Summary
Hier presenteren we twee nieuwe methodologieën, psPACT en mPACT, voor het bereiken van maximale optische transparantie en latere microscopische analyse van weefsel therapieën in het intact knaagdier hele CNS.
Abstract
Sinds de ontwikkeling van duidelijkheid, een bioelectrochemical clearing techniek die het mogelijk maakt voor toewijzing van de driedimensionale fenotype binnen transparante weefsels, een veelheid van nieuwe clearing methodologieën, met inbegrip van CUBIC (de weergave van de duidelijke, unobstructed hersenen cocktails en computationele analyse), schakelaar (systeembrede controle van interactie tijd) en kinetiek van chemische stoffen, kaart (vergrote analyse van het proteoom), PACT (passieve duidelijkheid techniek), zijn opgezet en verder uit te breiden de bestaande toolkit voor de microscopische analyse van biologische weefsels. De huidige studie is gericht op het verbeteren en optimaliseren van de oorspronkelijke PACT procedure voor een matrix van intact knaagdier weefsel, met inbegrip van de hele centrale zenuwstelsel (CNS), de nieren, de milt, en de hele muis embryo's. PsPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT) genoemd, dienen deze nieuwe technieken als zeer doeltreffend middel om mapping cel circuits en visualiseren van subcellular structuren in intact normale en pathologische weefsels. In het volgende protocol bieden wij een gedetailleerde, stapsgewijze overzicht over het bereiken van maximale weefsel goedkeuring met minimale invasie van hun structurele integriteit via psPACT en mPACT.
Introduction
Een fundamentele doelstelling van wetenschappelijke en klinische onderzoek omvat het bereiken van een volledig inzicht in de structuur van het orgel en functie; echter dient de buitengewoon complexe aard van zoogdieren organen vaak als een barrière voor het volledig bereiken van deze doelstelling1. DUIDELIJKHEID (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist rigide Imaging-compatibele Tisssue-hYdrogel)2,3,4, waarbij de opbouw van een hybride acrylamide gebaseerde hydrogel uit intact weefsels, behaalt optische Goedkeuringvande allerlei organen, met inbegrip van de hersenen, lever en milt, met behoud van hun structurele integriteit5. DUIDELIJKHEID heeft dus niet alleen de visualisatie, maar ook de mogelijkheid om complexe cellulaire netwerken en weefsel morphologies zonder de noodzaak voor afdelen fijn te ontleden.
Met het oog op goedkeuring van het weefsel, hanteert duidelijkheid elektroforetische methodes te verwijderen van het vetgehalte van het monster bij de hand. Terwijl duidelijkheid is opgemerkt voor de productie van fysiek stabiele weefsel-hydrogel hybriden, studies hebben aangetoond dat het gebruik van elektroforetische weefsel clearing (ETC) methoden variabele resultaten in termen van kwaliteit van weefsel levert, met inbegrip van bruinen, epitoop schade, en eiwit verlies5,6. Om deze kwesties te behandelen, geweest gewijzigde protocollen zoals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarbij de enz behandeling wordt vervangen door een passieve, Ionische-wasmiddel op basis delipidation-techniek, ontwikkelde7,8,9. Ondanks het bereiken van een grotere samenhang van resultaten, vereist PACT echter meer tijd om te verkrijgen maximale klaring. Bovendien, geen van deze technieken hebben nog zijn toegepast bij het hele CNS-formulier of in grotere modellen, knaagdieren zoals ratten en cavia's.
De huidige studie tracht te stellen deze beperkingen door het voorstellen van nieuwe methodologieën, psPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT), ter vergemakkelijking van de snelle goedkeuring van het hele CNS en inwendige organen in zowel muis en rat modellen10. Specifiek, psPACT verwerkt weefsels in 4% acrylamide en 0,25% VA-044 uitgebracht in twee afzonderlijke stappen tijdens hydrogel vorming; mPACT hoofdzakelijk omvat de dezelfde stappen, maar vormt een aanvulling op de clearing SDS gebaseerde oplossing met 0,5% α-thioglycerol als een belangrijk reagens. Beide technieken benutten de endogene systemische en hersen bloedsomloop systems om aanzienlijk minder tijd nodig voor de productie van optische klaring. Als een bewijs van beginsel tonen wij het gebruik van de confocal microscopie bloedvat patronen in de gewiste weefsels10analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de onderzoeksopzet aan Yonsei University College of Medicine. Alle proefdieren worden opgeofferd overeenkomstig de richtsnoeren van de Commissie van de dierenverzorgers laboratorium aan Yonsei University College of Medicine.
1. bereiding van reagentia
Let op: Paraformaldehyde (PFA), acrylamide en natrium dodecyl sulfaat (SDS) zijn giftig irriterende stoffen en dus moet worden behandeld in een zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE; laboratoriumjas, handschoenen, beschermende brillen).
- 4% acrylamide (A.A) oplossing (A4P0): Voeg toe 20 mL 40% acrylamide oplossing tot 180 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- 0,25% VA-044 oplossing: Voeg toe 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride (VA-044) poeder tot 200 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Terwijl de VA-044-poeder kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen, moet het worden opgeslagen bij 4 ° C op solubilisatie in PBS. Voor de beste resultaten alleen de hoeveelheid oplossing die nodig zijn voor het experiment te bereiden.
- PACT cocktail oplossing: Voeg 10 g van acrylamide tot 225 mL van 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing en pas het volume aan 200 mL met 4% PFA. Toevoegen vóór gebruik, VA-044 poeder 100 mg tot 40 mL van het mengsel in een conische tube van 50 mL.
- PACT oplossing buffer wissen: 40 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) aan 350 mL 0,1 M PBS toevoegen en regel het volume met 0,1 M PBS tot 500 mL. MPACT clearing oplossing, voegt toe 0,5% α-thioglycerol aan het PACT oplossing buffer clearing.
- De muizen gebruikt in deze studie waren 2-week-oude BALB mannelijke muizen; de ratten gebruikt in deze studie werden 2 weken oude mannelijke SD-ratten.
2. narcose en perfusie chirurgie
Let op: PFA acrylamide zijn giftig irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast met passende PPE.
- Anesthetize het dier in een pathogenen vrije kamer met 30 mg/kg zoletil met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 26-gauge naald. Controleren van het dier voor 5-10 min.
- Zodra het dier een chirurgische vliegtuig van de verdoving bereikt, de teen-snuifje reactie-methode te gebruiken om te bepalen van de diepte van de verdoving. Bevestigen van apathie.
Opmerking: De volgende stappen waarbij muis en rat chirurgie volgen een vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt in een eerdere studie11. - Maak een incisie van 5-6 cm onder de ribbenkast, door middel van de omhulling en de buikwand.
- Gebogen, botte schaar gebruik te maken van een sneetje in het middenrif, Palperende het thoracale gebied om te zoeken op de site van incisie vooraf.
- De incisie uitbreidt tot de hele lengte van de ribbenkast bloot van de pleura holte.
- Zorgvuldig verdringen de longen. Het maken van een cut door middel van de ribbenkast tot het sleutelbeen. Met behulp van iris schaar, maken een kleine snede aan de achterste einde van het linkerventrikel. Een 18-gauge bot - of olijf-tipped perfusie naald invoegen door de oplopende aorta, passeren de gesneden ventrikel.
- Beveilig de naald en voorkomen lekkage door klemmen van het hart met een hemostat. U kunt een gemodificeerde hemostat klem de aorta rond de naald-tip.
- Maak een grote incisie in de juiste atrium, verzorgen om minimale schade aan de aflopende aorta. De rat is nu klaar voor perfusie.
3. hele perfusie en dissectie van de Rat
Let op: PFA acrylamide zijn giftig irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast met passende PPE.
Opmerking: De volgende stappen van de hele perfusie zijn een vergelijkbaar met een protocol dat wordt gebruikt in een eerdere studie door Woo et al.. (2016) 10 , 11.
- Het recht atrium van hart aan een 18-gauge-naald, verzorgen om eventuele luchtbellen niet koppelen.
- Met een 50 mL injectiespuit, snel en gelijkmatig pomp 50 mL koude 0,1 M PBS oplossing met heparine (10 eenheden/mL).
- De 18-gauge naald verbinden met de buis van de peristaltische pomp.
- Wassen met 200 mL koud 0,1 M PBS oplossing met heparine (10 eenheden/mL) met een omloopsnelheid van 10 mL/min.
- Fix met 250 mL koude 4% PFA-oplossing met een omloopsnelheid van 10 mL/min. De rat moet in dit stadium stijf zijn.
- Verzamelen en opslaan van de resterende PFA-oplossing voor verwijdering.
- Perfuse weefsels met een gekoelde cocktail PACT-oplossing van 4% PFA, 4% acrylamide en 0,25% VA-044 poeder met een 18-gauge naald PACT, en verwijder vervolgens het hoofd en wervelkolom. De schedel bloot doordat een insnijding van de middellijn vanaf de nek tot de neus. Deze extra perfusie stap is niet nodig voor de methoden psPACT en mPACT; na fixatie, onmiddellijk isoleren van het hoofd en wervelkolom en bloot de schedel.
- De basis van de schedel bloot door het verwijderen van alle resterende nek en rug spier.
- Gebruik rongeurs en schaar te schillen weg de schedel. Verwijderen de hersenen en het ruggenmerg.
- Opslaan van het weefsel in 4% PFA bij 4 ° C; weefsels kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week.
4. Hydrogel monomeer infusie en polymerisatie van de Rat en muis CNS
Let op: Acrylamide SDS, α-thioglycerol en de PFA zijn irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast en met passende plassen.
-
PACT (Passive Clearing techniek)
- Isoleren en cultuur het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) uit vaste muizen en ratten aan een tube van 50 mL met een gekoelde cocktail PACT-oplossing van 4% PFA, 4% acrylamide, en 0,25% VA-044 poeder en bewaren bij 4 ° C voor 24 h. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de s olution.
- Insluiten van het monster in stikstofgas voor 10 min met behulp van een tissue gel hybridisatie systeem verbonden met een stikstof tank: Stel het systeem in op 37 ° C. Weefsels overbrengen in een tube van 50 mL met verse koud (4 ° C) PACT cocktail oplossing en sluit met buis GLB, dan zet het vacuüm.
- Om het polymeriseren de hydrogel, plaatst u de buis met het monster in een schudden incubator (150 rpm, 37 ° C) gedurende 3 uur, of totdat de polymerisatie voltooid is.
- Met behulp van Vloeipapier (Zie Tabel of Materials), verwijder het resterende gepolymeriseerde hydrogel omringende weefsels.
- Het weefsel overbrengen in een tube van 50 mL met clearing oplossing (8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0).
- Leg het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 20 dagen voor de muis CNS om volledige duidelijkheid.
-
psPACT (verwerken aparte passieve Clearing-techniek)
- Isoleren van het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) met een bot mes en schaar van PFA-vaste muizen en ratten op een schone bankje.
- Overdracht van weefsels voor een tube van 50 mL met 4% PFA, en bewaren bij 4 ° C voor 24 h. zorgen ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in het fixeer.
- Wassen van het vast weefsel voor 1 h in 0,1 M PBS en vervolgens overbrengen naar A4P0 oplossing (4% acrylamide in 0,1 M PBS). Winkel bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Het weefsel gedurende 5 minuten wassen in 0,1 M PBS.
- Dompel het weefsel in 0,25% VA-044 in 0,1 M PBS. Opslaan bij 37 ° C gedurende 6-24 h, en vervolgens overbrengen naar verse 0,25% VA-044/PBS oplossing.
- Insluiten van het monster in stikstofgas voor 10 min met behulp van een tissue gel hybridisatie systeem (Zie Tabel van materialen) aangesloten op een stikstof tank: weefsels overbrengen in een tube van 50 mL verse koud (4 ° C) met 0,25% VA-044/PBS-oplossing, en verbinden met buis GLB. Schakel in het vacuüm.
- Overbrengen in het weefsel oplossing (8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0) wissen.
- Incubeer het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 17 dagen voor muis CNS om volledige duidelijkheid.
-
mPACT (gemodificeerde passieve Clearing techniek)
- Isoleren van het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) met een bot mes en schaar van PFA-vaste muizen en ratten op een schone bankje.
- Stappen 4.2.2 - 4.2.8 van het psPACT-protocol.
- Overbrengen in het weefsel clearing oplossing. Merk op dat in tegenstelling tot het PACT en psPACT protocollen, mPACT vereist een clearing-oplossing bestaande uit 0,5% α-thioglycerol naast 8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0. Α-thioglycerol is een door de VN browning agent waarmee sprake is van een weefsel duidelijk meer snel en effectief. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de oplossing.
- Leg het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 2 weken voor muis CNS om volledige duidelijkheid.
5. brekingsindex Matching en immunokleuring van gewiste CNS
Opmerking: nvelgen (Nycodenz gebaseerde Refractive Index Matching oplossing) bestaat uit 0,8 g/mL Nycodenz poeder opgelost in 30 mL base buffer (0,01% natriumazide en Tween-20 in 0,1 M PBS, pH 8,0). Het wordt aanbevolen dat de oplossing is geplaatst in een 37 ° C incubator te voorzien van de juiste Solvatatie van het poeder te schudden.
- Incubeer weefsels in 0,1% Triton X-100 in 0,1 M PBS voor 2 h, dan blokkeren met 2% bovien serumalbumine (BSA) in 0,1 M PBS voor 6 uur.
- Secties in PBST driemaal wassen (0,1% Tween-20 in 0,1 M PBS) voor 2 h. Stain secties met primaire antilichamen (in dit geval, een antilichaam voor anti-konijn-PECAM-CD31, die vlekken bloedvaten) voor 2 dagen.
- Vlek secties met secundaire antilichamen (in dit geval een geit anti-konijn IgG Cy3 fluorescerende geconjugeerde) in 2% BSA voor 2 dagen.
- Wash label weefsels driemaal in PBST gedurende 2 uur, en op te slaan in 15 mL nvelgen voor 2-10 dagen.
- Voor imaging, door gelabelde weefsels naar een kleine hoeveelheid nvelgen op 35 - of 60-mm weefselkweek gerechten te verplaatsen. Fix met siliconen rond de onderkant van de schotel.
- Voeg 1,5-2 mL verse nvelgen.
6. de beeldverwerking
- Verwerven van beelden van gewiste weefsels met tegel scannen met behulp van een confocale laser scanning microscopewith 10 x vergroting (Zie Tabel van materialen). Gebruik voor Cy3-geëtiketteerden weefsel, golflengten van 550-600 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van een transparant model voor de hele CNS met behulp van geoptimaliseerde passieve clearing technieken
Optische Goedkeuringvande muis en rat hele CNS weefsels snel tot stand gekomen met behulp van diverse technieken van de passieve clearing (Figuur 1). Een schematische voorstelling van weefsel wissen na verloop van tijd wordt weergegeven in figuur 2A. In tegenstelling tot de oorspronkelijke PACT-methode gaat psPACT (proces-aparte PACT) behandelen van monsters met 4% acrylamide (A4P0) en 0,25% VA-044 initiatiefnemer oplossing in twee afzonderlijke stappen om te vormen van de hydrogel hybrid. mPACT (gemodificeerde PACT) verbetert verder psPACT door aanvulling van de 8% SDS clearing oplossing met 0,5% α-thioglycerol. Monsters verwerkt via PACT, psPACT en mPACT op dag 14 worden vergeleken en in figuur 2Bgepresenteerd.
In een eerdere studie, we gemeld dat, terwijl het oorspronkelijke PACT protocol optische mijnen in 23 dagen, psPACT bereikt en mPACT de hele muis CNS net 20 en 14 dagen, respectievelijk10 gewist. In de huidige studie, toen we getrakteerd muis hersenen monsters via het protocol mPACT, vonden we dat ze optische transparantie na 14 dagen (figuur 2B bereikt). Rat hele CNS monsters verwerkt via psPACT en mPACT toonde ook aan dat mPACT bereikt maximale clearance met de grootste efficiëntie, zoals weefsels zijn gewist in 30 en 20 dagen, respectievelijk (figuur 3A, B). Volwassen rat hersenen alleen, in tegenstelling tot de gehele CNS, zijn gewist met mPACT in slechts 5 dagen (figuur 4A). Bloedvat patronen van gewiste rat hersenen werden geanalyseerd via immunofluorescentie na psPACT en mPACT verwerking om aan te tonen het nut van deze procedures van de clearing voor de anatomische en functionele analyse van de hersenen (figuur 4B, mPACT gegevens afgebeeld in Woo et al. 2016)10.
Met behulp van deze passieve weefsel protocollen clearing geoptimaliseerd, we waren in staat om te visualiseren intact, transparante modellen van de hele CNS, hoewel de clearing times verschilden tussen de drie protocollen. Geoptimaliseerde passief clearing methoden bereikt orgel duidelijkheid in een kortere lengte van tijd. Samen genomen, suggereren deze resultaten dat de mPACT clearing methode duidelijk CNS meer stabiel en snel dan de vorige passieve methoden clearing kan genereren. Dus, mPACT houdt groot potentieel voor gebruik in de toekomst structurele en anatomische analyses van zoogdieren organen en biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van bestaande methoden in termen van zowel de werkzaamheid en de veiligheid.
Generatie van optisch gewiste inwendige organen en embryo's met behulp van mPACT
Naast de hele CNS weefsels, de volwassen ratten milt en nieren zijn gewist met mPACT in 19 en 23 dagen, respectievelijk (figuur 5AB). Muis embryo's op E10.5 en E13.5 zijn ook na 3 dagen van de verwerking via het protocol mPACT gewist. Figuur 5C -E toont de visualisatie van bloedvat patronen in het hele embryo, evenals de microvasculature van de regio van de staart van het embryo van de muis, rat cauda paarden en de milt van de rat. Deze resultaten suggereren dat mPACT kan worden gebruikt voor het genereren van transparante modellen van een breed scala van weefsels en organen voor 3D anatomische analyse.
Figuur 1: schematische weergave van geoptimaliseerde passieve clearing technieken (PACT). Naast de reagentia die nodig zijn voor elke stap vindt u een overzicht van de afzonderlijke stappen in elk van de drie protocollen van het PACT. Het oorspronkelijke PACT protocol is weefsel polymerisatie van hydrogel formatie met een koude mengsel van 4% PFA, 4% Acrylamide (A.A) oplossing en 0,25% VA-044 initiatiefnemer oplossing. Nadat weefsel is polymeervorm met behulp van stikstofgas, is het passief gewist met 8% SDS clearing oplossing. De psPACT (proces-aparte PACT) maakt gebruik van aparte behandelingsprocessen van A.A oplossing van 4% en 0,25% VA-044 initiatiefnemer oplossing voor de hydrogel-vorming van het weefsel; deze voorwaarden afwijken van de oorspronkelijke PACT-protocol. De mPACT (gemodificeerde PACT) extra wordt 0,5% α-thioglycerol toegevoegd aan de 8% SDS clearing oplossing van het psPACT-protocol. Voor alle drie protocollen, de intact weefsels worden geïncubeerd bij > = 37 ° C in een broedstoof schudden tot maximale klaring iss bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: optische transparantie van muis hele centrale zenuwstelsel (CNS) door passieve weefsel clearing. (A) Schematization van hele CNS weefsel wissen via PACT gebaseerde methoden na verloop van tijd. (B) de vergelijking van de drie protocollen van de passieve clearing (oorspronkelijke PACT, psPACT, mPACT) in de hele CNS muis na 14 dagen na verwerking. (C) optische Goedkeuringvande de hersenen van de muis onderworpen aan mPACT verwerken meer dan 14 dagen. Dit cijfer is gewijzigd van Woo et al. 201610. De letters in 2C zijn 3 mm groot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: optische transparantie van rat hele CNS weefsels post-psPACT en mPACT. (A) volwassen rat hele CNS weefsel bereikt maximale optische goedkeuring met psPACT na 30 dagen. (B) volwassen rat hele CNS weefsel bereikt maximale optische goedkeuring met mPACT na 20 dagen. De voor en na de diagrammen geven aan de grootte van de hele CNS vóór en na de behandeling, zoals gemeten met het blote oog. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: mPACT verwerking en microvasculature visualisatie van verdeelde volwassen rat hersenen. (A) vergelijking van 4-mm dikke volwassen rat hersenen afdelingen na mPACT verwerking op 3 en 5 dagen. (B) 3D projectie van bloedvat patronen in de hersenen van de volwassen ratten gevisualiseerd met anti-CD31 antistof na verwerking van de psPACT. Schaal bars, 1.500 µm en 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Woo et al. 201610. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: mPACT verwerking van knaagdier organen en embryo's die hele muis. mPACT bereikt optische transparantie in de milt van volwassen ratten (A) en (B) nier in 19 en 23 dagen, respectievelijk. (C) mPACT geproduceerd muis embryo's van transparante E10.5 en E13.5 na 3 dagen. (D) visualisatie van microvasculature met anti-CD31 in de regio van de staart van de muis embryo na verrekening met mPACT. (E) 3D projectie van therapieën in de rat cauda paarden en (F) rat milt met anti-CD31, na verwerking via mPACT. Dit cijfer is gewijzigd van Woo et al. 201610. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de passieve, niet-elektroforetische extractiemethoden werkzaam verbeterd PACT aanzienlijk de consistentie bereikt met vorige weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid2,,3,,4,7 , 8, de techniek draagt nog steeds een aantal tekortkomingen, de meest urgente van die de lengte van de benodigde tijd is voor het bereiken van maximale weefsel duidelijkheid12. In de huidige studie presenteren we gemodificeerde PACT protocollen die aanzienlijk minder tijd nodig voor weefsel wissen terwijl nog het bewaren van weefsel integriteit en structuur6,10. Bovendien voor de eerste keer tonen we de toepassing van het weefsel protocollen in hele CNS weefsels en in een hogere-orde knaagdieren model, de rat10wissen.
Specifiek, impliceert psPACT monster verwerking in 4% acrylamide en 0,25% VA-044 uitgebracht in twee afzonderlijke stappen tijdens de vorming van de hydrogel, terwijl mPACT verder bouwt op psPACT voort en vormt een aanvulling op de 8% SDS oplossing met 0,5% α-thioglycerol10te wissen. Scheiding van de acrylamide en latere VA-044 stap vermijdt de noodzaak voor het verwijderen van de resterende Ongepolymeriseerd hydrogel monomeren die het weefsel, waardoor omringen na het bereiken van transparantie met PACT; uiteindelijke weefsel integriteit in gevaar kan komen Bovendien, vermindert dit de tijd die nodig is voor de productie van maximale optische klaring. De toevoeging van α-thioglycerol in de mPACT methode verder versnelt de clearing13, verwerken als α-thioglycerol een door de VN browning agent die helpt bij het wissen van de regio's van het weefsel die minder toegankelijk zijn is met behulp van alleen de reagentia in de oorspronkelijke PACT-methode 7 , 8 , 9.
Een vergelijking van PACT, psPACT en mPACT op knaagdieren weefsel aangetoond dat terwijl psPACT optische transparantie ten opzichte van de oorspronkelijke PACT protocol verbetert, mPACT efficiëntst voor de clearing en latere high-resolution beeldvorming van beide geheel laat zoogdieren organen en verdeelde segmenten, zoals aangetoond in Figuur 2, , Figuur 3, Figuur 4. De α-thioglycerol-gebaseerde lipide wegspoeling van verwerkte organen in de mPACT methode gebleken om de verschillen in transparantie, efficiëntie en weefsel stabiliteit in vergelijking met de andere twee clearing-methoden. Hierdoor konden voor de snelle 3D analyse van verwerkte organen, specifiek met betrekking tot bloed therapieën morfologie, via immunofluorescentie en confocale microscopie (figuur 5DE).
Terwijl de toevoeging van α-thioglycerol aan de clearing SDS gebaseerde oplossing is van cruciaal belang om optische transparantie te versnellen, het ook iets verhoogt weefsel kwetsbaarheid en maakt het meer gevoelig voor beschadiging van nabewerking. De duidelijke superioriteit van mPACT met betrekking tot de doeltreffendheid ervan groter dan deze beperking; Niettemin wordt momenteel gewerkt om ervoor te zorgen dat de maximale clearing kan worden bereikt met minimale tot geen last van weefsel integriteit.
Dus, stellen onze resultaten mPACT als een krachtige onderzoeksinstrument is voor het verstrekken van een 3D analyse van de functionele en anatomische kenmerken van zoogdieren organen, met inbegrip van maar niet beperkt tot de neuronale netwerken, bloed therapieën en weefsel matrix architectuur. Vooruit, we geloven mPACT zou vooral nuttig zijn bij het onderzoek naar biologische mechanismen hogere-orde die aan de pathofysiologie van de ziekte, zoals weefsel schade, developmental misvormingen, kanker en neurodegeneratieve bijdragen ziekte14,15,16,17. Gecombineerd met een studie van de fijnere cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij ziekte, heeft mPACT het potentieel om een meer volledige, Multi-Scale begrip van hoe verschillende uiteenlopende ziekte mechanismen samen aanleiding geven tot het waargenomen fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de hersenen Korea 21 PLUS Project voor de medische wetenschap, Yonsei Universiteit. Dit werk werd bovendien gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
