Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes
Summary
Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.
Abstract
In vivo, tip groeiende plantencellen moeten overwinnen van een aantal fysieke belemmeringen; onderzoekers ontbreekt echter de methodologie om te visualiseren van cellulaire gedrag in dergelijke beperkende voorwaarden. Om dit probleem te verhelpen, hebben we groei kamers voor tip groeiende plantencellen die een aantal smalle, micro-verzonnen lacunes (~ 1 µm bevatten) in een poly-dimethylsiloxane (PDMS) substraat. Deze transparante materiaal zorgt voor de gebruiker te volgen uiteinde rek processen in afzonderlijke cellen tijdens microgap penetratie door time-lapse imaging. Met behulp van deze experimenteel platform, waargenomen wij morfologische veranderingen in stuifmeel buizen als ze de microgap doorgedrongen. We veroverde de dynamische veranderingen in de vorm van een fluorescently geëtiketteerde vegetatieve kern en zaadcellen in een stuifmeel buis tijdens dit proces. Bovendien, we toonden de mogelijkheden van de root haren en mos protonemata te dringen de 1 µm-kloof. Dit platform in vitro kan worden gebruikt om te bestuderen hoe individuele cellen reageren op fysiek beperkte ruimten en kan inzicht verwerven in de mechanismen van de tip-groei.
Introduction
Nadat stuifmeel korrels op een stigma ontkiemen, produceert elke graan een enkele stuifmeel buis dat zaadcellen de eicel en de centrale cel in de zaadknop voor double bevruchting draagt. Stuifmeel buizen elongate door middel van de stijl en uiteindelijk het bereiken van de zaadknop door het aftasten van meerdere begeleiding signalen langs hun manier1. Tijdens de rek tegenkomen stuifmeel buizen een aantal fysieke belemmeringen; de verzendende track is gevuld met cellen, en pollen buizen moet invoeren de minieme micropylar opening van de zaadknop te bereiken hun doel (figuur 1A)2. Stuifmeel buisjes moeten daarom de mogelijkheid om te penetreren fysieke obstakels, terwijl het gedogen van de drukspanning uit hun omgeving. Root haren zijn een ander soort tip groeiende plant cel die moet bestand zijn tegen fysieke obstakels in de omgeving, in de vorm van verpakte gronddeeltjes (figuur 1B).
Diverse mechanische eigenschappen van het stuifmeel buis zijn bestudeerd, met inbegrip van turgor druk en stijfheid van de apicale regio van de cel, die kan worden gemeten met behulp van de beginnende Plasmolyse methode3,4 en cellulaire kracht microscopie (CFM) 5 , 6, respectievelijk. Echter, deze methoden alleen niet onthullen of stuifmeel buizen staat grondvlak via fysieke barrières langs hun groei paden zijn. Een alternatieve techniek waarmee stuifmeel buis rek gecontroleerde in vivo is twee foton microscopie7. Met deze methode, het is echter moeilijk te observeren de morfologische veranderingen in individuele stuifmeel buizen diep in het weefsel van de zaadknop. Bovendien kan root haargroei in de bodem worden gevisualiseerd met behulp van X-ray berekend tomografie (CT) en magnetic resonance imaging (MRI)8, zij het met een lage resolutie. Hier presenteren we een methode die kan worden gebruikt voor het verwerven van resolutieafbeeldingen van deformatieproces in van een cel op een conventionele Microscoop.
Het algemene doel van de hier beschreven methode is om te visualiseren de rek mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, in uiterst kleine ruimtes. Zoals de microdevices van de poly-dimethylsiloxane (PDMS) gepresenteerd in dit manuscript optisch transparant zijn en door de lucht permeabele, we kunnen cultuur van levende cellen binnen in het apparaat en observeren van het gedrag van hun groei onder een microscoop. Het is ook mogelijk te maken van micro ~ nanometer schaal ruimten door de zachte lithografie techniek9 met het gebruik van mallen. Deze functies laten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen tip-groeien in een fysiek afgesloten omgeving.
In dit werk, we gebouwd 1 µm breed lacunes (4 µm in hoogte) in microfluidic apparaten en de mogelijkheid van stuifmeel buizen te dringen deze kunstmatige obstakels die veel kleiner dan de diameter van de cilindrische stuifmeel buis (ongeveer 8 µm zijn) onderzocht. Dit experimenteel platform ons in staat stelt om te visualiseren de stuifmeel buis van reactie op microgaps en vastleggen van time-lapse beelden van de reactie, die van de cel vervorming proces volgen. Ook ontwikkelden we de microdevices die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de mogelijkheden van de penetratie van root haren en mos protonemata. Verschillende microdevices hebben gemeld tot nu toe waarmee de visualisatie van plant10,11,12,13 en moss protonemata14 wortelgroei met hoge resolutie. In onze apparaat, een reeks van root haar groei kanalen loodrecht op een root groei kamer zijn aangesloten en individuele root haren (ongeveer 7 µm in diameter) worden geleid tot fluidic kanalen met een 1 µm breed opening. Wij ook gekweekt moss protonemata (ongeveer 20 µm in diameter) in een microdevice met microgaps te onderzoeken hun reacties op deze fysieke barrières. De voorgestelde microfluidic gebaseerde aanpak laat ons toe om verkennen van de mogelijkheid van verschillende tip groeiende plantencellen om te rekken door zeer kleine ruimtes, die door een andere beschikbare methode kunnen niet worden onderzocht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende kritische stappen in het protocol moeten worden gevolgd om juist te verkrijgen van de resultaten van bovenstaande. Eerst, de PDMS laag en glazen bodem schotel oppervlakken moeten beide worden behandeld met plasma voor een voldoende hoeveelheid tijd voordat hechting. Anders kan de PDMS laag lokaal losmaken van het glasoppervlak terwijl tip groeiende cellen zijn het overschrijden van de microgaps. Een andere cruciale stap in het haar van de wortel en moss protonemata-protocol is de sterilisatie van de microde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken H. Tsutsui en D. Kurihara voor ons te voorzien van transgene planten, met inbegrip van de T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn en de lijn van A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Instituut van transformatieve Bio-moleculen van Nagoya University en het Japan geavanceerde Plant Science netwerk. Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project verlenen neen. JPMJER1004 voor T.H.), een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP16H06465 en JP16H06464 voor T.H.), en Japan maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grants-in-Aid voor uitdagende verkennend onderzoek (subsidie no. 26600061 voor N.Y. en grant nos. 25650075 en 15 K 14542 voor aan).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
