Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

आवश्यक धातु ग्राम में अति-नकारात्मक बैक्टीरिया: एक्स-रे प्रतिदीप्ति, Radioisotopes, और सेल भिन्नीकरण

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/57169
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2, 4
1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Summary

अपने मूल बाध्यकारी भागीदारों के संदर्भ में एक periplasmic संक्रमण धातु निगरानी के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल, और एक्स-रे प्रतिदीप्ति और radiometal के द्वारा अपने सब्सट्रेट सामग्री के भौतिक लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया है ।

Abstract

हम कोशिका से बैक्टीरियल periplasm के जुदाई के लिए एक स्केलेबल विधि का प्रदर्शन । इस विधि के लिए भौतिक लक्षण वर्णन के प्रयोजन के लिए periplasmic प्रोटीन शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मापने सब्सट्रेट periplasmic और cytoplasmic डिब्बों के बीच स्थानांतरण । ध्यान से समय है कि periplasm कोशिका से अलग कर दिया है सीमित करके, प्रयोगकर्ता ब्याज और परख के प्रोटीन प्रत्येक डिब्बे के लिए अलग सब्सट्रेट के लिए ले-डिब्बों के बीच संक्रमण पर बिना निकाल सकते हैं । अंश से निकाली गई प्रोटीन फिर तीन आयामी संरचना निर्धारण या सब्सट्रेट-बाध्यकारी प्रोफाइल के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, इस विधि एक ट्रेसर के साथ गर्मी के बाद किया जा सकता है के लिए कुल प्रतिशत का निर्धारण, साथ ही साथ अनुरेखक के वितरण (और इसलिए धातु परिवहन) अलग बैक्टीरियल डिब्बों में । एक ट्रेसर के साथ प्रयोग एक शारीरिक सब्सट्रेट और artefactual सब्सट्रेट, जैसे mismetallation के कारण उन लोगों के बीच अंतर करने में मदद कर सकते हैं.

एक्स-रे प्रतिदीप्ति की उपस्थिति या एक नमूना में धातु निगमन के अभाव की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही माप परिवर्तन है कि धातु निगमन में वृद्धि की स्थिति, शुद्धि शर्तों के उत्पाद के रूप में हो सकता है, और/ एक्स-रे प्रतिदीप्ति भी एक धातु है, जो सबसे अच्छा धातु ऊर्जा अवशोषण के लिए असंगत एक्स-रे कैटरिंग डाटा संग्रह के लिए उपयोग करने के लिए चोटी का निर्धारण किया जा सकता है के लिए बहुतायत के एक रिश्तेदार उपाय प्रदान करता है । Radiometal एक विधि के रूप में एक्स-रे प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया सब्सट्रेट के शारीरिक प्रकृति को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही उपंयास सब्सट्रेट की खोज का समर्थन.

Introduction

ग्राम में नकारात्मक बैक्टीरिया, संक्रमण धातु परमाणुओं की cytoplasmic पूल वृद्धि और भीतरी झिल्ली एबीसी द्वारा मंगाया जाता है (एटीपी-बाध्यकारी कैसेट) आयातकों कि भीतरी झिल्ली भर में धातु translocation के लये । Periplasmic क्लस्टर a-1 सब्सट्रेट-बाध्यकारी प्रोटीन (SBPs) chaperones के एक समूह है कि धातु परमाणुओं सीधे बांध और उंहें periplasm के माध्यम से नौका की रचना के लिए उंहें cognate एबीसी आयातक1उद्धार । SBPs के अंय समूहों chelated धातु (क्लस्टर ए-2), कार्बोहाइड्रेट (क्लस्टर्स बी और डी-1), और एमिनो एसिड (क्लस्टर बी, सी, एफ-2 और एफ-4) के रूप में, सब्सट्रेट के परिवहन के लिए समर्पित कर रहे हैं; फिर भी, सब्सट्रेट की परवाह किए बिना, SBPs एक evolutionarily-संरक्षित सी-क्लैंप2गुना का पालन करें । एसबीपी सब्सट्रेट स्थानांतरण के लिए सामान्यीकृत प्रस्तावित तंत्र में सी-क्लैंप contortions की एक श्रृंखला के दौर से गुजरना भी शामिल है जो एक वीनस मक्खियों3के समान है । आम तौर पर, क्लस्टर a-1 SBPs एक holo (धातु बंधे) के रूप में शुद्ध, हालांकि इन SBPs के अध्ययन के लिए प्रयोग4के लिए प्रोटीन के एपीओ (धातु मुक्त) रूपों पैदा करने में कठिनाई द्वारा सीमित है. तारीख करने के लिए, रणनीतियों के लिए एपीओ क्लस्टर ए-1 SBPs mutagenesis, डायलिसिस, और आंशिक विकार के लिए सीमित किया गया है के साथ ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. इन प्रयोगों से उत्पंन होने वाले संरचनात्मक डेटा का सुझाव है कि क्लस्टर A-1 SBPs शुक्र मक्खियों तंत्र का ठीक से पालन नहीं कर सकता है । वर्तमान में साहित्य से लापता एपीओ क्लस्टर ए-1 SBPs vivo में शारीरिक बाध्यकारी भागीदारों का उपयोग कर के उत्पादन की एक विधि है ।

हम पहली बार के लिए सेल आंशिक YfeA शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन, एक क्लस्टर ए-1 एसबीपी से Yersinia pestis, प्लेग के etiological एजेंट है, जो अपने शारीरिक cognate YfeBCDE एबीसी आयातक के साथ बातचीत के माध्यम से एपीओ रूप में परिवर्तित किया गया था कक्ष में । हम दिखाने के YfeA के एपीओ रूप में है ऊर्जा प्रसार एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (), भी एक्स के रूप में जाना जाता रे प्रतिदीप्ति । हम भी आंतरिक झिल्ली भर में बाहरी झिल्ली और धातु आयात भर में धातु के बीच भेद करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील रेडियोधर्मी धातु के अध्ययन के साथ सेल भिन्नीकरण के संयोजन से YfeBCDE कार्यक्षमता का प्रदर्शन । एक रेडियोधर्मी अनुरेखक के उपयोग की अनुमति देता है स्नातकोत्तर का पता लगाने के लिए/एल धातुओं की मात्रा, बहुत कम की तकनीक के लिए पता लगाने की सीमा की तुलना में इस तरह के रूप में inductively मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-MS) या परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस). इस प्रणाली के ंयूनतम गड़बड़ी के लिए अनुमति देता है अध्ययन किया जा रहा है । इसके अतिरिक्त, पारंपरिक सूचीबद्ध तरीकों अक्सर बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, अतिरिक्त पोस्ट प्रसंस्करण, और लंबे समय के आसपास बारी है, जो ट्रेसर परख के लिए विशिष्ट नहीं हैं । इस प्रकार, एक ट्रेसर का उपयोग कर धातु वितरण की निगरानी और एक सेल के भीतर के लिए एक सुविधाजनक और सरल तरीका प्रदान करता है । यह निर्धारित किया जा करने के लिए यदि एक एपीओ क्लस्टर A-1 एसबीपी इस विधि का उपयोग कर उत्पादित वर्तमान प्रक्रियाओं को एपीओ प्रोटीन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल से संरचनात्मक टिप्पणियों गूंज जाएगा रहता है ।

सेल अंश विशेष रूप से12अलगाव में उनकी सामग्री की जांच के अंतर्निहित प्रयोजन के लिए सेलुलर डिब्बों को अलग करने के लिए एक स्थापित विधि है । सेल अंश आमतौर पर सेल चक्र के दौरान एक अणु के स्थान की पुष्टि करने के लिए या एक विशेष डिब्बे की गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है13. उदाहरण के लिए, धातु परिवहन गतिविधि धातु सब्सट्रेट के लिए सेलुलर डिब्बों की जांच द्वारा परख कर सकते हैं । कोशिका अंशों को एकीकृत करने से बाहरी झिल्ली और धातु के भीतर की झिल्ली में भेद और धातु के बीच तुलना में अंतर होता है । इन प्रक्रियाओं तो बारी में समय के साथ मापा जा सकता है । प्रोटीन शुद्धिकरण के मामले में, कोशिका lysis और अघुलनशील घटकों से घुलनशील घटकों की जुदाई का सबसे आम तरीकों यांत्रिक व्यवधान (यानी, पीसने, सम्मिश्रण), उच्च दबाव homogenization (यानी, फ्रेंच दबाव सेल प्रेस, सेल व्यवधान), और अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों (अर्थात, sonication)14. लाइसे कोशिकाओं के लिए अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों का उपयोग आम तौर पर सबसे अच्छा छोटे संस्करणों के लिए अनुकूल है; हालांकि, sonication अत्यधिक गर्मी है कि प्रोटीन स्वभाव कर सकते है उत्पंन करने के लिए जाना जाता है । अत्यधिक गर्मी पैदा करने से बचने के लिए, अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों आमतौर पर अनुक्रमिक कम फटने में लागू कर रहे हैं, जो समय लेने वाले और अनजाने में छोटे टुकड़ों में डीएनए अणुओं नीचा हो सकता है । प्रत्येक जांच संसाधित किया जा सकता नमूना वॉल्यूम के लिए एक सीमित श्रेणी है के रूप में इसके साथ ही, एक से अधिक expensive sonication जांच preparative और विश्लेषणात्मक प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है । लाइसे कोशिकाओं को उच्च दबाव का उपयोग सेल lysis के दौरान अत्यधिक गर्मी पैदा करने से बचा जाता है द्रुतशीतन फ्रेंच दबाव सेल प्रेस घटकों से पहले lysis या एक ठंडे वातावरण में एक कोशिका अवरोधक ऑपरेटिंग ऐसे ठंडे कमरे के रूप में । sonication जांच की तरह, फ्रेंच दबाव सेल प्रेस घटकों के कई सेट नमूना मात्रा की एक विस्तृत श्रृंखला की प्रक्रिया के लिए खरीदा जा करने के लिए आवश्यकता हो सकती है । फ्रेंच दबाव सेल प्रेस विधानसभाओं से कनेक्ट करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन संचालित करने के लिए अजीब और साफ, स्थानांतरित करने के लिए भारी हो सकता है और घने नमूनों से कॉलेस्ट्रॉल के लिए प्रवण हैं अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों और लाइसे कोशिकाओं के लिए उच्च दबाव प्रणालियों का उपयोग करने के लिए लाभ उच्च नमूना वसूली, न्यूनतम पार संदूषण के साथ कई नमूनों की प्रक्रिया करने की क्षमता, और समायोज्य कतरनी बल, जो की lysis अनुकूलन के लिए अनुकूलित किया जा सकता शामिल नमूना प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला । अल्ट्रासोनिक आवृत्ति, फटने की अवधि, वर्ग इंच (साई) प्रति पिस्टन दबाव पाउंड, और प्रेस के माध्यम से गुजरता की संख्या का समायोजन करके अनुकूलन हो सकता है । लाइसे कोशिकाओं को यांत्रिक विघटन का उपयोग सेल lysis के लिए सबसे अधिक तकनीकी रूप से तुच्छ और कम खर्चीली रणनीति हो सकती है । यांत्रिक व्यवधान नमूना वसूली में चुनौतियों मौजूद कर सकते हैं और कई नमूनों प्रसंस्करण के लिए आदर्श नहीं है । यांत्रिक व्यवधान उच्च दाब या अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों से नमूनों के लिए gentler है, लेकिन उच्च प्रवाह नहीं है और अकुशल lysis के लिए प्रवण है । यांत्रिक विघटन, उच्च दाब homogenization, और अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों की एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक सीमा, इस तरह के lysis के बाद पूरे सेलुलर वास्तुकला के बेकाबू व्यवधान है, सभी जलीय कोशिका घटकों मिश्रित कर रहे हैं साथ. इसके अलावा, सभी सेल डिब्बों को एक ही समय में बाधित नहीं करते; इसलिए, डिब्बों की सामग्री है कि जल्दी लाइसे चल विघटनकारी अब लाइसे देर से डिब्बों की सामग्री से अधिक बलों के अधीन किया जा सकता है । सेल विभाजन सस्ती के लिए अनुमति देता है, तकनीकी रूप से सरल, कुशल डिब्बे सेल सामग्री की जुदाई आधारित है, जबकि महंगे उपकरण और कठोर, विघटनकारी बलों के लिए नमूना जोखिम के लिए आवश्यकता से परहेज ।

एसबीपी के मामले में, आयातित सब्सट्रेट संभावित एपीओ प्रोटीन को पुनः शुरू किया जाता है और lysis के दौरान holo प्रोटीन पुनर्जीवित, बहाव क्रोमैटोग्राफी या अन्य शोधन तकनीक से पहले. lysis के दौरान EDTA chelator का समावेश एक अतिरिक्त बाधा, जहां प्रोटीन शुद्धि के एक पहले कदम के रूप में धातु संबध संभव नहीं है प्रस्तुत करता है क्योंकि EDTA धातु क्रोमैटोग्राफी राल से पट्टी और प्रोटीन15बाध्यकारी रोकने जाएगा । एक सरल और सस्ती समाधान परासरणी सदमे से सेल आंशिकता है, जहां अंतर केंद्रापसारक और आम प्रयोगशाला एजेंट अंवेषक को ध्यान से कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन निकालने के लिए सक्षम है । परासरणी शॉक भिंन सेलुलर डिब्बों को अलग करने के लिए परासरणी दबाव में एक दो कदम परिवर्तन का उपयोग करता है । सबसे पहले, एक hypertonic बफर कोशिकाओं crenate के रूप में पानी के रूप में प्रत्येक कोशिका पत्ते और दूसरे, एक hypotonic बफर कोशिकाओं को पानी के रूप में प्रफुल्लित करने का कारण बनता है फिर से प्रत्येक कोशिका में प्रवेश करती है । ध्यान से नियंत्रित करने से कितनी देर तक कोशिकाओं प्रफुल्लित, बाहरी झिल्ली चुन लीजड जा सकता है (आने वाले पानी से परासरणी दबाव के buildup के कारण), इस प्रकार बफर में उनकी सामग्री को खाली । भीतरी झिल्ली के संरक्षण सुनिश्चित करता है कि cytoplasmic सामग्री spheroplasts में बनाए रखे हैं, और आसानी से periplasmic सामग्री से केंद्रापसारक द्वारा अलग कर रहे हैं ।

YfeA एक polyspecific एसबीपी बंधन लोहा, मैंगनीज, और जस्ता परमाणुओं में सक्षम है16। शामिल धातु के सापेक्ष अनुपात वृद्धि के दौरान धातु के पूरकता के अनुसार बदला जा सकता है, और एक्सरे प्रतिदीप्ति द्वारा परख जैसे Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला के उंनत फोटॉन स्रोत16में उपलब्ध है । एक्स-रे प्रतिदीप्ति अंवेषक जल्दी से बड़ी या विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल के लिए आवश्यकता के बिना धातुओं की एक व्यापक विधानसभा प्रोफ़ाइल के लिए सक्षम बनाता है, और यहां तक कि प्रोटीन या proteinaceous समाधान से डेटा बटोरना कर सकते हैं ।

एक्स-रे प्रतिदीप्ति जल्दी से इस तरह के रूप में अप्रत्याशित परिणाम प्रकट कर सकते हैं, इस मामले में, प्राथमिक YfeA सब्सट्रेट जस्ता जा रहा है और नहीं प्रलेखित शारीरिक सब्सट्रेट आयरन या मैंगनीज16. एक्स-रे कैटरिंग डेटा एकत्रित करने से पहले उपयोग किया जाता है, तो एक्स-रे प्रतिदीप्ति प्रयोगात्मक डिजाइन में जांचकर्ता को सूचित कर सकते हैं, इस तरह के रूप में जो धातु ऊर्जा बढ़त (ओं) विषम एक्स-रे बिखरने डेटा संग्रह के लिए उपयोग करने के लिए. बस एक धातु के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के रूप में उपयोगी के रूप में, एक्स-रे प्रतिदीप्ति भी अगर एक धातु एक नमूना में अनुपस्थित है, holo प्रोटीन से एपीओ प्रोटीन युक्त क्रिस्टल को अलग करने की एक तेजी से विधि प्रदान करने का निर्धारण कर सकते हैं, और धातु संकेत शक्ति का आकलन समय लेने वाली डेटा प्रोसेसिंग की आवश्यकता के बिना । एक मजबूत धातु संकेत के साथ एक नमूना की पहचान करने पर, असंगत एक्स-रे के लिए उपयोग करने के लिए सटीक तरंग दैर्ध्य डेटा संग्रह एकाधिक-तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव (MAD) स्कैन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।

इस विस्तृत प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक सेल भिंन प्रदर्शन और सिंक्रोट्रॉन beamline हार्डवेयर का प्रभावी उपयोग प्रोफ़ाइल कुल धातु सामग्री के लिए और धातु बाध्यकारी प्रोटीन के अध्ययन अग्रिम करने में मदद करने के लिए नए experimenters का इरादा है ।

Protocol

1. बैक्टीरियल स्टार्टर संस्कृति (1 दिन)

  1. एक २०० मिलीलीटर में बेवल्ड कुप्पी, लगाना के 30 मिलीलीटर Luria Bertani शोरबा (पौंड) के साथ ई कोलाई तनाव BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL pYFE3 युक्त प्लाज्मिड कोशिकाओं16.
  2. एक पिपेट और २०० µ एल टिप के साथ aspirating द्वारा कुप्पी के लिए ५० मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन के 30 µ एल जोड़ें । ३७ ˚ सी में २२५ आरपीएम पर रात भर हिला

2. पूरक M9 ंयूनतम मीडिया तैयारी (दिवस 2)

नोट: यह Amresco मैनुअल से अनुकूलित है ।

  1. तरल मीडिया के 6 एल निंनलिखित प्रक्रिया द्वारा तैयार करते हैं । एक 2 एल बेवली कुप्पी में, M9 मिनिमल मीडिया के १०.५ जी अल्ट्रा के 1 एल शुद्ध एच2O. आटोक्लेव १२१ ˚ C पर 20 मिनट के लिए और फिर कमरे के तापमान को ठंडा जोड़ें ।
  2. Aseptically निंनलिखित बाँझ पूरक समाधान जोड़ें: 2 एमएल/एल के 1 एम MgSO4, 10 एमएल/एल के 20% डब्ल्यू/वी ग्लूकोज, ०.१ एमएल/एल के 1 एम CaCl2, और 1 एमएल/एल के ५० मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन । एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इस कदम को एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए करते हैं । गर्म करने के लिए मीडिया ३७ ˚ सी ।

3. बैक्टीरियल उपसंस्कृति

  1. एक स्वचालित पिपेट और 5 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा M9 ंयूनतम मीडिया के लिए रातोंरात स्टार्टर संस्कृति के 5 मिलीलीटर/ हिला उपसंस्कृति लगातार २२५ rpm पर ३७ ˚ सी में 9 एच के लिए ।
    नोट: इस चरण के दौरान YfeABCDE autoinduction द्वारा अपने नेटिव Y. pestis प्रवर्तक से व्यक्त है ।
  2. 4 ˚ सी में 30 मिनट के लिए ४,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त एक बर्फ ठंडा फॉस्फेट बफर समाधान की ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनः निलंबित (20 मिमी ना2HPO4 पीएच ७.६, ५० mm NaCl) एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा, और रात भर फ्रीज-८० ˚ सी ।

4. सेल भिन्नीकरण (Day 3)

  1. गल 4 ° c ˚ पर 20 मिनट के लिए ४,००० x जी में और गोली कोशिकाओं पर 5 डिग्री सेल्सियस । एक स्वचालित पिपेट और 25 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा बर्फ ठंडा उच्च नमक बफर (२०० mm Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ४०० मिमी NaCl, और 2 मिमी EDTA) के ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । मिश्रण के लिए सामयिक उलटा के साथ 20 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन की मशीन, ।
  2. 4 ˚ सी में 20 मिनट के लिए ४,५०० x g पर कोशिकाओं गोली एक स्वचालित पिपेट और 25 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा बर्फ ठंडा कम नमक बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०) के ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । मिश्रण के लिए सामयिक उलटा के साथ 20 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन की मशीन, ।
  3. गोली 4 ˚ सी में 20 मिनट के लिए ४,५०० x g पर spheroplasts supernatant युक्त periplasmको पुनर्प्राप्त करें । एक स्वचालित पिपेट और 25 मिलीलीटर टिप, और १५०० साई पर फ्रेंच दबाव सेल प्रेस के तीन चक्र द्वारा लाइसे कोशिकाओं के साथ aspirating द्वारा फास्फेट बफर खारा समाधान (चरण ३.२) में छर्रों spheroplasts reसस्पेंड ।
    नोट: एक फ्रांसीसी दबाव सेल प्रेस को संचालित करने के लिए अजीब हो सकता है और सेल lysis ड्राइव करने के लिए एक हाइड्रोलिक पंप का उपयोग करता है । सावधानी का प्रयोग करें जब हाइड्रोलिक पंप आकर्षक, प्रेस के साथ पिस्टन के उचित संरेखण सुनिश्चित करने, और हाथ हाइड्रोलिक पंप से मुक्त रखते हुए ।
  4. 4 ˚ सी में 20 मिनट के लिए ५०,००० x g पर सेलुलर मलबे गोली supernatant युक्त कोशिकाको पुनर्प्राप्त करें । यदि आवश्यक हो, तो बाहरी और भीतरी झिल्ली को आगे fractionated16हो सकता है ।

5. प्रोटीन शुद्धि FPLC का उपयोग

  1. तुरंत अंश के बाद, एक ०.४५ µm झिल्ली इकाई का उपयोग कर periplasmic अंश फ़िल्टर । आसानी और तेजी से निस्पंदन के लिए एक Luer लॉक सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करें । Equilibrate एक 5 एमएल Q आयनों एक्सचेंज कॉलम का उपयोग 20 mM Tris pH ७.६, ०.०५% w/v नण3 लोड करने वाले बफर का एक flowrate पर 5 एमएल/
  2. लोड periplasmic निस्पंदन पर पूर्व equilibrated 5 मिलीलीटर Q आयनों विनिमय कॉलम का उपयोग 20 मिमी Tris पीएच ७.६, ०.०५% w/वी नण3 लोड हो रहा है बफर के एक flowrate पर 2 मिलीलीटर/5 एमएल Q आयनों एक्सचेंज कॉलम का उपयोग कर 20 mm Tris पीएच ७.६ धोने के लिए जारी रखें , ०.०५% w/v नण य3 लोड करने वाला बफ़र जब तक A280 का एक आधारभूत पठन 5 मिलीलीटर/
  3. Elute 20 मिमी Tris पीएच ७.६, ०.०५% w/v नण3, 0-1 M NaCl का उपयोग करते हुए बाध् य प्रोटीन को 10 कॉलम वॉल्स से अधिक 5 एमएल/एक flowrate मेंएक २८० चोटी वाले अंशों को मिलाकर । २०० एमएम NaCl और ३०० एमएम NaCl के बीच एपीओ YfeA elutes ।
  4. केंद्रापसारक ध्यानी द्वारा eluate ध्यान केंद्रित जब तक मात्रा ~ 5 मिलीलीटर तक पहुंचता है ।
  5. Equilibrate एक Superdex २०० स्नातकोत्तर जेल निस्पंदन कॉलम के साथ 20 मिमी बीआईएस-Tris पीएच ६.३, ५० mm NaCl, ०.०५% w/v नण3 जेल निस्पंदन बफर की एक flowrate पर २.५ एमएल/
  6. पूर्व equilibrated Superdex २०० स्नातकोत्तर जेल निस्पंदन कॉलम पर केंद्रित आयनों एक्सचेंज eluate लोड और ५.५ २.५ मिलीलीटर की एक flowrate पर कदम से जेल निस्पंदन बफर का उपयोग शुद्ध/एक ~ 30 के लिए इसी एक२८० चोटी वाले भागों गठबंधन kilodalton (केडीए) प्रोटीन.
    नोट: निंन संदर्भ प्रोटोकॉल17को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण FPLC प्रयोग है ।

6. प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

  1. ध्यान दें जेल निस्पंदन eluate द्वारा केंद्रापसारक ध्यानी एक अंतिम प्रोटीन एकाग्रता के लिए 22 मिलीग्राम/एमएल ।
    1. १.२७६ मिलीग्राम/एमएल द्वारा एक२८० पढ़ने विभाजित करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना । इस सैद्धांतिक विलुप्त गुणांक ExPASY ProtParam18द्वारा भविष्यवाणी की गई थी ।
      नोट: ५.१०४ AU के एक एक२८० नमूना पढ़ने के लिए एक ४.००० मिलीग्राम/mL समाधान से मेल खाती है; ५.१०४ AU ÷ १.२७६ mg/एमएल = ४.०० मिलीग्राम/
  2. 30% w/v खूंटी ४०००, ५० mm NaCl, 20 mm बीआईएस-Tris pH ६.३, ०.०५% w/v नण य3 में एक aspirating और 10 पिपेट l टिप के साथ µ द्वारा छोड़े गए ड्रॉप या हैंगिंग ड्रॉप सेटअप में प्रोटीन की १.५ µ l को मिलाएं ।
  3. 2-4 सप्ताह के लिए २९३ K पर गर्मी क्रिस्टलीकरण गिरता है ।
  4. सिंक्रोट्रॉन को लदान के लिए तरल नाइट्रोजन पूल में फ्लैश फ्रीज क्रिस्टल ।

7. एक्स-रे प्रतिदीप्ति (जीएम/सीए Beamline सॉफ्टवेयर का उपयोग कर)

  1. हच टैब पर नेविगेट करें. ऊर्जा को ऊर्जा सेट करने के लिए उपशीर्ष का उपयोग १०.० कीव ।
  2. स्कैन टैब पर नेविगेट करें. सहभागी टैब पर नेविगेट करें ।
  3. ऑप्टिमाइज़ प्रतिदीप्ति संकेतका चयन करें । समय उपशीर्ष के अंतर्गत इनपुट ४.०० एस. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम लेंचुनें । प्लॉट टैब का उपयोग करके स्पेक्ट्रम देखें ।

8. पागल धातु ऊर्जा अवशोषण चोटी के लिए स्कैन (जीएम/सीए Beamline सॉफ्टवेयर का उपयोग)

  1. नमूना बीम से बाहर ले जाएँ । स्कैन टैब पर नेविगेट करें । आवर्ती तालिका टैब पर नेविगेट करें । रुचि के तत्व के K-किनारे का चयन करना ।
    नोट: ऊर्जा उपप्रमुखता में ऊर्जा मूल्य eV में है ।
  2. हच टैब पर नेविगेट करें । ऊर्जा का उपयोग करने के लिए ऊर्जा सेट करने के लिए चरण में मूल्य ८.१ में कीव ।
  3. बीम में नमूना ले जाएं । स्कैन टैब पर नेविगेट करें । स्वत: टैब पर नेविगेट करें, समय के अंतर्गत इनपुट २.०० s ।
  4. स्कैन प्रारंभकरें चुनें । प्लॉट टैब का उपयोग करके MAD स्कैन देखें ।
    नोट: पीक उपशीर्ष में ऊर्जा मूल्य eV में है बजाय कीव ।
  5. प्रतिदीप्ति के साथ कियागया का चयन करें ।
  6. नमूने को बीम से बाहर ले जाएं । हच टैब पर नेविगेट करें । ऊर्जा का उपयोग करने के लिए चरण में मूल्य के लिए ऊर्जा सेट सिर ८.४ अगले eV (यानी, पीक: ९६५८.३ ev के लिए गोल, ९६५९ ev के लिए ऊर्जा सेट) ।
  7. बीम में नमूना ले जाएं । डेटा सेट एकत्रित करें । ब्याज की सभी धातुओं के लिए चरण ८.१-८.६ दोहराएँ ।

9. रेडियोधर्मी धातु के लिए विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल परख

  1. एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में, लगाना ई. कोलाई तनाव BL21-CodonPlus (DE3) के साथ पौंड के 5 मिलीलीटर-RIPL pYFE3 युक्त प्लाज्मिड कोशिकाओं16। एक पिपेट और 10 µ एल टिप के साथ aspirating द्वारा ५० मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन के 5 µ एल जोड़ें । 7 एच के लिए ३७ ˚ C पर २२५ rpm पर हिलाओ ।
  2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १५,००० x g पर कोशिकाओं को गोली एक तालिका का उपयोग करते हुए । एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा पूरक M9 मिनिमल मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो लें । एक बार दोहराएं ।
  3. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, उपसंस्कृति कोशिकाओं 30 मिलीलीटर में एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा M9 मिनिमल मीडिया पूरक । 9 एच के लिए ३७ ˚ C पर २२५ rpm पर हिलाओ ।
  4. प्रति मिनट लगभग १००,००० गणना प्राप्त करने के लिए आवश्यक रेडियोधर्मिता की मात्रा का निर्धारण (सीपीएम).
    नोट: यह पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया आइसोटोप और साधन के आधार पर भिन्न होगा. उदाहरण के लिए, ५२Mn के ७.४ kilobecquerel (kBq) (०.२ microcurie (µ ci)) वाले एक नमूने को स्वचालित गामा डिटेक्टर (NaI) पर ५५०,००० cpm का पठन देता है । इस प्रकार, १००,००० सीपीएम की गिनती प्राप्त करने के लिए आवश्यक रेडियोधर्मिता की राशि निम्न समीकरण का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता: (१००,००० सीपीएम/550000 सीपीएम) * 7.4 kBq (०.२ µ ci) = १.३५ kBq (०.०३६ µ ci).
    चेतावनी: रेडियोधर्मी क्षय विकिरण के रिलीज में परिणाम है, जो खतरनाक है । जब रेडियोधर्मिता के साथ काम कर हमेशा उचित परिरक्षण का उपयोग करें और कम के रूप में यथोचित प्राप्त (अलारा) के सिद्धांतों का पालन दूरी बढ़ रही है और परिरक्षण करते हुए जोखिम समय को कम करने के द्वारा. केवल प्रशिक्षित कर्मियों को विशेष रूप से निर्दिष्ट प्रयोगशालाओं, जो रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग के लिए लाइसेंस प्राप्त कर रहे हैं में रेडियोधर्मिता संभाल चाहिए ।
  5. आवश्यक रेडियोधर्मिता गुणा उपसंस्कृति की कुल मात्रा के द्वारा कदम ९.४ में गणना की, आवश्यक रेडियोधर्मिता की कुल राशि का निर्धारण करने के लिए. इस राशि जोड़ें (अधिमानतः ५०-१०० µ एल की एक छोटी मात्रा में) उपसंस्कृति युक्त ट्यूब करने के लिए इतना है कि वहां १००,००० सीपीएम/एमएल, और भंवर के लिए अच्छी तरह से कर रहे है 30 एस ।
    नोट: उपसंस्कृति के 31 मिलीलीटर के लिए, आवश्यक रेडियोधर्मिता की कुल राशि १.३५ kBq (०.०३६ µ ci) x 31 मिलीलीटर = ४१.३ kBq (१.१२ µ ci) है ।
  6. उपसंस्कृति के Aliquot 1 मिलीलीटर (अब रेडियोधर्मी अनुरेखक युक्त) एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा व्यक्तिगत १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में, और जगह एक 37 ˚ सी thermomixer में, 1 × जी पर भंवर के साथ, पर्याप्त ट्यूबों शामिल इतना है कि वहां है तीन प्रत्येक के लिए प्रतिकृति वांछित माप के रूप में अच्छी तरह के रूप में तीन अतिरिक्त मानकों के रूप में उपयोग करने के लिए प्रतिकृति (मानकों को अलग सेट, मानकों पर भिन्नीकरण परख प्रदर्शन नहीं करते).
    नोट: 1, 2 पर परख, और 4 एच कुल 12 ट्यूबों की आवश्यकता होगी ।
  7. मशीन के बाद, 30 के लिए १५,००० × जी में ट्यूबों केंद्रापसारक एक benchtop केंद्रापसारक का उपयोग कर (अधिमानतः 4 ˚ सी को ठंडा) और supernatants त्यागें ।
  8. फिर से एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा बर्फ ठंडा, उच्च नमक बफर (४.१ कदम) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित, और तुरंत बर्फ पर 20 मिनट के लिए जगह है ।
  9. एक benchtop केंद्रापसारक (अधिमानतः 4 ˚ सी को ठंडा) का उपयोग कर 30 एस के लिए १५,००० × जी पर कोशिकाओं को फिर से गोली और supernatants त्यागें ।
    नोट: supernatant असंबद्ध मुक्त धातु शामिल हैं ।
  10. फिर से बर्फ ठंड में कोशिकाओं को निलंबित, कम नमक बफर (४.२ कदम) एक पिपेट और 1 मिलीलीटर टिप के साथ aspirating द्वारा, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    नोट: यह इस कदम के लिए पिपेट के माध्यम से धीरे महाप्राण महत्वपूर्ण है ।
  11. १५,००० × 30 एस के लिए जी में कोशिकाओं गोली, और नई १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में supernatants के प्रत्येक इकट्ठा । वहां अब समय बिंदु प्रति छह ट्यूबों होना चाहिए ।
    नोट: supernatant शामिल है periplasmic अंश और गोली झिल्लीदार और cytoplasmic अंशशामिल हैं । हम cytoplasmic अंश के रूप में गोली को देखें ।
  12. प्रत्येक अंश में रेडियोधर्मिता को मापने (समय बिंदु प्रति छह ट्यूबों), साथ ही साथ मानकों में ९.६ कदम में अलग सेट. मूल रूप से हर नमूने में जोड़ा रेडियोधर्मिता की कुल राशि का निर्धारण करने के लिए मानकों में रेडियोधर्मिता की मात्रा का उपयोग करें.
  13. periplasm में रेडियोधर्मी ले का प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए, निम्न समीकरण का उपयोग करें: (औसत सीपीएम के periplasmic अंश/औसत सीपीएम मानकों के) x १००.
  14. कोशिका में रेडियोधर्मी ले के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए, निम्न समीकरण का उपयोग करें: (औसत सीपीएम के cytoplasmic अंश/औसत सीपीएम के मानक) x १००.
  15. % कुल का निर्धारण करने के लिए, निंन समीकरण का उपयोग करें: ((औसत सीपीएम के periplasmic अंश + इसी cytoplasmic अंश का औसत सीपीएम)/(मानक का औसत सीपीएम)) x १०० ।

Representative Results

एसडीएस जेल और जेल निस्पंदन chromatograms preparative periplasm अंश से प्रोटीन शुद्धिकरण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एकत्र किए गए थे । holo YfeA की शुद्धि के पहले16वर्णित किया गया है; हालांकि एपीओ YfeA के शुद्धिकरण की रिपोर्ट नहीं आई है । इस विधि द्वारा वर्णित एपीओ YfeA को शुद्ध करने की रणनीति एक संयोजक जंगली प्रकार के निर्माण का उपयोग करता है कि किसी भी तरह का एक संबंध टैग, विशेष रूप से एक है कि प्रोटीन immunoblot के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, अपने-टैग), और एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि पहचानता YfeA नहीं बताया गया है । इसलिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण YfeA की शुद्धि की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया गया था । YfeA को भिंन रूप से शुद्ध करने के लिए, इसे आयनों exchange क्रोमैटोग्राफी (आरेख 1) के लिए रेखीय रेफरेंस ग्रेडिएंट का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है । रैखिक रेफरेंस ढाल काफी आयनों एक्सचेंज उत्पाद के ४९% के लिए periplasm अंश के लगभग 8% बनाने से YfeA संवर्धन में सुधार के रूप में densitometry द्वारा परिकलित (चित्रा 1C) । यह संरचना जेल निस्पंदन द्वारा ६१% करने के लिए सुधार हुआ है, और एपीओ प्रोटीन के रेफरेंस मात्रा holo प्रोटीन की रेफरेंस मात्रा के समान है (चित्रा 2) । मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण YfeA एमिनो एसिड अनुक्रम, २४६ कुल YfeA पॉलीपेप्टाइड स्पेक्ट्रा, 24 अद्वितीय पेप्टाइड्स, और ५० अद्वितीय पॉलीपेप्टाइड स्पेक्ट्रा के ९२.५% का पता लगाने के माध्यम से YfeA के शुद्धिकरण की पुष्टि करता है । वैकल्पिक रूप से, एक कदम ढाल रेफरेंस से उत्पाद के साथ रैखिक ढाल उत्पाद विपरीत करने के लिए, YfeA २५० mm NaCl (चित्रा 1 डी) के एक रेफरेंस कदम के बाद ५० mm NaCl के एक धोने कदम का उपयोग कर आयनों एक्सचेंज द्वारा शुद्ध किया गया था । चरण ग्रैडिएंट YfeA densitometry द्वारा परिकलित आयनों exchange उत्पाद के 18% करने के लिए periplasm अंश का 17% रचना से समृद्ध बनाता है । कदम ढाल रेफरेंस भी एक प्रोटीन contaminant बैंड है कि जन स्पेक्ट्रोमेट्री समान आणविक वजन के कई ई. कोलाई SBPs युक्त के रूप में पहचान को समृद्ध करता है । HiLoad 26/600 Superdex २०० स्नातकोत्तर, आणविक भार और दूषित SBPs की संरचनाओं में समानता के संकल्प सीमा के कारण, जेल निस्पंदन मामूली जेल निस्पंदन उत्पाद के 20% करने के लिए YfeA संवर्धन में सुधार । एक रैखिक रेफरेंस ढाल आयनों एक्सचेंज के लिए अप्राप्य होना चाहिए, यह 25-50 mM NaCl वेतन वृद्धि में कई कदम धोने का पता लगाने के लिए इन दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए आवश्यक NaCl की एकाग्रता की पहचान करने के लिए सिफारिश की है ।

शुद्ध एपीओ और holo YfeA एक ही क्रिस्टलीकरण की स्थिति में सघन, हालांकि एपीओ और holo YfeA क्रिस्टल morphologies की छवियों एपीओ और holo YfeA राज्यों (चित्रा 3) के बीच क्रिस्टल विकास में अंतर दिखाते हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री सत्यापन के अलावा, एक्स-रे विवर्तन डेटा (दिखाया नहीं) इस विधि से शुद्ध प्रोटीन से हो क्रिस्टल से एकत्र की शुद्धि और YfeA के क्रिस्टलीकरण की पुष्टि की । डिब्बे संदूषण की सीमा (cytoplasmic जस्ता periplasm अंश में holo प्रोटीन को वापस लाने) एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (चित्रा 4) पर कब्जा करके मूल्यांकन किया जा सकता है. यह देखते हुए कि जस्ता प्राथमिक संयोजक YfeA करने के लिए बाध्य सब्सट्रेट है16, एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा तेजी से एक YfeA नमूना holo अनुरूप (चित्रा 4a) के साथ एक मजबूत जस्ता संकेत YfeA युक्त के बीच अंतर कर सकते हैं, पार का संकेत संदूषण, या एक कमजोर जिंक एपीओ YfeA और ंयूनतम पार संदूषण (चित्रा 4B) के संकेत विचारोत्तेजक । आईसीपी-एमएस विश्लेषण M9 ंयूनतम मीडिया की पुष्टि की संक्रमण धातु का स्तर उप micromolar रेंज में है (नहीं दिखाया गया है); इसलिए, संक्रमण धातुओं की केवल ंयूनतम मात्रा का पता लगाने के एक सफल अंश के बाद की उंमीद की जानी चाहिए । विश्लेषणात्मक भिन्नीकरण (चित्रा 5) radiometal परिवहन दरों को मापने और कार्यात्मक डेटा पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ६० मिनट periplasmic और ई. कोलाई कोशिकाओं के cytoplasmic भागों की तुलना में YfeA ही व्यक्त स्नैपशॉट, पूर्ण YfeABCDE ट्रांसपोर्टर और YfeABCDE घटकों में से कोई भी एक संयोजक प्रोटीन या एक व्यक्त करने के परिणाम से पता चलता है धातु के ऊपर प्रोटीन कॉंप्लेक्स (चित्रा 6) । ई. कोलाई कोशिकाओं कोई संयोजक प्रोटीन व्यक्त ५२Mn के लगभग आधे ले जाया periplasm में ंयूनतम प्रतिधारण के साथ कोशिका के लिए मीडिया को जोड़ा । यह नकारात्मक नियंत्रण अंतर्जात मैंगनीज परिवहन का प्रतिनिधित्व करता है । ई. कोलाई कोशिकाओं संयोजक YfeA व्यक्त की लगभग एक चौथाई ५२Mn के periplasm में एक और तिमाही के साथ बनाए रखा कोशिका के लिए मीडिया के लिए जोड़ा । कोशिका में periplasm और सीमित परिवहन में मैंगनीज प्रतिधारण चयापचय मांग और Yfe ट्रांसपोर्टर के अभाव में YfeA उत्पादन द्वारा लगाया टोंटी को दर्शाता है । ई. कोलाई कोशिकाओं संयोजक YfeABCDE ट्रांसपोर्टर एक्सप्रेस के लगभग १००% तक पहुंचाया ५२Mn periplasm में ंयूनतम प्रतिधारण के साथ कोशिका के लिए मीडिया को जोड़ा । कोशिका में संवर्धित मैंगनीज परिवहन मैंगनीज परिवहन में Yfe ट्रांसपोर्टर के योगदान को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्र 1. अंश द्वारा YfeA का शुद्धिकरण. Yfe ट्रांसपोर्टर के लिए ए. काल्पनिक मॉडल । B. एसडीएस-PAGE gel of YfeA शुद्धिकरण periplasm अंश से, आयनों विनिमय से रेखीय ग्रेडिएंट रेफरेंस का प्रयोग. एसडीएस-पृष्ठ जेल शुद्धि चरणों में YfeA (30 केडीए) के संवर्धन से पता चलता है । काला तीर YfeA के लिए electrophoretic प्रवास की स्थिति का अर्थ है । आणविक भार मानक सही पर दिखाया गया है । (१) Periplasm अंश. (2) Q आयनों एक्सचेंज कॉलम के माध्यम से प्रवाह । (३) क्यू आयनों एक्सचेंज कॉलम पीक रेफरेंस. (4) Superdex २०० पीजी जेल निस्पंदन कॉलम पीक । C. YfeA संवर्धन-अच्छा उदाहरण है । एसडीएस की छवि प्रसंस्करण- बी से पृष्ठ जेल densitometry द्वारा YfeA के समग्र संवर्धन का परिकलन करता है periplasmic अंश के 8% से जेल निस्पंदन उत्पाद के ६१% से वृद्धि हुई है । नीले बक्से संकेत YfeA/कुल densitometry गणना के लिए इस्तेमाल किया संकेत । जन स्पेक्ट्रोमेट्री लेन में बॉक्सिंग बैंड के विश्लेषण 4 पता लगाया 259/280 YfeA अमीनो एसिड, हरी हाइलाइट में प्रस्तुत किया । परिपक्व पॉलीपेप्टाइड में मौजूद एमिनो एसिड बोल्ड कैपिटल काले पाठ में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, और सट संकेत पेप्टाइड रचना अमीनो एसिड इटैलिक किए गए लोअरकेस धूसर पाठ में प्रस्तुत किया जाता है । D. YfeA संवर्धन-Bad उदाहरण । एसडीएस-PAGE जेल periplasm अंश से YfeA शोधन, आयनों एक्सचेंज से कदम ढाल रेफरेंस का उपयोग कर । एसडीएस-पृष्ठ जेल शुद्धीकरण चरणों में YfeA के संवर्धन से पता चलता है । काला तीर प्रमुख प्रोटीन contaminant के electrophoretic प्रवास की स्थिति आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के दौरान बढ़ाया । आणविक भार मानक सही पर दिखाया गया है । (1) Superdex २०० पीजी जेल निस्पंदन कॉलम पीक । (२) Q आयनों विनिमय स्तम्भ २५० मिमी NaCl कदम ढाल रेफरेंस. (३) Periplasm अंश. एसडीएस की छवि प्रसंस्करण- डी से पृष्ठ जेल densitometry द्वारा YfeA के सीमांत समग्र संवर्धन जेल निस्पंदन उत्पाद के 20% की एक अधिकतम करने के लिए गणना करता है । नीले बक्से संकेत YfeA/कुल densitometry गणना के लिए इस्तेमाल किया संकेत । मास स्पेक्ट्रोमेट्री लेन के बैंड चिह्नित में काला तीर द्वारा 1 की LivJ (३९ केडीए), EfeO के 25 यूनिक पेप्टाइड्स (४१ केडीए), और LivK (३९ केडीए) के 17 यूनिक पेप्टाइड्स का पता लगाया. सभी तीन दूषित periplasmic है ई. कोलाई SBPs. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. एपीओ YfeA और holo YfeA जेल छानने का chromatograms. काला तीर शूंय वॉल्यूम की स्थिति को नोट । जेल निस्पंदन चोटियों के लिए एपीओ YfeA (काला वक्र) और holo YfeA (नीली वक्र) एक ही रेफरेंस मात्रा में दोनों प्रोटीन राज्यों elute दिखाएँ, कि एपीओ YfeA periplasm अंश से शुद्ध एक समान hydrodynamic त्रिज्या के रूप में holo YfeA कुल से शुद्ध फ्रेंच प्रेस के बाद सेलुलर सामग्री ।

Figure 3
चित्र 3. एपीओ YfeA और holo YfeA क्रिस्टल morphologies. एक अखंड क्रिस्टल के रूप में Holo YfeA सघन, जबकि एपीओ YfeA आम तौर पर एक ही क्रिस्टलीकरण हालत में twinned क्रिस्टल का उत्पादन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एपीओ YfeA और holo YfeA एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा. ए. एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा holo YfeA कि कोई अतिरिक्त संक्रमण धातु पूरकता, हरे रंग की वक्र के साथ M9 न्यूनतम मीडिया से शुद्ध किया गया है. विशेषता चोटियों मैंगनीज, लोहा, और जस्ता के लिए लेबल कर रहे हैं । YfeBCDE के संदर्भ में उत्पादित YfeA नमूना से बीएक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा. विशेषता चोटियों मैंगनीज, लोहा, और जस्ता के लिए लेबल कर रहे हैं । नीला वक्र। एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के YfeA YfeBCDE और cytoplasmic संक्रमण धातुओं के न्यूनतम संदूषण और/या holo YfeA प्रोटीन के साथ periplasm अंश के सफल अंश के संदर्भ से शुद्ध । लाल वक्र। YfeA के एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा अत्यधिक lysis और cytoplasmic संक्रमण धातुओं और/या holo YfeA प्रोटीन के महत्वपूर्ण संदूषण से असफल अंश के साथ YfeBCDE के संदर्भ से शुद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. भिन्नीकरण के लिए सामान्यीकृत कार्यप्रवाह. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. ६० ंयूनतम रेडियोधर्मी धातु के ऊपर का हिस्सा डेटा । प्रत्येक प्रयोग तीन बार किया गया, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती हैं । लाल पट्टी। ई. कोलाई कोशिकाओं है कि Yfe ट्रांसपोर्टर परिवहन लगभग ~ ६० मिनट के बाद कोशिका में ५२Mn के ५०% शामिल नहीं है, और periplasmic ५२mn. नीली पट्टीके निंन स्तर को बनाए रखने । Yfe ट्रांसपोर्टर परिवहन से युक्त ई. कोलाई कोशिकाओं > ६० मिनट के बाद कोशिका में ५२Mn के 90% और periplasmic ५२mn. हरी पट्टीके निम्न स्तर को बनाए रखने. ई. कोलाई कोशिकाओं है कि केवल YfeA परिवहन लगभग ~ कोशिका में ५२mn के 25% और बनाए रखने ~ ६० मिनट के बाद periplasm में ५२mn के 25% ।

इस काम में प्रयुक्त radiometal, ५२Mn (t1/2 = ५.५९ d), UAB साइक्लोट्रॉन सुविधा (बर्मिंघम, अल) में एक प्राकृतिक सीआर लक्ष्य पर प्रोटॉन बमबारी द्वारा उत्पादन किया गया था, और शुद्ध के रूप में पहले की रिपोर्ट19। चेतावनी: ५२Mn एक पोजीट्रान उत्सर्जक है (β+औसत = २४२ कीव, २९.४%), और भी उच्च तीव्रता के साथ कई उच्च ऊर्जा गामा किरणों का उत्सर्जन करता है (Eγ = ७४४.२, ९३५.५, १४३४.० कीव; मैं = ९०.०%, ९४.५%, १००%) । इन कारणों के लिए, प्रयोग अलारा के विकिरण संरक्षण सिद्धांतों के बाद किया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर वर्णित है । सभी रेडियोधर्मी अपशिष्ट के रूप में नामित मदों उचित रूप से निहित होना चाहिए, स्पष्ट रूप से लेबल, और स्थापित प्रक्रियाओं के अनुसार छोड़ दिया ।

Discussion

सेल अंश विशेष रूप से एक सेलुलर डिब्बे की सामग्री की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है, और ऐसे धातु परमाणुओं के रूप में छोटे अणुओं को निकालने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, साथ ही अणुओं जैसे प्रोटीन । यह ध्यान देने योग्य है कि कोशिका भिन्नीकरण एक निरपेक्ष तकनीक नहीं है और मिश्रण करने के लिए सावधान ध्यान के बिना प्रवण त्रुटि हो सकता है लायक है/ अधूरा मिश्रण न्यूनतम झिल्लीदार lysis में परिणाम कर सकते हैं और इस प्रकार नगण्य भिन्नीकरण, कमरे के तापमान पर आंशिक cytoplasmic सामग्री के साथ periplasmic अंश के संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप दोनों झिल्ली की तेजी से lysis पैदा कर सकता है, और विस्तारित गर्मी बार भी अत्यधिक lysis में परिणाम कर सकते है और इस प्रकार भिंन संदूषण । कुशल और अपेक्षाकृत पूरा बाहरी झिल्ली lysis प्राप्त करने के लिए एक उचित समझौता (जबकि भीतरी झिल्ली के संरक्षण) hypotonic अंश बफर में बर्फ पर 20 मिनट की मशीन है । एक और विचार निष्कर्षण की विधि है, जहां मिलाते हुए या भंवर से कठोर निष्कर्षण इस तरह के प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण के रूप में निकालने की गुणवत्ता समझौता सकता है । यह पिपेट द्वारा रंग, उलटा या aspirating के रूप में धीरे मिश्रण करने के लिए अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता सामग्री बनाए रखने के लिए सिफारिश की है । preparative सेल भिन्नीकरण से शुद्धि के रूप में चर क्षमता के साथ हो सकता है चित्रा 1द्वारा सबूत । एक प्रयोग में, YfeA निकाले periplasmic सामग्री (चित्रा 1C) के 8% के रूप में शुरू हुआ, जबकि एक और प्रयोग में, YfeA periplasmic सामग्री (चित्रा 1 डी) के 17% के रूप में शुरू हुआ । इन मतभेदों को ऐसे चर अभिव्यक्ति की स्थिति के रूप में कई कारणों से उत्पंन कर सकते है (विकास मीडिया को जोड़ने के लिए EDTA Yfe प्रमोटर के फर विनियमन के रूप में भुखमरी तंत्र द्वारा विनियमित जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि कर सकते हैं), जमे हुए का उपयोग दोहराया स्थाई स्टॉक, और मानव त्रुटि । के बजाय मशीन समय समायोजन, यह पैमाने पर तैयारी की सिफारिश की है । periplasm अंश से शुद्धि आयनों विनिमय क्रोमेटोग्राफिक कदम से एक रैखिक ढाल रेफरेंस शामिल करने के लिए सिफारिश की है । एक कदम ढाल रेफरेंस एक रेफरेंस रणनीति का उपयोग करता है असतत और अचानक मोबाइल चरण संरचना में परिवर्तन (यानी, 0 mm NaCl, ५० mm NaCl, १५० mm NaCl, etc.) । एक रैखिक ढाल रेफरेंस एक रेफरेंस रणनीति है कि मोबाइल चरण संरचना में क्रमिक परिवर्तन का उपयोग करता है (यानी, 0 मिमी NaCl, 5 मिमी NaCl, 10 मिमी NaCl, आदि.). एक कदम ढाल अणुओं है कि स्थिर चरण के लिए विभिंन समानताएं है अलग करने के लिए उपयोगी है, और एक रैखिक ढाल रेफरेंस अणुओं है कि स्थिर चरण के लिए समान समानताएं है अलग करने के लिए उपयोगी है । कोई कृत्रिम शुद्धि टैग के साथ प्रोटीन शुद्ध करने के मामले में (स्टेशनरी चरण के लिए संबध को बढ़ाने के लिए) एक सेल डिब्बे कि अद्वितीय प्रोटीन प्रजातियों में समृद्ध है से, एक रैखिक ढाल रेफरेंस के लिए ब्याज की अलग प्रोटीन की सिफारिश की है कि हो सकता है ब्याज के प्रोटीन के रूप में स्थिर चरण के लिए समान समानताएं है । आम तौर पर, शुद्ध एपीओ YfeA के 1-2 मिलीग्राम की एक उपज संस्कृति के प्रत्येक लीटर से अपने अंतर्जात Y . pestis प्रमोटर से YfeA व्यक्त की उंमीद है ।

एक्स-रे प्रतिदीप्ति एक तकनीक है कि जांचकर्ता जल्दी से एक नमूना में धातु सामग्री का निर्धारण करने के लिए सक्षम बनाता है, और अप्रत्याशित धातु शामिल है कि अंयथा अज्ञात होगा के बारे में जांचकर्ता को सूचित करें । हालांकि EDTA hypertonic आंशिकीकरण बफर में शामिल करने के लिए ढीला-संबद्ध या मुक्त धातु, YfeA periplasm अंश से व्युत्पंन कुछ holo प्रोटीन शामिल कर सकते है हटा दिया जाता है । यह देखते हुए कि धातु परिवहन एक गतिशील प्रक्रिया है, शायद holo प्रोटीन सामग्री YfeA है कि अभी भी YfeBCDE के लिए अपने माल दान नहीं किया है से उत्पंन । यह ध्यान देने योग्य बात है कि एक्स-रे प्रतिदीप्ति केवल कुल धातु सामग्री के उपाय और संकेत नहीं है अगर धातु एक क्रिस्टल जाली, या विशेष रूप से एक प्रोटीन के लिए बाध्य में आदेश दिया है लायक है । धातु एक क्रिस्टल जाली में आदेश दिया है और/या विशेष रूप से एक प्रोटीन अणु के लिए बाध्य है, तो यह निर्धारित करने के लिए, एक्स-रे कैटरिंग डेटा संग्रह और प्रसंस्करण की आवश्यकता है । फिर भी, एक्स-रे प्रतिदीप्ति धातु संदूषण और/या अवशिष्ट holo प्रोटीन एकीकरण के त्वरित नमूना आकलन के लिए अनुमति देता है । सिंक्रोट्रॉन विकिरण समय सीमित है और वहाँ हमेशा हर नमूने पर एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए एक रणनीति ईजाद करने के लिए समय नहीं है, इस प्रकार एक्स-रे प्रतिदीप्ति कई क्रिस्टल स्क्रीनिंग और प्राथमिकता के लिए एक मूल्यवान तकनीक है जिसके लिए नमूने एक्स-रे कैटरिंग डेटा एकत्रित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, एक्स-रे प्रतिदीप्ति नमूने है कि एक्स-रे diffract नहीं हो सकता से डेटा संग्रह सक्षम बनाता है । जबकि एक्स-रे प्रतिदीप्ति डेटा का संग्रह, कई बार संकेत बहुत कमजोर हो सकता है और जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा जानकारीपूर्ण । सिग्नल की ताकत में सुधार करने के लिए, या तो एक्स-रे प्रतिदीप्ति या पागल स्कैनिंग के लिए, जोखिम समय बढ़ाने पर विचार और/या एक्स-रे बीम क्षीणन कम । एक नमूना एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए पहचान की है, यह एक्स-रे प्रतिदीप्ति और विकिरण क्षति को कम करने के लिए पागल स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था से नमूना के एक अलग भाग पर एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए सिफारिश की है, डेटा की गुणवत्ता में सुधार संग्रह, और असंगत संकेत की कमी के लिए किसी भी क्षमता को कम ।

रेडियोधर्मी अनुरेखकों का पता लगाने की आवश्यकता है nanomolar मात्रा या कम सामग्री, और आणविक ट्रैकिंग एजेंटों के रूप में इन अनुरेखकों का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच की एक सरल और अत्यधिक संवेदनशील विधि प्रदान करता है. ऊपर उल्लिखित radiometal परख के लिए कुल धातु का निर्धारण, सेलुलर डिब्बों में वितरण, साथ ही साथ की दरें निर्धारित किया जा सकता है । दरअसल, प्रत्येक डेटा समय बिंदु एक ४० मिनट भिन्नीकरण की आवश्यकता है; हालांकि, के रूप में हर समय बिंदु तक पहुंच गया है, कोशिकाओं को तुरंत गोली और उच्च नमक बफर में मशीन है (चित्रा 5, चरण 1) । मीडिया के Radiometal माप, उच्च नमक बफर छोड़ दिया (चित्रा 5, चरण 1), और periplasmic और cytoplasmic अंशों के बाद (चित्रा 5, चरण 3) उच्च नमक बफर मशीन सफलतापूर्वक सभी को हटा इंगित करता है शेष असंबद्ध मुक्त धातु है कि समय बिंदु तक पहुंचने के बाद शुरुआती केंद्रापसारक पीछा सुस्त । प्रारंभिक केंद्रापसारक हटाता है सबसे (अप करने के लिए ८०%) असंबद्ध मुक्त धातु, और उच्च नमक बफर में गर्मी के बाद केंद्रापसारक भी अतिरिक्त शेष असंबद्ध मुक्त धातु निकालता है । किसी भी सुस्ती असंबद्ध मुक्त धातु काफी ४० मिनट अंश के दौरान धातु परिवहन को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है. intracellular धातु परिवहन पर ४० मिनट के अंश का प्रभाव विवेकपूर्ण डेटा व्याख्या के लिए एक और विचार है । लगभग पूरे अंश प्रोटोकॉल बर्फ पर होता है, इसके अलावा कदम के बीच 30 दूसरा केंद्रापसारक से । धातु परिवहन समय पाठ्यक्रम प्रयोगों कि 4 ° c abrogates धातु परिवहन20,21,22पर कोशिकाओं को बनाए रखने का संकेत दिया है; इसलिए, क्योंकि प्रयोगों बर्फ पर होता है, ४० मिनट अंश काफी कोशिका के periplasm में धातु के स्तर को बढ़ाने के लिए उम्मीद नहीं है और धातु के स्तर पर समय बिंदुओं के प्रतिनिधि होने की उम्मीद कर रहे हैं, जिस पर कोशिकाओं थे शुरू में centrifugalized.

अलग सेलुलर डिब्बों में रिश्तेदार का दृढ़ संकल्प XFS डेटा को सूचित करने में मदद कर सकते हैं, एक सब्सट्रेट के शारीरिक प्रकृति पुष्टि के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक तंत्र के आणविक विवरण आगे जांच करने के लिए अन्वेषक सक्षम. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक mutagenesis के अतिरिक्त radiometal के लिए प्रयोगों के लिए एक सीधा तरीका प्रमुख कार्यात्मक अवशेषों या सब्सट्रेट परिवहन में शामिल अणुओं को सुदृढ़ करने के लिए प्रदान करता है । radiometal का लाभ उठाएं प्रयोगों और विश्लेषणों में तेजी से बदलाव, उच्च प्रवाह, उच्च reproducibility, और विकास की स्थिति और आनुवंशिक निर्माण की तुलना प्रयोगों के parallelization शामिल हैं ।

Disclosures

लेखक घोषणा करते है कि वे हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

डेटा भी जीएम/CA @ ए. पी., जो पूरे में या राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एसीबी-१२००२) और राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान संस्थान (एजीएम-१२००६) से संघीय धन के साथ भाग में वित्त पोषित किया गया है पर एकत्र किए गए । इस शोध के संसाधनों का इस्तेमाल उंनत फोटॉन स्रोत (ए पी एस), अमेरिका के एक ऊर्जा विभाग (डो) कार्यालय विज्ञान प्रयोक्ता सुविधा के Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा विज्ञान के डो कार्यालय के लिए संचालित के तहत अनुबंध सं । DE-AC02-06CH11357 । उंनत फोटॉन स्रोत का उपयोग अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, बेसिक ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अनुबंध सं के अंतर्गत द्वारा समर्थित किया गया । डब्ल्यू-31-109-अभियांत्रिकी-३८ ।

हम जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए UAB व्यापक कैंसर केंद्र-मास स्पेक्ट्रोमेट्री/प्रोटियोमिक् साझा सुविधा (P30CA13148-38) को स्वीकार करना चाहेंगे ।

C.D.R. विविधता, इक्विटी, और शामिल किए जाने के बर्मिंघम कार्यालय में अलबामा के विश्वविद्यालय से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । L.L.R. बर्मिंघम में अलबामा के विश्वविद्यालय के रेडियोलॉजी विभाग द्वारा समर्थन किया गया था । ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, आइसोटोप कार्यक्रम अनुदान DESC0015773 के तहत ५२Mn उत्पादन और A.V.F.M. का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore Fisher M1097270100
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) Fisher BP1760-5
AMRESCO M9 Medium Broth Fisher NC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReagents Fisher BP301-100
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) Fisher C79-500
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) Fisher D16-500
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) Fisher S311-100
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller Fisher BP1426-500
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) Fisher M63-500
Sodium Azide, White Powder Fisher BP922I-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher S271-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) Fisher S374-500
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) Fisher BP153-500
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cryschem Plate Hampton HR3-158
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Fisher UFC903024
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane Fisher SLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg Fisher 28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns Fisher 17-1154-01
Name Company Catalog Number Comments
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS Fisher 230280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
  2. Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
  3. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  4. Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
  5. Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
  6. Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
  7. Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
  8. McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
  9. Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
  10. Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
  11. Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
  12. Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
  13. Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
  14. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
  15. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  16. Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
  17. Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
  18. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
  19. Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
  20. Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
  21. Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
  22. Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).

Tags

रसायन विज्ञान अंक १३२ आंशिक Periplasm एक्स-रे प्रतिदीप्ति संक्रमण धातु सब्सट्रेट-बाइंडिंग प्रोटीन (एसबीपी) YfeA Yersinia pestis प्लेग ट्रेसर रेडियोधर्मिता
आवश्यक धातु ग्राम में अति-नकारात्मक बैक्टीरिया: एक्स-रे प्रतिदीप्ति, Radioisotopes, और सेल भिन्नीकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radka, C. D., Radford, L. L.,… More

Radka, C. D., Radford, L. L., Massicano, A. V. F., DeLucas, L. J., Lapi, S. E., Aller, S. G. Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation. J. Vis. Exp. (132), e57169, doi:10.3791/57169 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter