構築する関係を実現します。その構造的な整合性の5を維持しながら脳、肝臓、および脾臓を含む臓器の様々 な光のクリアランス。明快さは可視化だけでなく、複雑な携帯電話ネットワークとを区分することがなく組織形態を細かく分析する機会に従ってきました。
組織クリアランスを達成するために明快さは、手でサンプルの脂質含量を削除する電気泳動法を採用しています。電気泳動の組織の清算 (など) の方法を使用が褐変、エピトープ損傷を含む組織品質の面で様々 な結果を生成することを研究で示されている明快さは物理的に安定した組織ハイドロゲルのハイブリッド車を生産するために注目されている中、蛋白質の損失の5,6。これらの問題に対処するため、パッシブ、イオン洗剤ベース脱脂法など治療に置き換えます、協定 (受動的な明快さ技術) などのプロトコルの修正は先進7,8,9をされています。にもかかわらず、結果の一貫性を達成するため、ただし、協定は最大の認可を得るためのより多くの時間を必要です。さらに、これらの技術のどれもが、CNS フォーム全体またはラット、モルモットなど大きい齧歯動物モデルで適用まだされています。
本研究は、psPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定)、全体の中枢神経系と内臓マウスとラットの両方のモデルのための10の高速のクリアランスを促進するための新規方法論を提案し、これらの制限に対処しようとします。具体的には、psPACT プロセス 0.25% と 4% アクリルアミド組織ハイドロゲル形成; 中に 2 つの別々 の手順で VA-044mPACT は基本的に同じ手順が含まれますが、0.5% α-チオグリセ キー試薬として、SDS 決済ソリューションのサプリメントします。両方の技術は、光クリアランスを生成するために必要な時間を大幅に削減する内因性の全身と脳脊髄液循環システムを活用します。原理の証拠として我々 はクリア組織10血管パターンを分析する共焦点顕微鏡の使用を示します。
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Protocol
すべてのプロシージャは、延世大学医科大学研究倫理委員会によって承認されています。延世大学医科大学実験動物の世話委員会のガイドラインに従ってすべての実験動物が犠牲に。
1. 試薬の調製
注意: パラホルムアルデヒド (PFA) アクリルアミドおよびナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 有害刺激を適切な個人用保護具 (PPE; 白衣、手袋、保護メガネ) と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
- 4% アクリルアミド (AA の) 溶液 (A4P0): 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 180 mL 40% アクリルアミド溶液 20 mL を加えます。
- 0.25% VA 044 ソリューション: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g を追加] 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 mL に塩酸 (VA-044) 粉末。VA 044 粉末は、常温で保存できますが、一方、PBS で可溶化時に 4 ° C で保存されなければなりません。最高の結果を得るには、実験に必要なソリューションの量だけを準備します。
- 協定カクテル ソリューション: 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューションの 225 mL にアクリルアミドの 10 g を追加し、4% と 200 mL にボリュームを調整する PFA。使用前に VA 044 粉末 100 mg を 50 mL の円錐管に混合物の 40 mL に追加します。
- 協定ソリューション バッファーをクリア: ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 40 g を 350 mL の 0.1 M PBS に追加し、0.1 M PBS と 500 mL にボリュームを調整します。MPACT クリア ソリューション、ソリューション バッファーをクリア協定に 0.5% α-チオグリセを追加します。
- マウスをこの研究で使用された 2 週齢 BALB オスのマウス本研究で使用されるラットは 2 週齢雄 SD ラット.
2. 麻酔および灌流外科
注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
- 26 g 針、1 mL の注射器を使用して zoletil の 30 mg/kg の病原体フリー部屋に動物を麻酔します。5 のための動物を監視-10 分。
- 動物の麻酔外科平面に達している、つま先ピンチ応答メソッドを使用して麻酔の深さを確認します。応答がないを確認します。
注: マウスおよびラットの手術を伴う次の手順前研究11で使用される同様のプロトコルに従います。 - 外皮と腹部の壁を通して、胸郭の下に 5-6 cm の切開を行います。
- あらかじめ切開のサイトを検索するのに胸部領域を触診、横隔膜の切開をするのに鈍い曲線ハサミを使用します。
- 切開を胸腔内に公開する胸部の全体の長さにわたって。
- 慎重に肺を置き換えません。鎖骨まで胸部のカットを作る。アイリスのはさみを使用して、左心室の後部の端に小さな切開を作る。カットの心室を通過、上行大動脈に 18 ゲージ鈍やオリーブをひっくり返した灌流針を挿入します。
- 針を固定し、止血の中心をクランプして漏れを防ぐ。また、針の先端を大動脈のクランプに変更された止血を使用します。
- 右心房、大動脈に与えるダメージを最小限を確保するよう配慮で大きな切開を行います。ラットは、灌流の準備が整いました。
3. 全体の血流とラットの解剖
注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。
注: 手順全体の灌流はウーらによる以前の研究で使用されるプロトコルに似ています。(2016)10,11。
- 18 ゲージ針、空気の泡を導入しないように注意しながら心臓の右心房に接続します。
- 50 mL の注射器を使用すると、迅速かつ均一にヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液 50 mL をポンプします。
- 蠕動ポンプのチューブに 18 g 針を接続します。
- 10 mL/min の循環速度で 200 mL のヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液で洗ってください。
- 250 mL の循環速度を 10 mL/min で冷 4 %pfa 溶液で固定します。ラットは、この段階では硬いはずです。
- 収集し、処分のため残りの PFA ソリューションを格納します。
- 協定、18 ゲージ針、チルド協定 4 %pfa があり、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー カクテル溶液で組織を灌流、頭と背骨を取り外します。首から鼻の正中切開することによって頭蓋骨を公開します。この追加灌流ステップは、psPACT と mPACT メソッドに必要です固定後すぐに頭と背骨を分離し、頭蓋骨を公開します。
- 任意の残留首と背骨の筋を除去することによって、頭蓋底を公開します。
- Rongeurs とはさみを使って頭蓋骨をはがします。脳と脊髄を削除します。
- 4% で組織を保存 4 ° c; PFA組織は、1 週間まで保存できます。
4. ハイドロゲル モノマー注入およびラットおよびマウスの中枢神経系の重合
注意: アクリルアミド、SDS、α-チオグリセ、PFA の刺激は、こうしてヒューム フードと適切なおしっこを処理する必要があります。
-
協定 (パッシブ手法をクリア)
- 分離し、文化の全体中枢神経系 (脳と脊髄) 固定マウスおよびラットから 4 %pfa、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー、24 h. 組織が s に完全に没頭していることを確認のための 4 ° C でストアのチルド協定カクテル溶液 50 mL のチューブにソリューション。
- 10 分のティッシュを使用してゲルの交配システム窒素タンクに接続されているために、窒素ガスのサンプルを埋め込む: システムを 37 ° C に設定新鮮な寒さ (4 ° C) 協定を含む 50 mL のチューブに組織を転送カクテル ソリューション チューブ キャップと接続し、真空をオンにします。
- ヒドロゲルを重合、3 h、または重合が完了するまで (150 rpm、37 ° C) 振動のインキュベーターでサンプルを格納筒を配置します。
- あぶらとり紙を使用して (材料の表を参照)、削除残りの重合ハイドロゲル周囲の組織。
- 組織を含むクリア液 (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) 50 mL チューブに転送します。
- 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均して、完全明快さを達成するためにマウスの中枢神経系の約 20 日かかります。
-
psPACT (プロセス別のパッシブ クリア技術)
- ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。
- 組織の転送 4% を含む 50 mL のチューブ PFA、および 24 時間のための 4 ° C でストアするには組織は固定液に完全に浸漬。
- 0.1 M PBS で 1 時間固定ティッシュを洗うが、A4P0 溶液 (0.1 M PBS で 4% アクリルアミド) に譲渡。24 h の 37 ° C でストア。
- 0.1 M PBS で 5 分のための組織を洗浄します。
- 0.25% の組織を浸す 0.1 M PBS で VA 044。6-24 h、37 ° C で保存し、新鮮な 0.25 %va-044/PBS 溶液に転送します。
- 10 分のティッシュを使用してゲルの交配のために窒素ガスのサンプルを埋め込む窒素タンクに接続されたシステム (材料の表を参照してください): 新鮮な寒さ (4 ° C) を含む 50 mL のチューブに組織を転送 0.25 %va-044/PBS 溶液、チューブ キャップと接続。真空をオンにします。
- 組織に転送ソリューション (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) をクリアします。
- 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動のインキュベーターでサンプルをインキュベートします。平均して、マウス中枢神経系における透明度を達成するため約 17 日かかります。
-
mPACT (変更された受動的なクリア法)
- ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。
- 4.2.2 - psPACT プロトコルの 4.2.8 の手順に従います。
- 組織に転送ソリューションを消去します。条約と psPACT のプロトコルとは異なり mPACT は 0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds に加えて 0.5% α-チオグリセから成るクリア ソリューション必要がありますに注意してください。Α-チオグリセより迅速かつ効果的に組織を明確に役立ちます非褐変のエージェントです。組織はソリューションに完全に没頭することを確認します。
- 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均では、マウスの中枢神経系における明快さを達成するために約 2 週間かかります。
5 屈折率整合とクリアされた中枢神経系の免疫染色
注: nリム (Nycodenz ベース屈折率マッチング ソリューション) は、0.8 グラム/mL の Nycodenz パウダー 30 mL 基本バッファー (0.01% アジ化ナトリウムと pH 8.0 0.1 M PBS でトゥイーン 20) に溶解で構成されています。ソリューションが粉体の適切な溶媒ようにインキュベーターの振動、37 ° C で置かれることをお勧めします。
- 0.1% の組織を孵化させなさい 2 時間 0.1 M PBS でトリトン X-100 を 0.1 M PBS 6 時間で 2% ウシ血清アルブミン (BSA) をブロックします。
- 3 回の pbst; セクションを洗う (0.1 %0.1 M PBS でトゥイーン 20) 2 のための 2 日間 (この場合は血管の汚れは、抗家兎の PECAM CD31 抗体) の一次抗体を持つセクションを染色します。
- 2 日間の 2 %bsa で (この場合、ヤギ抗うさぎ IgG Cy3 蛍光共役) の二次抗体を使用してセクションを染色します。
- 洗浄は 2-10 日間 pbst; 2 時間で 3 回組織と 15 mL のストアnリムをラベル付け。
- イメージング、前に 35 〜 60 ミリメートル ティッシュの培養皿上nリムの少量にラベル付けされた組織を移動します。お皿の下の縁のまわりでシリコーンで固定します。
- 1.5-2 mL の新鮮なnリムを追加します。
6. 画像処理
- タイル走査共焦点レーザー スキャン microscopewith 10 倍の倍率を使用してクリアされた組織の画像を取得 (材料の表を参照してください)。Cy3 標識組織の 550-600 nm の波長を使用します。
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Representative Results
最適化された受動的なクリアリングの技術を使用して全体の中枢神経系の透明なモデルの生成
マウスおよびラットの全中枢神経組織の光のクリアランスは、様々 な受動的なクリアリング テクニック (図 1) を使用して急速に達成されました。時間をかけてクリア組織の模式図を図 2 aに示します。元協定メソッドとは異なり psPACT (別のプロセス協定) ハイドロゲル ハイブリッドを形成するために 2 つの別々 の手順で 4% アクリルアミド (A4P0) と 0.25% VA 044 イニシエーター溶液サンプルを扱うことを含みます。mPACT (変更された協定) 0.5% α-チオグリセとソリューションをクリア 8 %sds を補うことで psPACT に更に改良します。協定、psPACT、14 日に mPACT を介して処理のサンプルを比較し、図 2 bに提示します。
我々 は以前の研究元協定議定書達成で 23 日、psPACT 光クリアランス mPACT がちょうど 20 と 14 日、それぞれ10で全体のマウス中枢神経系をクリアし、ことを報告しました。本研究では mPACT プロトコル経由でマウス脳サンプルを扱う私たちが判明しました (図 2 b) 14 日後の光透過性こと彼ら。PsPACT を介して処理ラット全体中枢神経系サンプル、また示したその mPACT が最大の効率で最大クリアランスを実現組織をそれぞれ 30 と 20 日のクリアと mPACT (図 3 a, B)。(図 4 a) 単なる 5 日で成体ラット脳全体の中枢神経系ではなく、単独で mPACT とクリア。PsPACT と mPACT データ (図 4 b脳の解剖学的および機能分析のためのクリア手順の有用性を実証する mPACT 処理後蛍光を介してオフにしたラットの脳の血管パターンを行った2016 のウーらによって示されている)10。
清算プロトコル受動的な組織を最適化するこれらを使用して、3 つのプロトコル異なっていたクリア時間が全体の中枢神経系のままに、透明なモデルを視覚化することができました。最適化されたパッシブ メソッドをオフ時間の短い長さでオルガンの明快さを達成しました。一緒に取られて、これらの結果は、メソッドをクリア mPACT が明確な中枢神経系より安定的かつ迅速に以前よりも受動的なクリア方法を生成できることをお勧めします。したがって、mPACT 哺乳類の器官の将来の構造と解剖学的解析の使用のための大きな可能性を保持している、効果と安全性の両方の面で既存のメソッド上の重要な利点を提供します。
光クリア内臓と mPACT を用いた胚の生成
全体の中枢神経組織だけでなく成体ラット脾臓と腎臓をクリア mPACT と 19 と 23 日それぞれ (図 5 a, B)。E10.5 と E13.5 マウス胚 mPACT プロトコル経由で処理の 3 日後もクリア。図 5-Eは、マウス胚、ラット馬尾馬およびラット脾臓の尾部領域の血管と同様に、全胚の血管パターンの可視化を示しています。これらの結果は、その mPACT はさまざまな組織や臓器の 3 D 解剖学的分析のための透過的なモデルを生成する使用ことができますをお勧めします。
図 1: 最適化された受動的なクリアリング テクニック (協定) の概略図。それぞれ 3 つの協定プロトコルの個々 の手順の概要は、各ステップに必要な試薬と一緒に提供しています。元協定プロトコルは 4 %pfa、4% (AA) のアクリルアミド溶液 0.25% VA 044 イニシエーター溶液の冷たい混合物とハイドロゲル形成組織重合。窒素ガスを使用して組織を重合すると後は、受動的 8 %sds ソリューションをオフにクリアされます。PsPACT (別のプロセス協定); 組織のハイドロゲル形成の 4% だソリューションと 0.25% VA 044 イニシエーター ソリューションの独立した処理を使用します。これらの条件は元の条約議定書の内容と異なります。追加 mPACT (変更された協定) は、psPACT プロトコルのソリューションをクリア 8 %sds に 0.5% α-チオグリセを追加します。そのまま組織に孵化するすべての 3 つのプロトコル > 最大クリアランス iss 達成まで揺れのインキュベーターで 37 ° C を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウス全中枢神経系 (CNS) 受動的な組織にクリアしての光透過性。(A)協定に基づくメソッドを介して時間をかけてクリア全体の中枢神経系組織の図式。14 日処理後にマウス全体の中枢に 3 つのパッシブ クリア プロトコル (元協定、psPACT、mPACT) の(B)を比較します。(C)光クリアランス mPACT 処理 14 日間を受けるマウス脳の。この図は、ウーら201610から変更されています。2 C の文字はある 3 mm 背が高いです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ラット全中枢神経系組織のポスト psPACT と mPACT の光透過性。(A)ラット全体の中枢神経系組織達成 30 日後 psPACT で最大の光のクリアランス。(B)成体ラット全体の中枢神経系組織は 20 日後 mPACT で最大光クリアランスを達成しました。前に、と後、図のサイズを示す全体の中枢神経系治療、前後の目によって測定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 断面成体ラット脳の mPACT 処理と微小血管の可視化。(A) 4 mm 太い成体ラット脳の比較セクション mPACT 3 〜 5 日で処理後。(B) psPACT 処理後の反 CD31 抗体を用いた可視化ラット脳における血管パターンの 3 D 投影。スケール バー、1,500 μ m、100 μ m。この図は、ウーら201610から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 齧歯動物臓器および全体のマウス胎仔の mPACT 処理します。mPACT は、それぞれ 19、23 日のラット(A)脾臓と腎臓(B)の光透過性を実現しました。(C) mPACT 3 日後透明 E10.5 E13.5 マウス胚を生産しました。マウス胚の尾地域で反 CD31 と血管の可視化を mPACT とクリア後(D) 。(E) mPACT による処理後ラット馬尾馬と反-CD31 を(F)ラット脾臓の血管の 3 D 投影。この図は、ウーら201610から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
大幅改善の前の組織をわかりやすく2,3,4、7等をクリアで達成一貫性協定受動的、非電気泳動抽出方法に勤めている間,8テクニックが最も急を要するが最大組織明確12を達成するために必要な時間の長さ、いくつかの欠点はいまだに。現在の研究では、組織の組織構造と整合性6,10を維持したままクリアに必要な時間を大幅に削減協定プロトコルの修正を提案します。さらに、最初の時間のため、清算プロトコル全体の中枢神経系組織と高次齧歯動物モデル、ラット10組織のアプリケーションを示します。
具体的には、psPACT を含むサンプル 0.25% と 4% アクリルアミド処理 mPACT がさらに psPACT 上に構築し、0.5% α-チオグリセ10ソリューションをクリア 8 %sds のサプリメント、ハイドロゲル形成中に 2 つの別々 の手順で VA 044。協定; と透明度を達成した後最終的な組織の整合性を妥協することができます組織を囲むハイドロゲル未重合モノマーの残りを削除する必要があるアクリルアミドと VA 044 段階分離さらに、これは最大光クリアランスを生成する必要がある時間を著しく短縮します。Α-チオグリセ mPACT メソッドをさらに添加加速クリア α チオグリセは元の条約法の試薬のみを使用して以下のアクセスが組織の領域を明確に役立ちます非褐変のエージェントとして13日の処理7,8,9。
条約、psPACT と mPACT 齧歯動物組織の比較実証こと psPACT 元協定プロトコルに対する光透過性が向上しますが、mPACT 最も効率的には、クリアして両方の全体の後続の高分解能イメージング哺乳類の器官と図 2, 図 3, 図 4に示すよう、断面のスライス。他の 2 つの清算方法と比較して透明性、効率性、組織の安定性の違いに mPACT メソッド証明キーの処理器官の α ベース チオグリセ脂質ウォッシュ。これは処理器官の血液の血管形態、蛍光抗体法と共焦点顕微鏡 (図 5、E) に関して特に急速な 3 D 解析できました。
Α-チオグリセ SDS 決済ソリューションに添加、光透過性を促進するために重要なも若干組織脆弱性の増加し、後処理を損傷しやすくなります。その効率に関して mPACT の明確な優位性を上回るこの制限に最大クリアで得られることを確認する作業が行われて現在それにもかかわらず、組織の整合性のない経費を最小限に抑えています。
したがって、我々 の結果は、神経回路網、血液血管系、組織マトリックス アーキテクチャに限定されないを含む哺乳類の器官の機能的および解剖学的特徴の 3 D 分析を提供するための強力な調査ツールとして mPACT を確立します。今後は、mPACT など組織の損傷、発達奇形、がん、神経変性疾患の病態生理に寄与する高次生物学的メカニズムの調査に特に有用であると考えてください。病気14,15,16,17。MPACT 病に関与する細かい細胞のメカニズムの研究と組み合わせることで、観察された表現型を生じさせるのにさまざまな異なる病気のメカニズムの相互作用を理解することより完全なマルチ スケールを提供する可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、延世大学医科学脳韓国 21 プラス プロジェクトによって支えられました。さらに、この作品は、韓国の国立研究財団 (NRF-2017R1D1A1B03030315) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
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