Summary
Här presenterar vi två nya metoder, psPACT och mPACT, för att uppnå maximal optisk transparens och efterföljande Mikroskopisk analys av vävnad kärlsystemet i intakt gnagare hela CNS.
Abstract
Sedan utvecklingen av klarhet, en bioelectrochemical clearing teknik som möjliggör tredimensionella fenotyp kartläggning inom genomskinliga vävnader, en mängd roman clearing metoder inklusive CUBIC (klar, fri hjärnavbildning cocktails och computational analys), strömbrytare (systemomfattande kontroll av interaktion tid) och kinetik av kemikalier, karta (förstorade analys av proteomet) och pakten (passiv tydlighet teknik), har fastställts att ytterligare utvidga den befintliga toolkit för Mikroskopisk analys av biologisk vävnad. Den föreliggande studie syften till att förbättra och optimera ursprungliga pakt förfarandet för en rad intakt gnagare vävnader, inklusive hela centrala nervsystemet (CNS), njurar, mjälte och hela musembryon. Kallas psPACT (process-avskilj PACT) och mPACT (modifierad PACT), ger dessa nya tekniker mycket effektiv medel av kartläggning cell kretsar och visualisera subcellulära strukturer i intakt normal och patologisk vävnad. I följande protokoll ger vi en detaljerad, steg för steg beskrivning om hur man uppnår maximal vävnad clearance med minimal invasion av deras strukturella integritet via psPACT och mPACT.
Introduction
Ett grundläggande mål för vetenskaplig och klinisk undersökning innebär att uppnå en fullständig förståelse av orgel struktur och funktion; dock fungerar ytterst komplexa karaktär av däggdjur organ ofta som en barriär till fullo uppnå detta mål1. KLARHET (tydlig Lipid-utbyts akrylamid-hybridiserad styv Imaging-kompatibel Tisssue-hYdrogel)2,3,4, vilket innebär att bygga en akrylamid-baserade hydrogel hybrid från intakta vävnader, uppnår optiska clearance av en mängd organ, inklusive hjärnan, lever och mjälte, samtidigt som deras strukturella integritet5. TYDLIGHET har därmed möjliggjort inte bara visualisering, men också möjlighet att fint dissekera komplexa mobilnät och vävnad morfologier utan behov för snittning.
För att uppnå vävnad clearance, sysselsätter tydlighet kapillärelektroforetiska metoder att ta bort fettinnehållet av provet till hands. Medan tydlighet har noterats för att producera fysiskt stabil vävnad-hydrogel hybrider, studier har visat att dess användning av elektroforetiska vävnad röjningmetoder (ETC) ger varierande resultat kvalitativt vävnad, inklusive browning, epitop skada, och protein förlust5,6. För att lösa dessa frågor, varit modifierade protokoll såsom pakten (passiv tydlighet teknik), som ersätter ETC behandling med en passiv, ionic-tvättmedel baserat delipidation teknik, utvecklade7,8,9. Trots en större samstämmighet i resultaten, men kräver pakten mer tid för att få maximal clearance. Ingen av dessa tekniker har dessutom ännu tillämpats i hela CNS-formuläret, eller i större gnagare modeller såsom råttor och marsvin.
Föreliggande studie syftar till att hantera dessa begränsningar genom att föreslå nya metoder, psPACT (process-avskilj PACT) och mPACT (modifierad PACT), för att underlätta snabb clearance av hela CNS och inre organ i både mus och råtta modellerna10. Specifikt, psPACT bearbetar vävnader i 4% akrylamid och 0,25% VA-044 i två separata steg under hydrogel bildande; mPACT i huvudsak omfattar samma steg, men kompletterar SDS-baserade clearing lösningen med 0,5% α-thioglycerol som en nyckel reagens. Båda teknikerna utnyttja de endogena systemisk och ryggmärgsvätskan cirkulationssystem för att avsevärt minska den tid som behövs för att producera optiska clearance. Som ett bevis på princip demonstrera vi användningen av konfokalmikroskopi att analysera blodkärl mönster i clearade vävnader10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden har godkänts av den lämpliga forskningsetisk kommittén vid Yonsei University College of Medicine. Alla försöksdjur avlivas i enlighet med riktlinjerna i laboratoriet djurvård kommittén vid Yonsei University College of Medicine.
1. beredning av reagens
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD (PFA), akrylamid och sodium dodecyl sulfate (SDS) är giftiga irriterande och således bör hanteras i dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning (PPE, labbrock, handskar, skyddsglasögon).
- 4% akrylamid (Arifi) lösning (A4P0): Tillsätt 20 mL av 40% akrylamid lösning till 180 mL 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- 0,25% VA-044 lösning: Tillsätt 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydroklorid (VA-044) pulver till 200 mL 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Medan VA-044 pulvret kan förvaras i rumstemperatur, måste det lagras vid 4 ° C vid lösbarhet i PBS. För bästa resultat Förbered bara mängden lösning som behövs för experimentet.
- PAKTEN cocktail lösning: tillsätt 10 g av akrylamid till 225 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning och justera volymen till 200 mL med 4% PFA. Före användning, lägga till 100 mg VA-044 pulver 40 mL av blandningen i en 50 mL konisk tub.
- PAKTEN clearing lösning buffert: tillsätt 40 g natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) till 350 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning och justera volymen till 500 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. För mPACT clearing lösning, lägga till 0,5% α-thioglycerol pakten clearing lösning buffert.
- De möss som används i denna studie var 2 veckor gamla BALB hanmöss. de råttor som används i denna studie var 2 veckor gammal SD-hanråttor.
2. anestesi och Perfusion kirurgi
Försiktighet: PFA och akrylamid är giftiga irriterande och således bör hanteras i dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
- Söva djuret i ett patogenfria rum med 30 mg/kg av zoletil med en 1 mL spruta med en 26-gauge nål. Övervaka djuret för 5-10 min.
- När djuret har nått ett kirurgiskt plan av anestesi, använder du metoden tå-nypa svar för att bestämma djupet av anestesi. Bekräfta svarar.
Obs: Följande steg som innefattar mus och råtta kirurgi följer ett liknande protokoll som används i en tidigare studie11. - Göra en 5-6 cm snitt under revbenen, genom integument och bukväggen.
- Använda böjda, trubbiga sax göra ett snitt i membranen, palperas området bröstkorg för att hitta platsen för snitt i förväg.
- Förlänga snittet över hela längden av bröstkorgen att exponera pleural hålighet.
- Försiktigt förskjuta lungorna. Göra ett snitt genom bröstkorgen upp till nyckelbenet. Med iris sax, göra ett litet snitt till den bakre änden av vänster kammare. Infoga en 18 gauge blunt - eller oliv-tippas perfusion nål i aorta ascendens, passerar genom den skurna ventrikeln.
- Säkra nålen och förhindra läckage av fastspänning hjärtat med en hemostat. Alternativt använda en modifierad hemostat för att klämma aorta runt nålspetsen.
- Göra ett stort snitt i höger förmak, noga med för att säkerställa minimal skada fallande aorta. Råttan är nu redo för perfusion.
3. hela Perfusion och dissektion av råtta
Försiktighet: PFA och akrylamid är giftiga irriterande och således bör hanteras i dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
Obs: Följande hela perfusion steg är en liknande till ett protokoll som används i en tidigare studie av Woo et al. (2016) 10 , 11.
- Fäst höger förmak i hjärtat en 18 gauge nål, noga med att inte införa några luftbubblor.
- Snabbt och jämnt med en 50 mL spruta, och pumpa 50 mL kall 0,1 M PBS lösning som innehåller heparin (10 enheter/mL).
- Anslut den 18 gauge nål till röret av den peristaltiska pumpen.
- Tvätta med 200 mL kallt 0,1 M PBS som innehåller heparin (10 enheter/mL) i en cirkulation hastighet på 10 mL/min.
- Fixa med 250 mL kallt 4% PFA lösning i en cirkulation hastighet på 10 mL/min. Råtta bör vara stel i detta skede.
- Samla in och lagra den återstående PFA-lösningen för bortskaffande.
- BEGJUTA vävnader med en kyld pakten cocktail lösning av 4% PFA, 4% akrylamid och 0,25% VA-044 pulver med en 18 gauge nål för pakten, och ta sedan bort huvudet och ryggraden. Exponera skallen genom att göra en mittlinjen snitt från halsen till näsan. Detta ytterligare perfusion steg är onödiga för metoderna psPACT och mPACT; efter fixering, omedelbart isolera huvudet och ryggraden och exponera skallen.
- Exponera basen av skallen genom att ta bort eventuella kvarvarande nacke och ryggrad muskel.
- Använda rongeurs och sax för att skala bort skallen. Ta bort hjärnan och ryggmärgen.
- Lagra vävnaden i 4% PFA vid 4 ° C; vävnader kan lagras i upp till 1 vecka.
4. Hydrogel Monomer Infusion och polymerisation av råtta och mus CNS
Försiktighet: Akrylamid, SDS, α-thioglycerol och PFA är irriterande och således bör hanteras i dragskåp och med lämpliga KISSA.
-
PAKTEN (passiv Clearing teknik)
- Isolera och kultur hela centrala nervsystemet (hjärnan och ryggmärgen) från fasta möss och råttor till en 50 mL tub som innehåller en kyld pakten cocktail lösning på 4% PFA, 4% akrylamid, och 0,25% VA-044 pulver förvaras vid 4 ° C under 24 h. se till att vävnaden är helt nedsänkt i s Olution.
- Bädda in provet i kvävgas för 10 min med en vävnad gel hybridisering system anslutna till en kväve tank: Ställ in systemet till 37 ° C. Överföra vävnader till en 50 mL tub som innehåller färska kall (4 ° C) pakten cocktail lösning och samverka med tube cap, och slå sedan på vakuum.
- För att polymerisera av hydrogel, placera röret som innehåller provet i en skakande inkubator (150 rpm, 37 ° C) i 3 tim eller tills polymerisation är klar.
- Med hjälp av läskpapper (se Tabell för material), ta bort den återstående polymeriserat hydrogel omgivande vävnader.
- Överföra vävnad till en 50 mL tub innehållande clearing lösning (8% SDS i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 8,0).
- Placera provet i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 150 rpm tills vävnaden har rensats. Det tar i genomsnitt ca 20 dagar för musen CNS att uppnå fullständig tydlighet.
-
psPACT (processaa separat passiva Clearing teknik)
- Isolera hela centrala nervsystemet (hjärnan och ryggmärgen) med bone cutter och sax från PFA-fasta möss och råttor på en ren bänk.
- Överföra vävnader till en 50 mL tub som innehåller 4% PFA och store vid 4 ° C under 24 h. se till att vävnaden är helt nedsänkt i fixativ.
- Tvätta den fasta vävnaden för 1 h i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning och sedan överföra till A4P0 lösning (4% akrylamid i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning). Butik vid 37 ° C under 24 h.
- Tvätta vävnaden för 5 min i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Sänk ned vävnaden i 0,25% VA-044 i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. Lagra vid 37 ° C i 6-24 h, och sedan överföra till färska 0,25% VA-044/PBS lösning.
- Bädda in provet i kvävgas för 10 min med en vävnad gel hybridisering system (se Tabell för material) ansluten till en kväve tank: överföra vävnader till en 50 mL tub som innehåller färska kall (4 ° C) 0,25% VA-044/PBS lösning, och Anslut med tube cap. Slå på vakuum.
- Överföra vävnaden till clearing lösning (8% SDS i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 8,0).
- Inkubera provet i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 150 rpm tills vävnaden har rensats. I genomsnitt tar det cirka 17 dagar för mus CNS att uppnå fullständig tydlighet.
-
mPACT (modifierad passiva Clearing teknik)
- Isolera hela centrala nervsystemet (hjärnan och ryggmärgen) med bone cutter och sax från PFA-fasta möss och råttor på en ren bänk.
- Följ steg 4.2.2 - 4.2.8 av protokollet psPACT.
- Överföra vävnaden till clearing lösning. Observera att till skillnad från de pakten och psPACT protokoll, mPACT kräver en clearing lösning bestående av 0,5% α-thioglycerol förutom 8% SDS i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 8,0. Α-thioglycerol är en un-browning agent som hjälper rensa vävnad snabbare och mer effektivt. Se till att vävnaden är helt nedsänkt i lösningen.
- Placera provet i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 150 rpm tills vävnaden har rensats. I genomsnitt tar det cirka 2 veckor för mus CNS att uppnå fullständig tydlighet.
5. brytningsindex matchning och immunfärgning av rensas CNS
Obs: nfälgar (Nycodenz-baserade brytningsindex matchande lösning) består av 0,8 g/mL Nycodenz pulver löses i 30 mL bas buffert (0,01% natriumazid och Tween-20 i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, pH 8,0). Det rekommenderas att lösningen är placerad i en 37 ° C skakar inkubator för korrekt utläggning av pulvret.
- Inkubera vävnader i 0,1% Triton x-100 i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning för 2 h, sedan blockera med 2% bovint serumalbumin (BSA) i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning för 6 h.
- Tvätta sektioner tre gånger i PBST (0,1% Tween-20 i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning) för 2 h. Stain sektioner med primära antikroppar (i detta fall, en anti-kanin PECAM-CD31 antikropp, som fläckar blodkärl) för 2 dagar.
- Fläcken sektioner med sekundära antikroppar (i detta fall ett get anti-kanin IgG Cy3 fluorescerande konjugat) i 2% BSA i 2 dagar.
- Tvätta märkt vävnader tre gånger i PBST för 2 h och store i 15 mL nfälgar för 2-10 dagar.
- Innan imaging, flytta märkt vävnader till en liten mängd nfälgar på 35 - eller 60-mm vävnadsodling rätter. Fixa med silikon runt den nedre kanten av skålen.
- Tillsätt 1,5-2 mL färsk nfälgar.
6. bildbehandling
- Förvärva bilder av rensas vävnader med kakel skanning med en confocal laserskanning microscopewith 10 x förstoring (se Tabell för material). För Cy3-märkt vävnad, använda våglängder av 550-600 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation av en transparent modell av hela CNS med optimerad passiva clearing tekniker
Optiska clearance av mus och råtta hela CNS vävnader uppnås snabbt med hjälp av olika passiva clearing tekniker (figur 1). En schematisk av vävnad clearing över tid visas i figur 2A. Till skillnad från den ursprungliga pakt-metoden innebär psPACT (process-avskilj PACT) behandling av prover med 4% akrylamid (A4P0) och 0,25% VA-044 initieraren lösning i två separata steg för att bilda den hydrogel-hybriden. mPACT (modifierad PACT) ytterligare förbättrar psPACT genom att komplettera den 8% SDS clearing lösning med 0,5% α-thioglycerol. Prover som bearbetas via pakt, psPACT och mPACT på dag 14 jämförs och presenteras i figur 2B.
I en tidigare studie rapporterade vi att medan den ursprungliga pakt protokollet uppnåtts optiska clearance i 23 dagar, psPACT och mPACT rensat hela musen CNS i bara 20 och 14 dagar, respektive10. I den aktuella studien, när vi behandlade mus hjärnan prover via mPACT protokollet, fann vi att de uppnått optisk transparens efter 14 dagar (figur 2B). Råtta hela CNS prover bearbetas via psPACT och mPACT visade också att mPACT uppnås maximal clearance med största effektivitet, som vävnader rensades i 30 och 20 dagar, respektive (figur 3A, B). Adult råtta hjärnor ensam, i motsats till hela CNS, rensades med mPACT i en enbart 5 dagar (figur 4A). Blodkärl mönster av rensas råtta hjärnor analyserades via immunofluorescens efter psPACT och mPACT bearbetning att påvisa nyttan av dessa clearing förfaranden för anatomisk och funktionell analys av hjärnan (figur 4B, mPACT data visas i Woo et al. 2016)10.
Med hjälp av dessa optimerad passiv vävnad clearing protokoll, vi skulle kunna visualisera intakt, transparent modeller i hela CNS, även om de clearing gånger varierade mellan de tre protokollen. Optimerad passiv clearing metoder uppnås orgel tydlighet i en kortare längd av tid. Sammantaget tyder dessa resultat på att de mPACT clearing metod kan generera tydliga CNS mer stabilt och snabbt än den tidigare passiva clearing metoder. Således, mPACT har stor potential för användning i framtida strukturella och anatomiska analyser av däggdjur organ och ger en betydande fördel över befintliga metoder när det gäller både effekt och säkerhet.
Generation av optiskt clearade inre organ och embryon använder mPACT
Förutom hela CNS vävnader, vuxen råtta mjälte och njure rensades med mPACT i 19 och 23 dagar, respektive (figur 5AB). Musembryon E10.5 och E13.5 rensades också efter 3 dagars behandling via protokollet mPACT. Figur 5 c -E visar visualisering av blodkärl mönster i hela embryot, liksom mikrocirkulation i regionen svans i embryot mus, råtta cauda equine och råtta mjälte. Dessa resultat tyder på att mPACT kan användas för att generera tydliga modeller av en mängd olika vävnader och organ för 3D anatomiska analys.
Figur 1: Schematisk bild av optimerad passiva clearing tekniker (PACT). En översikt över de enskilda stegen i samtliga tre pakten protokoll tillhandahålls tillsammans med de reagens som krävs för varje steg. Den ursprungliga pakt-protokollet är vävnad polymerisation från hydrogel formation med en kall blandning av 4% PFA, 4% akrylamid (Arifi) lösning och 0,25% VA-044 initieraren lösning. När vävnaden är polymeriserat använder kvävgas, rensas det passivt med 8% SDS clearing lösning. PsPACT (process-avskilj PACT) använder separata behandlingsprocesser av 4% Arifi lösning och 0,25% VA-044 initieraren lösning för hydrogel bildandet av vävnad; dessa villkor skiljer sig från den ursprungliga pakt-protokollet. MPACT (modifierad PACT) ytterligare lägger till 0,5% α-thioglycerol 8% SDS clearing lösning av protokollet psPACT. För alla tre protokoll, intakta vävnader inkuberas vid > = 37 ° C i en skakande inkubator tills maximal clearance iss uppnåtts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: optisk transparens i musen hela centrala nervsystemet (CNS) genom passiv vävnad clearing. (A) Schematization av hela CNS-vävnaden clearing via pakten-baserade metoder över tid. (B) jämförelse av tre passiva clearing protokoll (ursprungliga pakt, psPACT, mPACT) i musen hela CNS på 14 dagar efter behandlingen. (C) optisk clearance av mus hjärnan utsätts mPACT bearbetning under 14 dagar. Denna siffra har ändrats från Woo et al. 201610. Bokstäverna i 2C är 3 mm höga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: optisk transparens av råtta hela CNS vävnader post-psPACT och mPACT. (A) vuxen råtta hela CNS-vävnaden uppnås maximal optisk clearance med psPACT efter 30 dagar. (B) vuxen råtta hela CNS-vävnaden uppnås maximal optisk clearance med mPACT efter 20 dagar. Den före och efter diagram ange storleken på hela CNS före och efter behandlingen, mätt som ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mPACT bearbetning och mikrocirkulation visualisering av sektionerad vuxen råtta hjärnan. (A) jämförelse av 4 mm tjock vuxen råtthjärna avsnitt efter mPACT bearbetning vid 3 och 5 dagar. (B) 3D projektion av blodkärl mönster i vuxen råtta hjärnan visualiseras med anti-CD31 antikroppar efter psPACT bearbetning. Skala barer och 1 500 µm, 100 µm. Denna siffra har ändrats från Woo et al. 201610. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mPACT bearbetning av gnagare organ och hela musembryon. mPACT uppnåtts optisk transparens i vuxen råtta (A) mjälte och (B) njure i 19 och 23 dagar, respektive. (C) mPACT transparent E10.5 och E13.5 musembryon som producerats efter 3 dagar. (D) visualisering av mikrocirkulation med anti-CD31 i regionen svans i mus embryot efter röjning med mPACT. (E) 3D projektion av kärlsystemet i råtta cauda equine och (F) råtta mjälte med anti-CD31, efter bearbetning via mPACT. Denna siffra har ändrats från Woo et al. 201610. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan passiv, icke-elektrofores extraktionsmetoder anställd i bättre pakten betydligt enhetlighet uppnås med tidigare vävnad clearing metoder såsom klarhet2,3,4,7 , 8, tekniken bär fortfarande flera brister, de mest akuta som är tidsperiod som krävs för att uppnå maximal vävnad tydlighet12. I den aktuella studien presenterar vi ändrade pakten protokoll som avsevärt minska den tid som krävs för vävnad clearing men ändå bevara vävnad integritet och struktur6,10. För första gången visar vi dessutom tillämpningen av vävnad clearing protokoll i hela CNS vävnader och i en högre ordningens gnagare modell, råtta10.
Specifikt psPACT innebär prov behandling i 4% akrylamid och 0,25% VA-044 i två separata steg under bildandet av hydrogel, medan mPACT ytterligare bygger på psPACT och kompletterar 8% SDS clearing lösning med 0,5% α-thioglycerol10. Separera akrylamid och efterföljande VA-044 steg undviker behovet av att ta bort återstående opolymeriserade hydrogel monomerer som omger vävnaden, vilket kan äventyra slutliga vävnad integritet efter öppenhet med pakten; Dessutom, minskar vilket avsevärt den tid som behövs för att producera maximal optisk clearance. Tillägg av α-thioglycerol i metoden mPACT ytterligare accelererar clearing bearbeta13, som α-thioglycerol är en un-browning agent som hjälper rensa regioner av vävnad som är mindre tillgängliga med enbart reagens i den ursprungliga pakt-metoden 7 , 8 , 9.
En jämförelse av pakten, psPACT och mPACT på gnagare vävnad visade att medan psPACT förbättrar optisk transparens i förhållande till den ursprungliga pakt-protokollet, mPACT tillåter mest effektivt för clearing och efterföljande högupplöst avbildning av både hela däggdjur organ och sektionerad skivor, vilket visas i figur 2, figur 3, figur 4. Den α-thioglycerol-baserade lipid bortspolning av bearbetade organ i mPACT metod visat sig vara nyckeln till skillnaderna i öppenhet, effektivitet och vävnad stabilitet jämfört med de andra två röjningmetoder. Detta möjliggjorde för snabb 3D analys av bearbetade organ, särskilt med avseende på blod vaskulatur morfologi, via immunofluorescens och konfokalmikroskopi (figur 5 dE).
Medan tillägg av α-thioglycerol till SDS-baserade clearing lösningen är avgörande för att påskynda optisk transparens, det också något ökar vävnad bräcklighet och gör det mer känsliga för skador efterbearbetning. Tydlig överlägsenhet mPACT när det gäller dess effektivitet överväger denna begränsning; arbete pågår dock för närvarande för att säkerställa att maximal röjning kan uppnås med minimal till ingen kostnad av vävnad integritet.
Således, etablera våra resultat mPACT som ett kraftfullt undersökande verktyg för att ge en 3D-analys av de funktionella och anatomiska funktionerna av däggdjur organ, inklusive men inte begränsat till neuronala nätverk, blod vaskulatur och vävnad matris arkitektur. Går framåt, tror vi mPACT kan vara särskilt användbart i utredningen av högre ordningens biologiska mekanismer som bidrar till patofysiologin av sjukdomar såsom vävnadsskada, utvecklingsmässiga missbildningar, cancer och neurodegenerativa sjukdom14,15,16,17. MPACT kombinerat med en studie av de finare cellulära mekanismerna involverade i sjukdomen, och har potential att ge en mer komplett, flerskalig förståelse av hur olika disparata sjukdom mekanismer samverkar för att ge upphov till den observerade fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av projektet hjärnan Korea 21 PLUS för medicinsk vetenskap, Yonsei University. Dessutom var detta arbete stöds av ett bidrag från den National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
