Summary
Her præsenterer vi to nye metoder, psPACT og IRKNING, for at opnå maksimal optisk gennemsigtighed og efterfølgende mikroskopisk analyse af væv Vaskulaturen i intakt gnaver hele CNS.
Abstract
Siden udviklingen af klarhed, en bioelectrochemical clearing teknik der giver mulighed for tre-dimensionelle fænotype kortlægning i gennemsigtige væv, et væld af roman clearing metoder herunder CUBIC (klar og uhindret brain imaging cocktails og beregningsmæssige analyse), SWITCH (ordning-omfattende kontrol af interaktion tid) og kinetik for kemikalier, kort (forstørret analyse af proteomet) og PAGTEN (passiv klarhed teknik), er blevet etableret til at udvide den eksisterende toolkit for de mikroskopisk analyse af biologisk væv. Nuværende undersøgelse har til formål at forbedre og optimere den oprindelige PAGT procedure for en bred vifte af intakt gnaver væv, herunder hele centralnervesystemet (CNS), nyrer, milt og hele musen embryoner. Kaldes psPACT (proces-separat PAGTEN) og IRKNING (modificerede PAGT), er disse nye teknikker meget virkningsfuldt middel til kortlægning celle kredsløb og visualisere subcellulært strukturer i intakt normal og patologisk væv. I den følgende protokol giver vi en detaljeret, trinvis skitse på hvordan man opnår maximal væv clearance med minimal invasion af deres strukturelle integritet via psPACT og rk.
Introduction
Et grundlæggende mål for videnskabelige og kliniske undersøgelse indebærer at nå en fuldstændig forståelse af organ struktur og funktion; imidlertid fungerer overordentlig komplekse karakter af pattedyr organer ofte som en barriere for fuldt ud at nå dette mål1. KLARHED (klart Lipid-udvekslet acrylamid-hybridiseret stive Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der indebærer etablering af en acrylamid-baserede hydrogel hybrid fra intakt væv, opnår optisk clearance af en lang række organer, herunder hjerne, lever og milt, samtidig bevare deres strukturelle integritet5. KLARHED har således gjort det muligt ikke kun visualisering, men også mulighed for at fint dissekere komplekse mobilnetværk og væv morfologier uden behov for skæring.
For at opnå væv clearance, beskæftiger klarhed elektroforese metoder til at fjerne lipid-indholdet i prøven ved hånden. Mens klarhed er blevet bemærket for at producere fysisk stabilt væv-hydrogel hybrider, undersøgelser har vist, at brugen af elektroforese væv clearing (osv) metoder giver variable resultater kvalitativt væv, herunder browning, epitop skade, og protein tab5,6. For at løse disse problemer, blevet modificeret protokoller såsom PAGTEN (passiv klarhed teknik), som erstatter den osv behandling med en passiv, ionisk-rengøringsmiddel baseret delipidation teknik, udviklede7,8,9. På trods af at opnå en større konsistens i resultater, men kræver PAGTEN mere tid til at opnå maksimal frihøjde. Desuden, ingen af disse teknikker er endnu blevet anvendt til hele CNS form eller i større gnavere modeller som rotter og marsvin.
Den nuværende undersøgelse søger at imødegå disse begrænsninger ved at foreslå nye metoder, psPACT (proces-separat PAGTEN) og IRKNING (modificerede PAGT), for at lette den hurtig clearance af hele CNS og indre organer i både mus og rotter modeller10. Specifikt, psPACT processer væv i 4% acrylamid og 0,25% VA-044 i to adskilte trin under hydrogel dannelse; IRKNING væsentlige indebærer de samme trin, men supplerer SDS-baserede clearing løsning med 0,5% α-thioglycerol som et centralt reagens. Begge teknikker udnytte de endogene systemiske og cerebrospinal kredsløbssystemet for at reducere den tid at producere optiske clearance. Som et bevis for princip demonstrere vi brugen af Konfokal mikroskopi til at analysere blodkar mønstre i ryddet væv10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er blevet godkendt af de relevante videnskabsetisk komité på Yonsei University College of Medicine. Alle forsøgsdyr er ofret efter retningslinjerne i laboratorium animalsk omhu Udvalget på Yonsei University College of Medicine.
1. forberedelse af reagenser
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD (PFA), acrylamid og sodium dodecyl sulfat (SDS) er giftige lokalirriterende og dermed bør håndteres i et stinkskab med passende personlige værnemidler (PPE, laboratoriekittel, handsker, beskyttelsesbriller).
- 4% acrylamid (AA) løsning (A4P0): tilsættes 20 mL 40% acrylamid til 180 mL af 0,1 M fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- 0,25% VA-044 løsning: tilsættes 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochlorid (VA-044) pulver til 200 mL af 0,1 M fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Mens VA-044 pulver kan opbevares ved stuetemperatur, skal det opbevares ved 4 ° C ved oploesning i PBS. For de bedste resultater, forberede kun mængden af løsning nødvendig for eksperimentet.
- PAGTEN cocktail løsning: tilsættes 10 g af acrylamid 225 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) løsning og justere lydstyrken til 200 mL med 4% PFA. Før brug, tilføje 100 mg af VA-044 pulver til 40 mL af blandingen i en 50 mL konisk slange.
- PAGTEN clearing løsning buffer: tilsættes 40 g sodium dodecyl sulfat (SDS) til 350 mL af 0,1 M PBS og justere lydstyrken til 500 mL med 0,1 M PBS. IRKNING clearing løsning, tilføje 0,5% α-thioglycerol-pagten i clearing løsning buffer.
- Mus bruges i dette studie var 2 uger gamle BALB mandlige mus; rotter anvendes i dette studie var 2 uger gamle mandlige SD-rotter.
2. anæstesi og Perfusion kirurgi
Forsigtig: PFA og acrylamid er giftige lokalirriterende og dermed bør håndteres i et stinkskab med passende PPE.
- Bedøver dyret i en patogenfrie værelse med 30 mg/kg af zoletil ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 26-gauge kanyle. Overvåge dyr for 5-10 min.
- Når dyret har nået et kirurgisk fly af anæstesi, skal du bruge metoden tå-knivspids svar til at bestemme dybden af anæstesi. Bekræfte passivitet.
Bemærk: Følgende trin med mus og rotter kirurgi følge en lignende protokol, der bruges i et tidligere studie11. - Lave en 5-6 cm snit under brystkassen, gennem integument og bugvæggen.
- Bruge buede, sløv saks til at gøre et snit i mellemgulvet, føles det thorax område for at finde webstedet for indsnit på forhånd.
- Udvide snit på tværs af hele længden af brystkassen til at udsætte den pleural hulrum.
- Omhyggeligt fortrænge lungerne. Gøre et snit gennem brystkassen op til kraveben. Brug iris saks, lave et lille snit til den bageste ende af venstre ventrikel. Indsæt en 18-gauge stump eller olive spids perfusion nål i opstigende aorta, passerer gennem snit ventriklen.
- Sikre nålen og forhindre lækage ved fastspænding hjerte med en hemostat. Alternativt, brug en modificeret hemostat spænd aorta omkring nålen tip.
- Gøre en stor indsnit i højre atrium, at tage sig til at sikre minimal skade på den nedadgående aorta. Rotten er nu klar til perfusion.
3. hele Perfusion og dissektion af rotte
Forsigtig: PFA og acrylamid er giftige lokalirriterende og dermed bør håndteres i et stinkskab med passende PPE.
Bemærk: Følgende hele perfusion trin er en ligner en protokol, der bruges i en tidligere undersøgelse af Woo mfl. (2016) 10 , 11.
- Tillægge en 18-gauge kanyle, idet man ikke indføre nogen luftbobler højre atrium i hjertet.
- Ved hjælp af en 50 mL sprøjte, hurtigt og jævnt pumpe 50 mL koldt 0,1 M PBS løsning indeholdende heparin (10 enheder/mL).
- Tilslut 18-gauge kanyle til rør af den peristaltiske pumpe.
- Vask med 200 mL koldt 0,1 M PBS løsning indeholdende heparin (10 enheder/mL) med en omsætning hastighed på 10 mL/min.
- Fix med 250 mL koldt 4% PFA løsning med en omsætning hastighed på 10 mL/min. Rotten skal være stiv på dette stadium.
- Indsamle og opbevare den resterende PFA løsning til bortskaffelse.
- For PAGTEN, perfuse væv med en kølet PAGTEN cocktail løsning af 4% PFA, 4% acrylamid og 0,25% VA-044 pulver med en 18-gauge kanyle, og derefter fjerne hoved og ryg. Udsætte kraniet ved at lave en midterlinjen snit fra nakken til næsen. Dette ekstra perfusion trin er unødvendig for metoderne psPACT og IRKNING; efter fiksering, straks isolere hoved og ryg og udsætte kraniet.
- Udsætte bunden af kraniet ved at fjerne enhver resterende nakke og ryg muskler.
- Brug rongeurs og saks til at skrælle væk kraniet. Fjerne hjernen og rygmarven.
- Gemme vævet i 4% PFA ved 4 ° C; væv kan opbevares i op til 1 uge.
4. Hydrogel Monomer Infusion og polymerisering af rotter og mus CNS
Forsigtig: Acrylamid, SDS, α-thioglycerol og PFA er lokalirriterende og dermed bør håndteres i et stinkskab og med passende TISSE.
-
PAGTEN (passiv Clearing teknik)
- Isolere og kultur i hele CNS (hjerne og rygmarv) fra faste mus og rotter til en 50 mL tube indeholdende en kølet PAGTEN cocktail løsning af 4% PFA, 4% acrylamid, og 0,25% VA-044 pulver og opbevares ved 4 ° C i 24 h. sikre at vævet er helt nedsænket i s opløsninger.
- Integrere prøven i nitrogen gas for 10 min ved hjælp af en væv gel hybridisering system forbundet til en tank, kvælstof: indstille systemet til 37 ° C. Overføre væv til en 50 mL tube indeholdende frisk koldt (4 ° C) PAGTEN cocktail løsning og tilslutte med rør cap og derefter tænde tomrummet.
- For at polymerisere hydrogel, placere røret indeholder prøven i et rystende inkubator (150 rpm, 37 ° C) i 3 timer, eller indtil polymerisering er fuldført.
- Ved hjælp af trækpapir (Se Tabel af materialer), Fjern de resterende polymeriseret hydrogel omkringliggende væv.
- Overføre væv til en 50 mL tube indeholdende clearing løsning (8% SDS i 0,1 M PBS, pH 8,0).
- Prøven anbringes i et rystende inkubator, indstillet til 37 ° C og 150 omdr. / min., indtil væv, der er blevet ryddet. I gennemsnit, tager det ca 20 dage for musen CNS at opnå fuld klarhed.
-
psPACT (behandle separate passiv Clearing teknik)
- Isolere hele CNS (hjerne og rygmarv) med knogle cutter og saks fra PFA-fast mus og rotter på en ren bænk.
- Overføre væv til en 50 mL tube 4 vægtprocent PFA, og opbevares ved 4 ° C i 24 h. sikre at vævet er helt nedsænket i fiksativ.
- Vaske den faste væv til 1 h i 0,1 M PBS, og derefter overføre til A4P0 løsning (4% acrylamid i 0,1 M PBS). Butik ved 37 ° C i 24 timer.
- Vask væv i 5 min i 0,1 M PBS.
- Fordyb væv i 0,25% VA-044 i 0,1 M PBS. Opbevar ved 37 ° C i 6-24 timer, og derefter overføre til frisk 0,25% VA-044/PBS løsning.
- Integrere prøven i nitrogen gas for 10 min ved hjælp af en væv gel hybridisering system (Se Tabel af materialer) forbundet til en tank, kvælstof: overføre væv til en 50 mL tube indeholdende frisk koldt (4 ° C) 0,25% VA-044/PBS løsning, og i forbindelse med rør cap. Tænde en vakuum.
- Overføre vævet til clearing løsning (8% SDS i 0,1 M PBS, pH 8,0).
- Inkuber prøven i et rystende inkubator, indstillet til 37 ° C og 150 omdr. / min., indtil væv, der er blevet ryddet. I gennemsnit tager det cirka 17 dage for musen CNS at opnå fuld klarhed.
-
Rk (modificeret passiv Clearing teknik)
- Isolere hele CNS (hjerne og rygmarv) med knogle cutter og saks fra PFA-fast mus og rotter på en ren bænk.
- Følg trin 4.2.2 - 4.2.8 af psPACT-protokollen.
- Overføre vævet til clearing løsning. Bemærk, at i modsætning til protokollerne PAGTEN og psPACT rk kræver en clearing løsning bestående af 0,5% α-thioglycerol ud over 8% SDS i 0,1 M PBS, pH 8,0. Α-thioglycerol er en un-browning agent, som hjælper med at fjerne væv mere hurtigt og effektivt. Sikre at vævet er fuldt nedsænket i løsningen.
- Prøven anbringes i et rystende inkubator, indstillet til 37 ° C og 150 omdr. / min., indtil væv, der er blevet ryddet. I gennemsnit, tager det ca 2 uger for musen CNS at opnå fuld klarhed.
5. brydningsindeks Matching og immunfarvning af ryddet CNS
Bemærk: nfælge (Nycodenz-baserede brydningsindeks matchende løsning) består af 0,8 g/mL Nycodenz pulver opløses i 30 mL base buffer (0,01% natriumazid og Tween-20 i 0,1 M PBS, pH 8,0). Det anbefales, at løsningen er placeret i et 37 ° C ryster inkubator at give mulighed for korrekt solvation af pulver.
- Inkuber væv i 0,1% Triton X-100 i 0,1 M PBS for 2 h, derefter blokere med 2% bovint serumalbumin (BSA) i 0,1 M PBS til 6 h.
- Vaske sektioner tre gange i PBST (0,1% Tween-20 i 0,1 M PBS) for 2 h. pletten sektioner med primære antistoffer (i dette tilfælde, en anti-kanin PECAM-CD31 antistof, som pletter blodkar) for 2 dage.
- Pletten sektioner med sekundære antistoffer (i dette tilfælde, en ged anti-kanin IgG Cy3 fluorescerende konjugat) i 2% BSA i 2 dage.
- Vask mærket væv tre gange i PBST for 2 h og butik i 15 mL nfælge til 2-10 dage.
- Før imaging, flytte mærket væv til en lille mængde af nfælge på 35 eller 60 mm vævskultur retter. Fix med silikone omkring den nederste kant af fadet.
- Der tilsættes 1,5-2 mL frisk nfælge.
6. billedbehandling
- Erhverve billeder af ryddet væv med flise-scanning ved hjælp af en Konfokal laser-scanning microscopewith 10 x forstørrelse (Se Tabel af materialer). For Cy3-mærket væv, bruge bølgelængder af 550-600 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation af en gennemsigtig model af hele CNS ved hjælp af optimeret passiv clearing teknikker
Optisk clearance af mus og rotter hele CNS væv blev hurtigt opnået ved hjælp af forskellige passive clearing teknikker (figur 1). En skematisk af væv clearing over tid er vist i figur 2A. I modsætning til den oprindelige PAGT metode indebærer psPACT (proces-separat PAGTEN) behandling af prøver med 4% acrylamid (A4P0) og 0,25% VA-044 initiativtager løsning i to separate skridt for at danne hydrogel hybrid. Rk (modificerede PAGT) yderligere forbedrer psPACT ved at supplere de 8% SDS clearing løsning med 0,5% α-thioglycerol. Prøverne behandles via PAGTEN, psPACT og IRKNING på dag 14 sammenholdes og præsenteret i figur 2B.
I en tidligere undersøgelse rapporterede vi, mens den oprindelige PAGTEN protokollen opnået optisk clearance i 23 dage, psPACT og IRKNING ryddet hele musen CNS i bare 20 og 14 dage, henholdsvis10. I den aktuelle undersøgelse, da vi behandlede mus hjernen prøver via IRKNING protokol, fandt vi at de opnåede optisk gennemsigtighed efter 14 dage (figur 2B). Rotte hele CNS prøver behandlet via psPACT og IRKNING viste også at IRKNING opnået maksimal frihøjde med den største effektivitet, som væv blev ryddet i 30 og 20 dage, henholdsvis (figur 3A, B). Voksen rotte hjerner alene, i modsætning til hele CNS, blev ryddet med rk i en blot 5 dage (figur 4A). Blodkar mønstre af ryddet rotte hjerner blev analyseret via immunofluorescens efter psPACT og IRKNING behandling at påvise nytten af disse clearing procedurer til anatomisk og funktionel analyse af hjernen (figur 4B, IRKNING data vist i Woo et al. 2016)10.
Ved hjælp af disse optimeret passiv væv clearing protokoller, vi var i stand til at visualisere intakt, gennemsigtig modeller af hele CNS, selv om clearing-tid afveg blandt de tre protokoller. Optimeret passiv clearing metoder opnåede orgel klarhed i et kortere tidsrum. Taget sammen, tyder disse resultater på, at IRKNING clearing metode kan generere klare CNS mere stabilt og hurtigere end den tidligere passive clearing metoder. Således IRKNING rummer et stort potentiale for brug i fremtiden anatomiske og strukturelle analyser af pattedyr organer og giver en betydelig fordel i forhold til eksisterende metoder i form af både effektivitet og sikkerhed.
Generation af optisk ryddet indre organer og embryoner ved hjælp af rk
Ud over hele CNS væv, voksen rotte milt- og nyrevæv blev ryddet med IRKNING i 19 og 23 dage, henholdsvis (figur 5AB). Musen embryoner på E10.5 og E13.5 blev også ryddet efter 3 dage af behandling via IRKNING protokol. Figur 5 c -E viser visualisering af blodkar mønstre i hele fosteret, samt microvasculature af regionen hale af musen embryo, rotte cauda heste og rotte milten. Disse resultater tyder på, at IRKNING kan bruges til at generere gennemsigtig modeller af en bred vifte af væv og organer til 3D anatomiske analyse.
Figur 1: skematisk fremstilling af optimerede passiv clearing teknikker (PACT). En oversigt over de enkelte trin i hver af de tre protokoller, PAGTEN tilbydes sammen med de reagenser, der kræves for hvert trin. Den oprindelige PAGT protokol er væv polymerisering fra hydrogel dannelse med en kold blanding af 4% PFA, 4% acrylamid (AA) løsning og 0,25% VA-044 initiativtager løsning. Når væv er polymeriserede ved hjælp af nitrogen gas, er det passivt ryddet med 8% SDS clearing løsning. PsPACT (proces-separat PAGTEN) bruger separate behandlingsprocesser af 4% AA løsning og 0,25% VA-044 initiativtager løsning for hydrogel dannelsen af væv; disse betingelser afvige fra de oprindelige PAGTEN protokol. Rk (modificerede PAGT) yderligere tilføjer 0,5% α-thioglycerol til 8% SDS clearing løsning af psPACT-protokollen. For alle tre protokoller, intakt væv er inkuberes ved > = 37 ° C i en rystende inkubator indtil maksimal clearance iss opnåede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: optisk gennemsigtighed af musen hele centralnervesystemet (CNS) af passive væv clearing. (A) Schematization af hele CNS væv clearing via PACT-baserede metoder over tid. (B) en sammenligning af de tre passive clearing protokoller (oprindelige PAGTEN, psPACT, rk) i mus hele CNS 14 dage efter behandling. (C) optisk clearance af musen hjernen underkastes IRKNING behandling over 14 dage. Dette tal er blevet ændret fra Woo et al. 201610. Bogstaver i 2C er 3 mm høj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: optisk gennemsigtighed af rotte hele CNS væv post-psPACT og rk. (A) voksen rotte hele CNS væv opnået maksimal optisk clearance med psPACT efter 30 dage. (B) voksen rotte hele CNS væv opnået maksimal optisk clearance med IRKNING efter 20 dage. Den før og efter diagrammer viser størrelsen af den hele CNS før og efter behandling, som målt ved øjet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: IRKNING behandling og microvasculature visualisering af sektioneret voksen rotte hjerne. (A) sammenligning af 4 mm tyk voksen rotte hjernen sektioner efter IRKNING behandling på 3-5 dage. (B) 3D projektion af blodkar mønstre i voksen rotte hjernen visualiseret med anti-CD31 antistoffer efter behandling af psPACT. Skala barer, 1.500 µm og 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Woo et al. 201610. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: IRKNING behandling af gnavere organer og hele musen embryoner. IRKNING opnået optisk gennemsigtighed i voksen rotte (A) milt og (B) nyre i 19 og 23 dage, henholdsvis. (C) IRKNING produceret gennemsigtige E10.5 og E13.5 mus embryoner efter 3 dage. (D) visualisering af microvasculature med anti-CD31 i regionen hale af musen embryo efter clearing med rk. (E) 3D projektion af Vaskulaturen i rotte cauda heste og (F) rotte milt med anti-CD31, efter behandling via rk. Dette tal er blevet ændret fra Woo et al. 201610. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens de passive, ikke-elektroforese udvindingsmetoder ansat i forbedret PAGTEN væsentligt sammenhæng opnåede med tidligere væv clearing metoder såsom klarhed2,3,4,7 , 8, teknikken, der stadig bærer flere mangler, den mest presserende som er længden af tid, der kræves til at opnå maksimal væv klarhed12. I den aktuelle undersøgelse præsenterer vi modificerede PAGT protokoller, at reducerer den nødvendige tid til væv clearing samtidig stadig bevare væv integritet og struktur6,10. Desuden for første gang vise vi anvendelsen af væv clearing protokoller i hele CNS væv og i en højere orden gnaver model, rat10.
Specifikt, psPACT indebærer prøve behandling i 4% acrylamid og 0,25% VA-044 i to adskilte trin under hydrogel dannelse, mens IRKNING videre bygger på psPACT og supplerer de 8% SDS clearing løsning med 0,5% α-thioglycerol10. Adskille acrylamid og efterfølgende VA-044 trin undgår behovet for fjernelse af resterende Upolymeriseret hydrogel monomerer, der omgiver det væv, som kan kompromittere endelige vævet intakt efter at opnå åbenhed med PAGTEN; Desuden reducerer det tid til at producere maksimal optisk clearance. Tilsætning af α-thioglycerol i metoden IRKNING yderligere accelererer clearing behandle13, α-thioglycerol er en un-browning agent, som hjælper med at rydde områder af væv, der er mindre tilgængelig ved hjælp af kun reagenserne i den oprindelige PAGT metode 7 , 8 , 9.
En sammenligning af PAGTEN, psPACT og virkninger på gnavere væv demonstreret, mens psPACT forbedrer optisk gennemsigtighed i forhold til den oprindelige PAGT protokol, IRKNING mest effektivt giver mulighed for clearing og efterfølgende høj opløsning billeddannelse af både hele pattedyr organer og sektioneret skiver, som vist i figur 2, figur 3, fig. 4. Α-thioglycerol-baserede lipid udvaskning af forarbejdede organer i IRKNING metode vist sig at være nøglen til forskelle i gennemsigtighed, effektivitet og væv stabilitet i forhold til de andre to clearing metoder. Dette gav mulighed for hurtig 3D analyse af forarbejdede organer, specielt med hensyn til blod Vaskulaturen morfologi, via immunofluorescens og konfokal mikroskopi (figur 5 dE).
Mens tilføjelsen af α-thioglycerol til SDS-baserede clearing løsning er kritisk for fremskyndelse optisk gennemsigtighed, det også lidt øger væv skrøbelighed og gør det mere modtagelige for skader post-processing. Rk med hensyn til dens effektivitet klar overlegenhed opvejer denne begrænsning; ikke desto mindre, i øjeblikket arbejdes for at sikre, at maksimal clearing kan opnås med minimal at ingen udgift af væv integritet.
Således, vores resultater etablere IRKNING som en kraftfuld efterforskningsredskab for at give en 3D analyse af de anatomiske og funktionelle elementer i pattedyr organer, herunder men ikke begrænset til neuronal netværk, blod kar og væv matrix arkitektur. Bevæger sig fremad, mener vi IRKNING kunne især nyttig i forbindelse med undersøgelsen af højere orden biologiske mekanismer, der bidrager til sygdom, såsom vævsskade, udviklingsmæssige misdannelser, kræft og neurodegenerative Patofysiologi sygdom14,15,16,17. Kombineret med en undersøgelse af de finere cellulære mekanismer involveret i sygdom, har rk potentialet til at levere en mere komplet, multi-skala forståelse af hvordan forskellige spredte sygdommen mekanismer interagere for at give anledning til den observerede fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af hjernen Korea 21 PLUS projektet for lægevidenskaben, Yonsei Universitet. Hertil kommer, blev dette arbejde støttet af tilskud fra National Research Foundation Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
