تطوير أجهزة موائع جزيئية لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في المساحات الصغيرة للغاية
Summary
يمكننا وصف أسلوب التحقيق في القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، تمديد عبر الفجوات ضيقة للغاية (~ 1 ميكرومتر) في جهاز موائع جزيئية.
Abstract
في فيفو، نصيحة زراعة الخلايا النباتية تحتاج إلى التغلب على سلسلة من الحواجز المادية؛ بيد أن الباحثين تفتقر إلى منهجية لتصور السلوك الخلوية في هذه الشروط التقييدية. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعنا دوائر النمو لنصيحة زراعة الخلايا النباتية التي تحتوي على سلسلة من الفجوات الضيقة، مايكرو ملفق (~ 1 ميكرومتر) في ركيزة بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS). هذه مادة شفافة تسمح للمستخدم بمراقبة العمليات استطالة نصيحة في الخلايا الفردية أثناء الاختراق ميكروجاب بالوقت الفاصل بين التصوير. باستخدام هذا البرنامج التجريبي، لاحظنا التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح كما أنهم توغلوا في ميكروجاب. ألقينا القبض على خلايا الحيوانات المنوية في أنبوب اللقاح والتغيرات الدينامية في شكل نواة النباتي المسمى فلوريسسينتلي خلال هذه العملية. وعلاوة على ذلك، أثبتنا قدرة جذر الشعر وبروتونيماتا موس على اختراق الفجوة 1 ميكرومتر. يمكن استخدامها لدراسة كيف الفردية الخلايا تستجيب لمسافات مقيدة فعلياً هذا المنهاج في المختبر ويمكن أن يوفر رؤى آليات النمو تلميح.
Introduction
بعد أن تنبت حبوب اللقاح على وصمة عار، تنتج كل الحبوب أنبوب اللقاح واحد يحمل الخلايا المنوية لخلية البويضة والخلية المركزية في أبل للتسميد مزدوجة. تمديد من خلال النمط أنابيب اللقاح وفي نهاية المطاف التوصل إلى ovule واسطة الاستشعار إشارات التوجيه متعددة على طول هذه الطريق1. أثناء الاستطالة، أنابيب اللقاح تواجه سلسلة من الحواجز المادية؛ المسار يحيل مليء بالخلايا، ويجب إدخال اللقاح أنابيب دقيقة فتح ميكروبيلار أبل للوصول إلى تلك المستهدفة (الشكل 1A)2. ولذلك، يجب أن يكون لديك أنابيب اللقاح القدرة على اختراق الحواجز المادية، مع التغاضي عن إجهاد ضاغطة من البيئة المحيطة بهم. الشعر الجذر هي نوع آخر من تلميح زراعة الخلايا النباتية التي يجب أن تحمل العقبات المادية في البيئة، وفي شكل جسيمات التربة معبأة (الشكل 1B).
وقد درست مختلف الخصائص الميكانيكية للأنبوب حبوب اللقاح، بما في ذلك ضغط تورم وتصلب المنطقة قمي للخلية، والتي يمكن قياسها باستخدام3،بلاسموليسيس وليدة الأسلوب4 ومجهر القوة الخلوية (CFM) 5 , 6، على التوالي. ومع ذلك، هذه الأساليب وحدها لا تكشف عما إذا كانت أنابيب اللقاح قادرون على التمطيط من خلال الحواجز المادية على طول مسارات النمو. هو أسلوب بديل يتيح استطالة أنبوب اللقاح المرصودة في فيفو مجهرية فوتون اثنين7. ومع ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، من الصعب مراقبة التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح الفردية العميقة داخل الأنسجة أبل. بالإضافة إلى ذلك، نمو الشعر الجذر في التربة يمكن تصور استخدام الأشعة السينية حسبت التصوير المقطعي (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)8، أن كان ذلك مع دقة منخفضة. نقدم هنا، طريقة التي يمكن استخدامها للحصول على صور عالية الاستبانة لعملية تشوه لإحدى الخلايا في مجهر التقليدي.
والهدف العام للأسلوب الموصوفة هنا هو تصور قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، في مساحات صغيرة للغاية. كما ميكروديفيسيس بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS) قدم في هذه المخطوطة شفافة بصريا، والهواء نفاذية، يمكننا الثقافة الخلايا الحية داخل الجهاز ومراقبة سلوكهم النمو تحت مجهر. من الممكن أيضا لإنشاء الصغير ~ ممنوع مقياس نانومتر ب تقنية الطباعة الحجرية الناعمة9 باستخدام قوالب. هذه الميزات السماح لنا لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في بيئة محصورة فعلياً.
في هذا العمل، نحن شيدت 1 ميكرومتر فجوات واسعة (4 ميكرومتر في الطول) في أجهزة موائع جزيئية وفحص قدرة أنابيب اللقاح على اختراق هذه العقبات المصطنعة التي أصغر بكثير من قطر أنبوب أسطواني حبوب اللقاح (حوالي 8 ميكرومتر). هذا منصة تجريبية تمكننا من تصور ردا على أنبوب اللقاح إلى ميكروجابس والتقاط الصور الوقت الفاصل بين الاستجابة، التي تتبع عملية التشوه للخلية. كما وضعنا أيضا ميكروديفيسيس التي يمكن استخدامها للتحقيق في القدرة على اختراق جذر الشعر وبروتونيماتا موس. ميكروديفيسيس عدة وردت حتى الآن تمكن من التصور من الجذر10،11،،من1213 وموس بروتونيماتا14 نمو النبات بدقة عالية. لدينا جهاز، سلسلة من القنوات نمو الشعر الجذر عمودياً متصلاً بدائرة نمو الجذري، وتسترشد كل جذر الشعر (حوالي 7 ميكرومتر في القطر) إلى قنوات فلويديك مع وجود فجوة واسعة 1 ميكرومتر. ونحن أيضا مثقف موس بروتونيماتا (حوالي 20 ميكرومتر في القطر) في ميكروديفيسي التي تحتوي على ميكروجابس للنظر في ردودهم على هذه الحواجز المادية. النهج القائم على موائع جزيئية المقترح الذي يسمح لنا باستكشاف قدرة مختلف نصيحة زراعة الخلايا النباتية على تمديد من خلال المساحات الصغيرة للغاية، لا يمكن دراستها بأي طريقة أخرى متاحة حاليا.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول يلزم اتباعها الضبط للحصول على النتائج المعروضة أعلاه. أولاً، السطوح PDMS الطبق أسفل طبقة والزجاج كلاهما يتعين علاجها بالبلازما لمدة كافية من الوقت قبل الربط. خلاف ذلك، قد فصل طبقة PDMS محلياً من سطح الزجاج بينما تعبر نصيحة زراعة الخلايا في ميكروجابس. آخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر تسوتسوي حاء ودال كوريهارا لتزويدنا بالنباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك خط ت. fournieriRPS5Ap::H2B-تدتوماتو وخط التمويل ألف-UBQ10pro::H2B-مكلوفير ، على التوالي. وأيد هذا العمل بالمعهد تحويلي بيو-الجزيئات جامعة ناغويا و “اليابان متقدمة شبكة علوم النبات”. وقدمت الدعم المالي لهذا العمل بالمنح من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا (منح المشروع ايراتو لا. JPMJER1004 ل T.H.)، معونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة (غ. JP16H06465 و JP16H06464 ل T.H.)، و “الجمعية اليابانية” لمعونة النهوض بالعلوم (JSPS) “البحوث الاستكشافية” الصعبة (منحة رقم 26600061 لنيويورك ومنحة رقم 25650075 و 15 ك 14542 Y.S.).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
