Summary
Здесь мы представляем два новых методологий, psPACT и ударным, для достижения максимальной оптической прозрачности и последующего анализа микроскопических сосудистую ткани в нетронутыми грызун весь ЦНС.
Abstract
С момента разработки ЯСНОСТИ биоэлектрохимическим, очистка техника, что позволяет для трехмерных фенотип картирования в прозрачной ткани, множество Роман очистки методологий, включая КУБИЧЕСКИЙ (ясно, беспрепятственный мозга томография коктейли и Вычислительный анализ), выключатель (общесистемного управления взаимодействия времени) и кинетики химических веществ, карта (увеличенное анализ протеома) и Пакт (пассивный ясности техника), были созданы для дальнейшего расширения существующего инструментария для микроскопический анализ биологических тканей. В настоящем исследовании стремится улучшить и оптимизировать с первоначальной процедурой Пакт для массива нетронутыми грызунов тканей, в том числе всей центральной нервной системы (ЦНС), почки, селезенка и весь мыши эмбрионов. Назвать psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), эти новые методы обеспечивают весьма эффективным средством сопоставления схемы ячейки и визуализации внутриклеточных структур в нетронутыми нормальных и патологических тканей. В следующий протокол мы предоставляем подробный, шаг за шагом план о том, как добиться максимальной ткани Распродажа с минимальным вторжением в их структурной целостности через psPACT и ударным.
Introduction
Основная цель научных и клинических исследования предполагает достижение полного понимания структуры органа и функции; Тем не менее чрезвычайно сложный характер млекопитающих органов часто служит барьером для полного достижения этой цели1. ЯСНОСТЬ (ясно липидный обмен гибридизированных акриламида жесткой изображений совместимых Tisssue Гидрогель)2,3,4, который включает в себя построение гибридных гидрогеля на основе акриламида с неповрежденными тканями, достигает оптическое оформление различных органов, в том числе мозга, печени и селезенки, при сохранении их структурной целостности5. Таким образом, ясность позволило не только визуализации, но и возможность тонко анализировать сложные сотовой сети и морфологии тканей без необходимости для разрезания.
Чтобы добиться Распродажа тканей, ЯСНОСТИ использует электрофоретические методы, чтобы удалить содержание липидов образца под рукой. Хотя ЯСНОСТИ было отмечено для производства физически стабильной ткани гидрогеля гибриды, исследования показали, что его использование методов очистки (ETC) электрофоретической ткани дает разные результаты с точки зрения качества ткани, в том числе Браунинг, epitope ущерб, и протеин потери5,6. Для решения этих вопросов, модифицированных протоколы, такие как Пакт (пассивный ясности техника), который заменяет и т.д. лечение с пассивным, ионных моющих средств на основе delipidation техникой, были развитых7,8,9. Однако, несмотря на достижение большей согласованности результатов, Пакт требует больше времени, чтобы получить максимальный зазор. Кроме того ни один из этих методов еще не были применены к всей форме ЦНС, или в больших грызунов модели, такие как крысы и морских свинок.
Настоящее исследование стремится решить эти ограничения, предлагая новые методологии, psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), для облегчения быстрого разминирования всей ЦНС и внутренних органов в мышь и крыса модели10. В частности, psPACT процессов тканей в 4% акриламида и 0,25% VA-044 в два отдельных этапа во время Гидрогель образования; ударным по существу включает в себя те же шаги, но добавки на основе SDS очистки решение с 0,5% α-thioglycerol как ключевых реагента. Обе методики освоения эндогенного системных цереброспинальный сердечно-сосудистой системы и значительно сократить время, необходимое для производства оптических распродажа. Как доказательство принципа мы продемонстрировать использование confocal микроскопии для анализа закономерностей кровеносный сосуд в очищенной тканей10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитет по этике соответствующих исследований в колледже медицины Университета Йонсей. В соответствии с руководящими принципами лабораторных животных ухода Комитета в колледж медицины Университета Йонсей приносятся в жертву всех подопытных животных.
1. Подготовка реагентов
Предупреждение: Параформальдегида (PFA), акриламида и натрия Додециловый сульфат (SDS) токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; лаборатории пальто, перчатки, защитные очки).
- 4% раствор акриламида (а.а.) (A4P0): добавить 20 мл 40% акриламида раствора 180 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS).
- 0,25% раствор VA-044: добавить 0,5 г 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] порошок дигидрохлорид (VA-044) 200 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS). В то время как VA-044 порошок может храниться при комнатной температуре, он должен храниться при температуре 4 ° C на солюбилизация в PBS. Для достижения наилучших результатов Подготовьте только количество раствора, необходимых для проведения эксперимента.
- Пакт коктейль решение: добавить 10 g акриламида в 225 мл 4% раствора параформальдегида (PFA) и отрегулируйте громкость до 200 мл с 4% PFA. Перед использованием добавьте 100 мг порошка VA-044 в 40 мл смеси в 50 мл Конические трубки.
- Пакт, очистка буфера решение: добавить 40 г додецилового сульфата натрия (SDS) до 350 мл 0,1 М PBS и отрегулировать громкость до 500 мл с PBS 0,1 М. Для ударным Очистить решение добавьте 0,5% α-thioglycerol Пакт, очистка буфера решения.
- Мышей, используемые в данном исследовании были 2-недельных самцов мышей BALB; 2 неделя старый SD-самцах крыс, используемые в данном исследовании.
2. анестезии и операции перфузии
Предупреждение: PFA акриламида токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующим СИЗ.
- Анестезировать животное в комнате бесплатно возбудителя с 30 мг/кг zoletil с помощью 1 мл шприца с иглой 26-го калибра. Контролировать животное для 5-10 мин.
- Как только животное достиг хирургические плоскости анестезии, используйте метод мыс щепотка ответ для определения глубины анестезии. Подтвердите зависания.
Примечание: Следующие шаги с участием мыши и крысы хирургии следовать подобный протокол, используемый в предыдущем исследовании11. - Сделайте 5-6 см разрез под грудной клетки, через кожный покров и брюшной стенки.
- Используйте изогнутые, тупыми ножницами сделать разрез в диафрагмы, пальпируя грудной области, чтобы найти сайт разрез заранее.
- Расширить разрез по всей протяженности грудной клетки подвергать плевральной полости.
- Тщательно вытесняют легких. Сделайте надрез через грудной клетки до ключицы. С помощью ножниц Ирис, сделать небольшой надрез до конца заднего левого желудочка. Вставьте иглы 18-калибровочного накренилась тупой или оливкового перфузии в восходящей части аорты, проходя через вырежьте желудочка.
- Безопасности иглы и предотвращения утечки, сердце с кровоостанавливающий зажим. Кроме того с помощью модифицированных кровоостанавливающий зажим аорты вокруг кончик иглы.
- Сделайте большой разрез в правое предсердие, заботясь, чтобы обеспечить минимальное повреждение к нисходящей аорты. Крыса теперь готов для перфузии.
3. весь перфузии и рассечение крыса
Предупреждение: PFA акриламида токсичных раздражителей и таким образом должны обрабатываться в Зонта с соответствующим СИЗ.
Примечание: Следующие шаги весь перфузии похожи на протокол, используемый в предыдущем исследовании, Ву и др. (2016) 10 , 11.
- Прикрепите правого предсердия сердца к 18-иглы, заботясь, чтобы не вводить каких-либо воздушных пузырьков.
- С помощью 50 мл шприца, быстро и равномерно насос 50 мл холодного раствора 0,1 М PBS, содержащих гепарин (10 единиц/мл).
- 18-иглы соединить трубки перистальтического насоса.
- Вымойте с 200 мл холодного раствора 0,1 М PBS, содержащих гепарин (10 единиц/мл) со скоростью обращения 10 мл/мин.
- Fix с 250 мл холодного PFA 4% раствора со скоростью обращения 10 мл/мин. На данном этапе должно быть жесткой крыса.
- Собирать и хранить остальные PFA решение для удаления.
- Для Пакта perfuse ткани с охлажденной Пакт коктейль раствор 4% PFA, 4% акриламида и 0,25% VA-044 порошок с 18-калибровочного иглой, а затем удалить головы и позвоночника. Разоблачить черепа, сделав срединной линии разреза от шеи к носу. Этот шаг дополнительные перфузии является ненужным для методов psPACT и mPACT; После фиксации немедленно изолировать головы и позвоночника и разоблачить черепа.
- Разоблачить основания черепа, удалив любые остаточные шеи и мышцы позвоночника.
- Использование rongeurs и ножницы, чтобы очистить от черепа. Удаление головного и спинного мозга.
- Магазин ткани в 4% PFA при температуре 4 ° C; тканей может храниться до 1 недели.
4. гидрогеля мономера инфузии и полимеризации крысы и мыши ЦНС
Предупреждение: Акриламида, SDS, α-thioglycerol и ПФА являются раздражителями и таким образом должны обрабатываться в вытяжного шкафа и с соответствующим Пи.
-
Пакт (пассивный очистка техника)
- Изолировать и культуры всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) от фиксированной мышей и крыс в Тюбик 50 мл, содержащие охлажденные Пакт коктейль раствор 4% PFA, 4% акриламида и 0,25% VA-044 порошок и хранить при 4 ° C в течение 24 ч. Убедитесь, что ткань полностью погружен в s резолюции.
- Вставлять образец в газ азот, за 10 мин, с использованием ткани гель гибридизации системы подключен к резервуару азота: установить систему до 37 ° C. Передача тканей на тюбик 50 мл, содержащие свежей холодной (4 ° C) Пакт коктейль решения и соединиться с трубы колпачок, затем включите пылесос.
- Для полимеризации гидрогеля, место трубка, содержащая образец в тряску инкубатора (150 об/мин, 37 ° C) 3 часа, или до завершения полимеризации.
- С помощью промокательную бумагу (см. Таблицу материалы), удалить оставшиеся полимеризованной гидрогеля, окружающие ткани.
- Передать ткани Тюбик 50 мл, содержащие очистки раствора (8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8,0).
- Поместите образец в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем она занимает около 20 дней для мыши ЦНС добиться полной ясности.
-
psPACT (обрабатывать отдельные пассивной очистки техника)
- Изолируйте всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) с ножницы из PFA-Исправлена мышей и крыс на лавочке чистой и кости резец.
- Передача тканей чтобы Тюбик 50 мл, содержащих 4% PFA и хранить при 4 ° C в течение 24 ч. Убедитесь, что ткань полностью погружен в фиксатор.
- Вымойте фиксированной ткани на 1 ч в 0,1 М PBS и затем передать A4P0 решение (4% акриламида в PBS 0,1 М). Хранить при 37 ° C в течение 24 ч.
- Стирать ткани на 5 мин в 0,1 М PBS.
- Погружать ткани в 0,25% VA-044 в 0,1 М PBS. Хранить при 37 ° C в течение 6-24 часа и затем перенести на свежий раствор 0,25% VA-044/PBS.
- Вставлять образец в газ азот, за 10 мин, с использованием ткани гель гибридизации системы (см. Таблицу материалы) связано с баком азота: передачи тканей Тюбик 50 мл, содержащие свежей холодной (4 ° C) 0,25% раствор VA-044/PBS и соединиться с трубки Кап. Включите пылесос.
- Передача ткань для очистки раствора (8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8,0).
- Инкубируйте образца в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем это занимает около 17 дней для мыши ЦНС добиться полной ясности.
-
ударным (изменение пассивный очистка техника)
- Изолируйте всей центральной нервной системы (головного и спинного мозга) с ножницы из PFA-Исправлена мышей и крыс на лавочке чистой и кости резец.
- Выполните шаги 4.2.2 - 4.2.8 psPACT протокола.
- Передача ткань для очистки решения. Обратите внимание, что в отличие от протоколов Пакта и psPACT, ударным требует очистки раствор, состоящий из 0,5% α-thioglycerol в дополнение к 8% SDS в 0,1 М PBS, рН 8.0. Α-thioglycerol — это ООН подрумянивания агент, который помогает очистить ткани более быстро и эффективно. Убедитесь, что ткань полностью погружен в раствор.
- Поместите образец в тряску инкубатора, равным 37 ° C и 150 об/мин, до тех пор, пока ткань была очищена. В среднем это занимает около 2 недель для мыши ЦНС добиться полной ясности.
5. показатель преломления соответствия и иммуноокрашивания очищается ЦНС
Примечание: nколеса (Nycodenz-решение на основе преломления соответствия) состоит из 0,8 г/мл Nycodenz порошок растворяют в 30 мл базового буфера (0.01% азид натрия и Tween-20 в 0,1 М PBS, рН 8,0). Рекомендуется, что решение помещается в 37 ° C, пожимая инкубатор для надлежащего сольватации порошка.
- Инкубировать тканей в 0,1% тритон X-100 в 0,1 М PBS за 2 ч, затем блок с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М PBS на 6 ч.
- Вымойте секции три раза в PBST (0.1% Tween-20 в PBS 0,1 М) за 2 ч. пятно секции с первичных антител (в данном случае, PECAM-CD31 антитела анти кролика, который пятна кровеносных сосудов) за 2 дня.
- Пятно секции с вторичные антитела в 2% BSA (в данном случае, коза анти кролик IgG Cy3 флуоресцентные конъюгат) за 2 дня.
- Мыть помечены тканей три раза в PBST 2 h и магазин в 15 мл колеса n2-10 дней.
- До изображения, переместите Приклеенные этикетку ткани небольшое количество nколеса на 35 - мм и 60-мм культуры ткани блюда. Прикрепите с помощью силикона вокруг нижнего края блюдо.
- Добавьте 1,5-2 мл свежего nколеса.
6. обработка изображений
- Получение изображений очищается тканей с плитки сканирование с помощью конфокальное лазерное сканирование microscopewith 10-кратном (см. Таблицу материалы). Для Cy3-меченых ткани, используйте волны 550-600 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание прозрачной модели всей центральной нервной системы с использованием методов оптимизации пассивной очистки
Оптическая Распродажа тканей крыс и мышей весь ЦНС быстро было достигнуто с помощью различных методов пассивной очистки (рис. 1). Схематическое изображение ткани, сняв с течением времени показан на рисунке 2A. В отличие от оригинального метода Пакт psPACT (процесс отделите пакт) предполагает обращение образцы с 4% акриламида (A4P0) и 0,25% раствор инициатор VA-044 в два отдельных этапа сформировать гибрид гидрогеля. ударным (изменение пакт) далее улучшает psPACT, дополняющего 8% SDS, очистка раствора с 0,5% α-thioglycerol. Образцы обработки через Пакт, psPACT и ударным на 14 день сопоставляются и представлены на рисунке 2B.
В предыдущем исследовании мы сообщили, что в то время как оригинальный протокол Пакт достигнуто оптических Распродажа в 23 дней, psPACT и ударным очистили всю поверхность мыши ЦНС в просто 20 и 14 дней, соответственно,10. В настоящем исследовании когда мы рассматривали образцы мозга мыши через протокол ударным, мы обнаружили, что они достигли оптической прозрачности после 14 дней (Рисунок 2Б). Крыса весь ЦНС образцы обрабатываются через psPACT и ударным также показали что ударным достигнут максимальный зазор с наибольшей эффективностью, как ткани были очищены в 30 и 20 дней, соответственно (рис. 3а, B). Взрослых крыс мозги только, в отличие от всей центральной нервной системы, были очищены с ударным в всего лишь 5 дней (Рисунок 4A). Кровеносный сосуд узоров очищается крыса мозги были проанализированы через иммунофлюоресценции после обработки ударным продемонстрировать полезность этих процедур очистки для анатомической и функциональной анализ мозга (рис. 4б, ударным данных и psPACT показано в Ву et al. 2016)10.
С помощью этих оптимизированных пассивной ткани, очистка протоколы, мы смогли визуализировать нетронутыми, прозрачной модели всей центральной нервной системы, хотя очистки раз отличается среди трех протоколов. Оптимизированный пассивной очистки методы достичь ясности орган в короткий отрезок времени. Взятые вместе, эти результаты показывают, что ударным, очистка метод может генерировать четкий ЦНС более стабильно и быстро, чем предыдущий пассивной очистки методы. Таким образом ударным имеет большой потенциал для использования в будущем структурных и анатомический анализ млекопитающих органов и обеспечивает значительное преимущество над существующими методами с точки зрения эффективности и безопасности.
Поколение оптически очищается внутренних органов и эмбрионов, с помощью ударным
Помимо всего тканях ЦНС, взрослых крыс селезенки и почки были очищены с ударным в 19 и 23 дней, соответственно (Рисунок 5AB). Эмбрионов мыши на E10.5 и E13.5 также были очищены после 3 дней обработки через протокол ударным. Рисунок 5 c -E показывает визуализацию шаблонов кровеносных сосудов в целом эмбриона, а также microvasculature регионе хвост эмбриона мыши, крысы конского лошадей и крыса селезенки. Эти результаты показывают, что mPACT может использоваться для создания прозрачной модели широкого спектра тканей и органов для 3D анатомические анализа.
Рисунок 1: Схематическое представление методов оптимизации пассивной очистки (Пакт). Наброски отдельных этапов каждого из трех протоколов Пакта приводится наряду с реагентов, необходимых для каждого шага. Оригинальный протокол Пакт является полимеризации ткани от Гидрогель образования с холодной смеси 4% PFA, 4% раствор акриламида (а.а.) и 0,25% раствор инициатор VA-044. После того, как ткани является полимеризуется, используя газ азот, пассивно очищается с 8% SDS, очистка решения. PsPACT (процесс отделите пакт) использует отдельные процессы а.а. раствор 4% и 0,25% раствор инициатор VA-044 гидрогеля формирования тканей; Эти условия отличаются от оригинального протокола Пакт. Ударным (изменение пакт) дополнительные добавляет 0,5% α-thioglycerol 8% SDS, очистка решения psPACT протокола. Для всех трех протоколов, неприкосновенности тканей инкубируют на > = 37 ° C в тряску инкубаторе до максимальной Распродажа МКС достигнута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оптическая прозрачность мыши всей центральной нервной системы (ЦНС) по пассивной ткани очистки. (A) схематизация всей ткани ЦНС, очистка через методы, основанные на Пакт с течением времени. (B) Сравнение трех протоколов пассивной очистки (Оригинальный Пакт, psPACT, mPACT) в целом ЦНС мыши на 14 дней после обработки. (C) оптических Распродажа мозга мыши, подвергается ударным обработки более 14 дней. Этот рисунок был изменен с Ву et al. 201610. Буквы в 2C – 3 мм в высоту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: оптической прозрачности всего ЦНС крыса тканей пост psPACT и ударным. (A) взрослых крыс, всю ЦНС ткани достигнута максимальная оптическая Распродажа с psPACT после 30 дней. (B) взрослых крыс, всю ЦНС ткани достигается максимальный оптический Распродажа с ударным после 20 дней. До и после диаграммы указывают размер всей центральной нервной системы до и после лечения, как измеряется глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ударным обработки и microvasculature визуализации псевдоразреза взрослых крыс мозга. (A) сравнение 4-мм толщиной взрослых крыс мозга разделы после ударным обработки на 3 и 5 дней. (B) 3D проекции моделей кровеносного сосуда в мозге взрослых крыс, визуализируется с анти CD31 антитела после обработки psPACT. Масштаб баров, 1500 мкм и 100 мкм. Этот рисунок был изменен с Ву et al. 201610. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: обработка ударным грызунов органов и весь мыши эмбрионов. ударным достигнуто оптической прозрачности в селезенке взрослых крыс (A) и (B) почек в 19 и 23 дней, соответственно. (C) ударным производства прозрачной E10.5 и E13.5 эмбрионов мыши после 3 дней. (D) визуализация microvasculature с анти CD31 в регионе хвост мыши эмбриона после очистки с ударным. (E) 3D проекции сосудистую крыса конского лошадей и (F) крыса селезенки с анти CD31, после обработки через ударным. Этот рисунок был изменен с Ву et al. 201610. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как пассивной, не электрофоретической извлечения методов, используемых в Пакт значительно улучшить согласованность достигнута с предыдущим ткани, очистка методы, такие как ясность2,3,4,7 , 8, техника все еще имеет несколько недостатков, наиболее актуальных которых является продолжительность времени, необходимого для достижения максимального ткани ясности12. В текущем исследовании мы представляем модифицированных Пакт протоколов, которые значительно сократить время, необходимое для ткани, очистка сохраняя ткани целостность и структура6,10. Кроме того в первый раз, мы демонстрируем применение тканей, очистка протоколы в целом тканях ЦНС и грызунов модель более высокого порядка, крыса10.
В частности, psPACT подразумевает обработку образца в 4% акриламида и 0,25% VA-044 в два отдельных этапа во время Гидрогель образования, в то время как ударным далее основывается на psPACT и дополняет 8% SDS, очистка раствора с 0,5% α-thioglycerol10. Разделение акриламида и последующих VA-044 шаг позволяет избежать необходимости для удаления оставшихся unpolymerized гидрогеля мономеров, которые окружают ткани, которая может поставить под угрозу целостность окончательный ткани после достижения прозрачности с ПАКТОМ; Кроме того это значительно уменьшает время, необходимое для получения максимального оптического распродажа. Добавление α-thioglycerol в методе ударным далее ускоряет очистку процесс13, как α-thioglycerol ООН подрумянивания агент, который помогает очистить регионов ткани, которые являются менее доступными, используя только реагентов в исходном методе пакт 7 , 8 , 9.
Сравнение Пакт, psPACT и ударным на грызунов ткани показали, что хотя psPACT улучшает оптической прозрачности относительно первоначального протокола Пакт, ударным наиболее эффективно позволяет для очищения и последующим разрешением изображений оба состава у млекопитающих органов и секционного фрагментов, как это было продемонстрировано в Рисунок 2, Рисунок 3, на рисунке 4. На основе α-thioglycerol липидов размыва обработанных органов в ударным метод оказался ключом к различия в прозрачность, эффективность и ткани стабильности по сравнению с другими методами два клиринга. Это позволило для быстрого 3D анализа обработанных органов, в частности в том, что касается сосудистую морфология крови, через иммунофлюоресценции и confocal микроскопии (рис. 5 dE).
В то время как добавление α-thioglycerol к решению на основе SDS очистки имеет решающее значение для ускорения оптической прозрачности, он также слегка увеличивает хрупкость ткани и делает его более прочным и удароустойчивым постобработки. Четкого превосходства ударным относительно его эффективности превышает это ограничение; Тем не менее, в настоящее время ведется работа для достижения максимальной очистки с минимальными на счет не целостности тканей.
Таким образом наши результаты устанавливают ударным как мощный следственный инструмент для 3D анализ функциональных и анатомические особенности млекопитающих органов, включая но не ограничиваясь нейрональных сетей, сосудистую крови и тканей матрица архитектуры. Продвигаясь вперед, мы считаем, что ударным может быть особенно полезным в расследовании более высокого порядка биологических механизмов, которые способствуют Патофизиология болезни, например повреждения тканей, пороков развития, рак и нейродегенеративных болезни14,,1516,17. В сочетании с изучением тонкой клеточных механизмов, участвующих в болезни, ударным имеет потенциал для обеспечения более полной, многомасштабный, понять, как различные разрозненные болезни механизмы взаимодействия вызывают наблюдаемые фенотип.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана мозга Корея 21 плюс проект сайта для медицинской науки, Университет Йонсей. Кроме того эта работа была поддержана грантом от Национальный исследовательский фонд Кореи (СР 2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
