Summary
Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.
Abstract
Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT ("modifizierte Pakt") bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.
Introduction
Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.
Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.
Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT ("Prozess-separater Pakt") und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der entsprechenden Forschung an der Yonsei University College of Medicine genehmigt. Alle Versuchstiere sind nach den Richtlinien des Ausschusses Labor Tierbetreuung Yonsei University College of Medicine geopfert.
1. Vorbereitung der Reagenzien
Achtung: Paraformaldehyd (PFA), Acrylamid und Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) sind giftige Reizstoffe und somit in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA, Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) behandelt werden.
- 4 % Acrylamid (A.A.) Lösung (A4P0): 180 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20 mL 40 % Acrylamid-Lösung hinzufügen.
- 0,25 % VA-044 Lösung: Fügen Sie 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride (VA-044) Pulver auf 200 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Während das VA-044-Pulver bei Raumtemperatur gelagert werden kann, muss es bei 4 ° C bei der Solubilisierung mit PBS-Puffer gespeichert werden. Bereiten Sie um beste Ergebnisse zu erzielen nur die Menge der Lösung für das Experiment benötigt.
- Pakt cocktail Lösung: 225 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung 10 g Acrylamid hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 200 mL mit 4 % PFA. Vor dem Einsatz fügen Sie 100 mg VA-044-Pulver 40 mL der Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen hinzu.
- Clearing-Lösung Puffer Pakt: 350 mL 0,1 M PBS 40 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 500 mL mit 0,1 M PBS. Fügen Sie 0,5 % α-Thioglycerol mPACT clearing-Lösung hinzu des Pakts Lösung Puffer löschen.
- Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten BALB männliche Mäuse; die Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten männlichen SD-Ratten.
(2) Anästhesie und Chirurgie der Perfusion
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
- Betäuben Sie das Tier in einem Pathogen-freies Zimmer mit 30 mg/kg Zoletil mit einer 1 mL Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Überwachen Sie das Tier für 5-10 min.
- Sobald das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat, verwenden Sie die Zehe-Prise Antwort-Methode, die Tiefe der Narkose bestimmen. Bestätigen Sie Reaktionsmangel.
Hinweis: Die folgenden Schritte mit Maus und Ratte Chirurgie folgen ein ähnliches Protokoll in einer früheren Studie11verwendet. - Machen Sie einen ca. 5-6 cm Schnitt unterhalb des Brustkorbs durch das Integument und Bauchwand.
- Geschwungene, stumpfe Scheren ein Schnitt in das Zwerchfell, Abtasten der thorakalen Bereich um die Website der Schnitt vorher zu suchen zu verwenden.
- Erstrecken Sie sich des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbs, der Pleurahöhle verfügbar zu machen.
- Verdrängen Sie sorgfältig die Lunge. Machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels. Legen Sie eine Blunt - oder Olive-Kreissägeblätter Perfusion 18-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens, durch den Schnitt Ventrikel.
- Sichern Sie die Nadel und klemmend Herzen mit einer Gefäßklemme verhindern Sie auslaufen zu. Alternativ können Sie eine modifizierte Gefäßklemme Klemmen die Aorta auf die Nadelspitze.
- Machen Sie einen großen Schnitt im rechten Vorhof, kümmert sich um minimale Schäden an der absteigenden Aorta zu gewährleisten. Die Ratte ist nun betriebsbereit Perfusion.
(3) ganze Perfusion und Präparation der Ratte
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
Hinweis: Ganze Perfusion folgendermaßen ähneln einem ein Protokoll in einer früheren Studie von Woo Et al.verwendet. (2016) 10 , 11.
- Legen Sie den rechten Vorhof des Herzens auf ein 18-Gauge-Nadel, kümmert sich um eventuelle Luftblasen nicht vorstellen.
- Mit einer 50 mL-Spritze, Pumpen Sie schnell und gleichmäßig 50 mL kalten 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL).
- Die 18-Gauge-Nadel an das Rohr der peristaltischen Pumpe anschließen.
- Mit 200 mL kalte 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL) bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min waschen.
- Befestigen Sie mit 250 mL kaltem 4 % PFA-Lösung auf eine Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min. Die Ratte sollte in diesem Stadium steif sein.
- Erheben Sie und speichern Sie die restliche PFA-Lösung für die Entsorgung.
- Pakt perfundieren Sie Gewebe mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044-Pulver mit einem 18-Gauge-Nadel, und entfernen Sie dann den Kopf und Wirbelsäule. Setzen Sie den Schädel durch eine Mittellinie Schnitt vom Hals, die Nase. Diese zusätzliche Perfusion Schritt ist nicht erforderlich für die PsPACT und mPACT Methoden; nach der Fixierung sofort isolieren Sie des Kopfes und der Wirbelsäule und setzen Sie des Schädels aus.
- Setzen Sie die Basis des Schädels durch Entfernen alle restlichen Hals und Wirbelsäule Muskel aus.
- Verwenden Sie Rongeurs und Schere zum abschälen des Schädels. Entfernen Sie das Gehirn und das Rückenmark.
- Speichern Sie das Gewebe in 4 % PFA bei 4 ° C; Gewebe können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden.
4. Hydrogel Monomer-Infusion und Polymerisation der Ratte und Maus CNS
Achtung: Acrylamid, SDS, α-Thioglycerol und PFA sind Reizstoffe und sollte so behandelt werden, in einer Dampfhaube und mit entsprechenden PINKELN.
-
Pakt (passiv Clearing-Technik)
- Isolieren und Kultur ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) aus festen Mäuse und Ratten zu einem 50 mL Röhrchen mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 Pulver und Speicher bei 4 ° C für 24 h stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der s vollständig eingetaucht ist. ösung.
- Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung System an einen Stickstofftank angeschlossen gel: Stellen Sie das System auf 37 ° C. Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) Pakt übertragen cocktail Lösung und verbinden mit Rohr Kappe, dann schalten Sie das Vakuum.
- Um das Hydrogel polymerisieren, platzieren Sie das Rohr mit der Probe in einem schütteln Inkubator (150 u/min, 37 ° C) für 3 h oder bis Polymerisation abgeschlossen ist.
- Mit Löschpapier (siehe Tabelle der Materialien), entfernen Sie die restlichen polymerisierten Hydrogel umgebenden Gewebe.
- Übertragen Sie das Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit Clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).
- Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage für die Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.
-
PsPACT (Prozess getrennten passiven Clearing-Technik)
- Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.
- Gewebe zu übertragen, eine 50 mL-Tube mit 4 % PFA und Store bei 4 ° C für 24 h sicherstellen, dass das Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht ist.
- Das fixierte Gewebe für 1 h in 0,1 M PBS waschen und dann übertragen auf A4P0 Lösung (4 % Acrylamid in 0,1 M PBS). Shop bei 37 ° C für 24 h.
- Waschen Sie das Gewebe für 5 min in 0,1 M PBS.
- Tauchen Sie das Gewebe in 0,25 % VA-044 in 0,1 M PBS. Bei 37 ° C für 6-24 h speichern Sie und übertragen Sie dann auf frischen 0,25 % VA-044/PBS-Lösung.
- Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung gel System (siehe Tabelle der Materialien) an einen Stickstofftank angeschlossen: übertragen Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) 0,25 % VA-044/PBS-Lösung, und in Verbindung mit Rohr Kappe. Schalten Sie das Vakuum.
- Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).
- Inkubieren Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.
-
mPACT (modifizierte Passive Clearing-Technik)
- Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.
- Führen Sie die Schritte 4.2.2 - 4.2.8 des PsPACT-Protokolls.
- Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu den Pakt und PsPACT Protokolle mPACT eine Clearing-Lösung bestehend aus 0,5 % α-Thioglycerol zusätzlich 8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0 benötigt. Α-Thioglycerol ist ein UN-Bräunung Mittel, das hilft Gewebe deutlich schneller und effektiver. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in die Lösung getaucht ist.
- Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es ca. 2 Wochen für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.
(5) Brechungsindex Matching und Immunostaining geräumte CNS
Hinweis: nFelgen (Nycodenz-basierte Brechungsindex passende Lösung) besteht aus 0,8 g/mL Nycodenz Pulver, gelöst in 30 mL Basis-URI Puffer (0,01 % Natriumazid und Tween 20 in PBS 0,1 M, pH 8,0). Es wird empfohlen, dass die Lösung sich in einem 37 ° C schütteln Inkubator befindet, um richtige Solvatation des Pulvers zu ermöglichen.
- Inkubieren Sie Gewebe in 0,1 % Triton x-100 in 0,1 M PBS für 2 h, dann blockieren Sie mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1 M PBS für 6 h.
- Abschnitte in PBST dreimal waschen (0,1 % Tween 20 in PBS 0,1 M) für 2 h. Fleck Abschnitte mit primären Antikörper (in diesem Fall, ein Anti-Kaninchen PECAM-CD31 Antikörper, die Blutgefäße Flecken) für 2 Tage.
- Färben Sie Abschnitte mit Sekundärantikörper (in diesem Fall eine Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3 fluoreszierende Konjugat) in 2 % BSA für 2 Tage.
- Waschen mit der Bezeichnung Gewebe dreimal in PBST für 2 h und laden in 15 mL nFelgen für 2-10 Tage.
- Bewegen Sie vor Bildgebung beschrifteten Gewebe, eine kleine Menge von n-Felgen auf 35 oder 60 mm Gewebekultur Schalen. Befestigen Sie mit Silikon am unteren Rand der Schale.
- 1,5-2 mL frische nFelgen hinzugeben.
6. Bildbearbeitung
- Abrufen von Bildern der geräumten Gewebe mit Kachel Scannen mit einem konfokalen Laserscanning-Microscopewith 10 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien). Für Cy3 beschriftet Gewebe, verwenden Sie Wellenlängen von 550-600 nm.
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Representative Results
Generation ein transparentes Modell des gesamten ZNS mit optimierten passiven Clearing-Techniken
Optische Clearance von Maus und Ratte ganze CNS-Gewebe wurde schnell erreicht mit verschiedenen Techniken der passiven Clearing (Abbildung 1). Abbildung 2Azeigt eine schematische Darstellung des Gewebes im Laufe der Zeit löschen. Im Gegensatz zu der Originalmethode Pakt umfasst PsPACT (Prozess-separater Pakt) Behandlung von Proben mit 4 % Acrylamid (A4P0) und 0,25 % VA-044 Initiator Lösung in zwei getrennten Schritten um das Hydrogel-Hybrid zu bilden. mPACT ("modifizierte Pakt") durch die Ergänzung der 8 % SDS clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol PsPACT weiter verbessert. Proben über Pakt, PsPACT und mPACT am 14. Tag abgewickelt werden verglichen und in Abbildung 2 bdargestellt.
In einer früheren Studie berichteten wir, dass, während das ursprüngliche Pakt Protokoll optischen Freiraum innerhalb von 23 Tagen, PsPACT erreicht und mPACT die gesamte Maus CNS in nur 20 bis 14 Tage, jeweils10 klärte. In der vorliegenden Studie als wir Maus Gehirn Proben über das mPACT-Protokoll behandelt, fanden wir, dass sie nach 14 Tagen (Abbildung 2 b) optischen Transparenz erreicht. Ratte ganze CNS Proben über PsPACT abgewickelt und mPACT zeigte auch, dass diese mPACT maximale Bodenfreiheit mit der größten Effizienz erreicht als Gewebe bzw. in 30 und 20 Tagen gelöscht wurden (Abb. 3A, B). Erwachsenen Ratte Gehirn allein, im Gegensatz zu der gesamten CNS gerodet mit mPACT in nur 5 Tage (Abbildung 4A). Blutgefäß Muster geräumte Ratte Gehirne wurden nach PsPACT und mPACT Verarbeitung das Dienstprogramm dieser Clearing-Verfahren für die anatomische und funktionelle Analyse des Gehirns (Abbildung 4 b, mPACT Daten zeigen über Immunfluoreszenz analysiert. dargestellt in Woo Et Al. 2016)10.
Mit diesen optimierten passiven Gewebe Protokolle löschen, konnten wir visualisieren, intakt, transparente Modelle des gesamten ZNS, obwohl die Clearing-Zeiten unter den drei Protokolle unterschieden. Optimierte passiv clearing Methoden erreicht Orgel Klarheit in eine kürzere Zeitspanne. Zusammen genommen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mPACT clearing Methode klar CNS stabil und schnell als die vorherige passive clearing Methoden erzeugen kann. So mPACT birgt ein großes Potenzial für den Einsatz in Zukunft strukturelle und anatomische Analysen von Säugetieren Organe und bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber bestehenden Methoden in Bezug auf Wirksamkeit und Sicherheit.
Generation von optisch ausgeglichene innere Organe und Embryonen mit mPACT
Neben ganzen CNS Gewebe Erwachsenen Ratte Milz und Niere gerodet mit mPACT in 19 bis 23 Tage, bzw. (Abbildung 5AB). Maus-Embryonen im E10.5 und E13.5 wurden auch nach 3 Tagen Verarbeitung über das mPACT Protokoll gelöscht. Abbildung 5 -E zeigt die Visualisierung von Blutgefäß-Muster in der gesamte Embryo sowie die Microvasculature der Rute Region des Mausembryos, Ratte Cauda Pferde und die Ratte Milz. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mPACT kann verwendet werden, um transparente Modelle eine Vielzahl von Geweben und Organen für anatomische 3D-Analysen zu generieren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des optimierten passiven Clearing Techniken ("Pakt"). Ein Überblick über die einzelnen Schritte in jedem der drei Pakt Protokolle erfolgt neben der Reagenzien, die für jeden Schritt benötigt. Das ursprüngliche Pakt-Protokoll ist Gewebe Polymerisation aus Hydrogel-Formation mit einer kalten Mischung aus 4 % PFA, 4 % Acrylamid (A.A.) Lösung und 0,25 % VA-044 Initiator Lösung. Nachdem Gewebe mit Stickstoffgas polymerisiert ist, ist es passiv mit 8 % SDS clearing-Lösung geleert. PsPACT (Prozess-separater Pakt) verwendet separate Aufbereitungsverfahren von A.A.-Lösung 4 % und 0,25 % VA-044 Initiator für die Hydrogel-Bildung des Gewebes; Diese Bedingungen unterscheiden sich von denen des ursprünglichen Pakt-Protokolls. MPACT (modifizierte Pakt) zusätzliche verleiht 0,5 % α-Thioglycerol der 8 % SDS clearing-Lösung des PsPACT-Protokolls. Für alle drei Protokolle sind die intakten Gewebe bei inkubiert > = 37 ° C in einem schütteln Inkubator bis zum maximalen Freiraum Iss erreicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Optische Transparenz der Maus ganze zentrale Nervensystem (ZNS) von passiven Gewebe Clearing. (A) Schematisierungen der ganze CNS-Gewebe clearing über PACT-basierte Methoden im Laufe der Zeit. (B) Vergleich der drei passive Clearing-Protokolle (ursprüngliche Pakt, PsPACT, mPACT) im gesamten ZNS Maus 14 Tage nach der Verarbeitung. (C) optische Abstand von dem Gehirn der Maus mPACT Verarbeitung mehr als 14 Tage ausgesetzt. Diese Zahl wurde von Woo Et Al. 201610geändert. Die Briefe in 2C sind 3 mm groß. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Optische Transparenz der Ratte ganze CNS Gewebe Post-PsPACT und mPACT. (A) Erwachsenen Ratte ganze CNS Gewebe erreicht maximale optische Freiraum mit PsPACT nach 30 Tagen. (B) Erwachsenen Ratte ganze CNS Gewebe erreicht maximale optische Freiraum mit mPACT nach 20 Tagen. Die vor und nach der Diagramme zeigen die Größe des gesamten ZNS vor und nach der Behandlung gemessen am Auge. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: mPACT Verarbeitung und Microvasculature Visualisierung von geschnittenen Erwachsenen rattengehirn. (A) Vergleich von 4 mm dicken Erwachsenen rattengehirn Abschnitte nach mPACT Verarbeitung bei 3 bis 5 Tagen. (B) 3D-Projektion Blutgefäß Muster in den Erwachsenen rattengehirn visualisiert mit Anti-CD31 Antikörper nach der PsPACT Bearbeitung. Maßstabsbalken, 1.500 µm und 100 µm. Diese Zahl wurde von Woo Et Al. 201610geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: mPACT Verarbeitung von Nagetier Organe und ganze mausembryonen. mPACT erzielte optischen Transparenz in der adulten Ratte (A) Milz und Niere (B) bzw. 19 und 23 Tage. (C) mPACT produziert transparente E10.5 und E13.5-Maus-Embryonen nach 3 Tagen. (D) Visualisierung von Microvasculature mit Anti-CD31 Schweif und Umgebung der Maus-Embryo nach der Reinigung mit mPACT. (E) 3D Projektion des Gefäßsystems in Ratte Cauda equine und (F) Ratte Milz mit Anti-CD31, nach der Verarbeitung über mPACT. Diese Zahl wurde von Woo Et Al. 201610geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist. In der aktuellen Studie präsentieren wir modifizierte Pakt-Protokolle, die deutlich Zeit für Gewebe clearing weniger Beibehaltung noch Gewebe Integrität und Struktur6,10. Darüber hinaus zeigen wir zum ersten Mal die Anwendung von clearing-Protokolle im ganzen CNS-Gewebe "und" in einem Nagetier höherer Ordnung-Modell der Ratte10Gewebe.
Konkret geht PsPACT Probenverarbeitung in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten bei Hydrogel-Bildung, während mPACT weiter auf PsPACT baut und ergänzt die 8 % SDS clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol10. Trennung von Acrylamid und VA-044 Folgeschritt vermeidet die Notwendigkeit zur Entfernung von verbliebenen unpolymerisierten Hydrogel-Monomeren, die das Gewebe, das endgültige Gewebe Integrität gefährden kann umgeben, nach Transparenz mit Pakt zu erreichen; Zusätzlich, reduziert dies den Zeitaufwand für maximale optische Freiraum zu produzieren. Die Zugabe von α-Thioglycerol in der mPACT Methode weiter beschleunigt die Lichtung13, zu verarbeiten, wie α-Thioglycerol UN bräunungsgrad Vermittler, die hilft Regionen des Gewebes deutlich, die weniger zugänglich sind nur die Reagenzien in der Originalmethode Pakt mit 7 , 8 , 9.
Ein Vergleich der Pakt, PsPACT und mPACT auf Nagetier Gewebe nachgewiesen, dass während PsPACT optischen Transparenz bezogen auf das ursprüngliche Pakt-Protokoll verbessert, mPACT am effizientesten für das Clearing und die anschließende hochauflösende Bildgebung sowohl ganze ermöglicht Säugetier-Organe und geschnittenen Scheiben, wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4dargestellt. Die α-Thioglycerol-basierte Lipid Auswaschung der verarbeiteten Orgeln in der mPACT Methode erwies sich Schlüssel für die Unterschiede in der Transparenz, Effizienz und Gewebe Stabilität im Vergleich zu den anderen zwei Clearing-Methoden. Dies ermöglichte die schnelle 3D Analyse der verarbeiteten Organe, insbesondere im Hinblick auf Blut Gefäßsystem Morphologie, über Immunfluoreszenz und konfokalen Mikroskopie (Abbildung 5E).
Während die Zugabe von α-Thioglycerol, SDS-basierte Clearing-Lösung zur Beschleunigung der optischen Transparenz kritisch ist, es auch leicht erhöht Gewebe Zerbrechlichkeit und macht es anfälliger für Schäden Nachbearbeitung. Die klare Überlegenheit der mPACT im Hinblick auf seine Effizienz überwiegt diese Einschränkung; Dennoch wird derzeit gearbeitet um sicherzustellen, dass maximale Clearing mit erreicht werden kann minimale bis keine Kosten der Gewebe Integrität.
Somit schaffen unsere Ergebnisse mPACT als eine investigative PowerTool für eine 3D Analyse der funktionellen und anatomischen Merkmale von Säugetieren Organen, einschließlich aber nicht beschränkt auf neuronale Netze, Gefäßsystem Blut und Gewebe-Matrix-Architektur. Nach vorne verschieben, glauben wir, dass mPACT wäre besonders hilfreich bei der Untersuchung von höherer Ordnung biologischen Mechanismen, die dazu, die Pathophysiologie der Erkrankung, wie Gewebeverletzungen, Entwicklungsstörungen Fehlbildungen, Krebs und neurodegenerativen beitragen Krankheit,14,15,16,17. Kombiniert mit einer Studie über die feiner zellulären Mechanismen Krankheit beteiligt, hat mPACT das Potenzial, eine vollständigere, Multi-Skalen, die verstehen, wie die verschiedenen disparaten Krankheit Mechanismen interagieren, um zu den beobachteten Phänotyp führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
