Microfluidic उपकरणों का विकास अत्यंत छोटे रिक्त स्थान में टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं की बढ़ाव क्षमता का अध्ययन करने के लिए
Summary
हम एक microfluidic डिवाइस में अत्यंत संकीर्ण अंतराल (~ 1 µm) के माध्यम से बढ़ाव करने के लिए, पराग ट्यूबों, जड़ बाल, और काई protonemata सहित टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं की क्षमता की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
vivo में, टिप-बढ़ती संयंत्र कोशिकाओं को शारीरिक बाधाओं की एक श्रृंखला पर काबू पाने की जरूरत है; हालांकि, शोधकर्ताओं ने इस तरह के प्रतिबंधात्मक शर्तों में सेलुलर व्यवहार कल्पना करने के लिए पद्धति की कमी है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक पाली-dimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट में संकीर्ण, सूक्ष्म गढ़े अंतराल की एक श्रृंखला (~ 1 µm) होते हैं कि टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं के लिए विकास कक्षों विकसित किया है. इस पारदर्शी सामग्री उपयोगकर्ता समय चूक इमेजिंग द्वारा microgap प्रवेश के दौरान व्यक्तिगत कोशिकाओं में टिप बढ़ाव प्रक्रियाओं पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है । इस प्रायोगिक मंच का प्रयोग, हम पराग ट्यूबों में रूपात्मक परिवर्तन मनाया के रूप में वे microgap प्रवेश । हम इस प्रक्रिया के दौरान एक पराग ट्यूब में एक फ्लोरोसेंट लेबल वनस्पति नाभिक और शुक्राणु कोशिकाओं के आकार में गतिशील परिवर्तन पर कब्जा कर लिया । इसके अलावा, हम जड़ बाल और काई protonemata की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए 1 µm अंतर घुसना । इस में इन विट्रो मंच का अध्ययन कैसे व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से विवश रिक्त स्थान का जवाब और टिप में अंतर्दृष्टि विकास तंत्र प्रदान कर सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
पराग अनाज एक कलंक पर उगना के बाद, प्रत्येक अनाज एक एकल पराग ट्यूब है कि अंडा सेल के लिए शुक्राणु कोशिकाओं और डबल निषेचन के लिए बीजांड में केंद्रीय सेल वहन करती है । पराग ट्यूब शैली के माध्यम से बढ़ाव और अंततः उनके रास्ते1के साथ कई मार्गदर्शन cues संवेदन द्वारा बीजांड तक पहुंचने । बढ़ाव के दौरान, पराग ट्यूबों शारीरिक बाधाओं की एक श्रृंखला का सामना; प्रसारण ट्रैक कोशिकाओं से भरा है, और पराग ट्यूबों बीजांड के मिनट micropylar खोलने के लिए अपने लक्ष्य तक पहुंचने के लिए दर्ज करना होगा (चित्र 1a)2। इसलिए, पराग ट्यूबों शारीरिक बाधाओं घुसना करने की क्षमता है, जबकि अपने परिवेश से संपीड़न तनाव सहन करना चाहिए । रूट बाल टिप के एक अंय प्रकार के संयंत्र सेल है कि पर्यावरण में शारीरिक बाधाओं का सामना कर रहे हैं, पैक्ड मिट्टी कणों के रूप में कर रहे है (आंकड़ा 1b) ।
पराग ट्यूब के विभिन्न यांत्रिक गुणों का अध्ययन किया गया है, जिसमें कोशिका के शिखर क्षेत्र का turgor दाब और अकड़न शामिल है, जिसे प्रारंभिक plasmolysis विधि3,4 और सेलुलर बल माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करके मापा जा सकता है CFM) 5 , 6, क्रमशः । हालांकि, इन तरीकों अकेले पता चलता है कि पराग ट्यूबों उनके विकास के रास्तों के साथ शारीरिक बाधाओं के माध्यम से बढ़ाव के लिए सक्षम हैं नहीं है । एक वैकल्पिक तकनीक है कि पराग ट्यूब बढ़ाव vivo में निगरानी की अनुमति देता है दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी7है । हालांकि, इस विधि के साथ, यह व्यक्तिगत पराग बीजांड ऊतक के अंदर गहरी ट्यूबों में रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है । इसके अतिरिक्त, मिट्टी में जड़ बाल विकास एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (सीटी) और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)8का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है, हालांकि कम संकल्प के साथ । यहां, हम एक विधि है कि एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर एक कोशिका के विरूपण प्रक्रिया के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वर्तमान ।
विधि का समग्र लक्ष्य यहां वर्णित है टिप की बढ़ाव क्षमता-पराग ट्यूबों, जड़ बाल, और काई protonemata, अत्यंत छोटे रिक्त स्थान में शामिल संयंत्र कोशिकाओं, कल्पना है । के रूप में पाली-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices इस पांडुलिपि में प्रस्तुत ऑप्टिकली पारदर्शी और हवा पारगंय हैं, हम संस्कृति डिवाइस के अंदर रहने वाले कोशिकाओं और एक खुर्दबीन के नीचे उनके विकास के व्यवहार का निरीक्षण कर सकते हैं । यह भी मोल्ड के उपयोग के साथ नरम लिथोग्राफी तकनीक9 द्वारा माइक्रो ~ नैनोमीटर पैमाने पर रिक्त स्थान बनाने के लिए संभव है । इन सुविधाओं को हम एक शारीरिक रूप से सीमित वातावरण में टिप बढ़ती संयंत्र कोशिकाओं की बढ़ाव क्षमता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं ।
इस काम में, हम microfluidic उपकरणों में 1 µm चौड़े अंतराल (ऊंचाई में 4 µm) का निर्माण और पराग ट्यूबों की क्षमता की जांच करने के लिए इन कृत्रिम बाधाओं कि बेलनाकार पराग ट्यूब के व्यास से बहुत छोटे है घुसना (लगभग 8 µm) । इस प्रायोगिक मंच हमें microgaps और प्रतिक्रिया है, जो सेल के विरूपण प्रक्रिया को ट्रैक की समय चूक छवियों को पकड़ने के लिए पराग ट्यूब की प्रतिक्रिया कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है । हम भी microdevices कि जड़ बाल और काई protonemata की पैठ क्षमता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है । कई microdevices तिथि करने के लिए सूचित किया गया है कि संयंत्र जड़10,11,12,13 और काई उच्च संकल्प पर14 विकास protonemata के दृश्य सक्षम करें । हमारे डिवाइस में, रूट बाल विकास चैनलों की एक श्रृंखला सीधा एक रूट विकास कक्ष से जुड़े हैं, और व्यक्तिगत जड़ बाल (व्यास में लगभग 7 µm) एक 1 µm चौड़ी खाई के साथ द्रवित चैनलों के लिए निर्देशित कर रहे हैं । हम भी एक microgaps युक्त microdevice में काई protonemata (लगभग 20 µm व्यास में) इन शारीरिक बाधाओं को अपनी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए कल्चरल । प्रस्तावित microfluidic आधारित दृष्टिकोण हमें विभिन्न टिप की क्षमता का पता लगाने के लिए संयंत्र कोशिकाओं को अत्यंत छोटे रिक्त स्थान है, जो किसी भी अन्य वर्तमान में उपलब्ध विधि द्वारा जांच नहीं की जा सकती के माध्यम से बढ़ाव की अनुमति देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम ठीक ऊपर प्रस्तुत परिणाम प्राप्त करने के लिए पीछा किया जा करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, PDMS परत और ग्लास नीचे पकवान सतहों दोनों संबंध पहले समय की एक पर्याप्त राशि के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ट्रांसजेनिक पौधों के साथ हमें प्रदान करने के लिए एच Tsutsui और डी Kurihara का धन्यवाद करते हैं, जिसमें क्रमशः टी. fournieriRPS5Ap:: H2B-tdTomato रेखा और ए. थालियाना UBQ10pro:: H2B-mClover रेखा शामिल हैं । यह काम परिवर्तनकारी जैव नागोया विश्वविद्यालय के अणुओं और जापान उंनत संयंत्र विज्ञान नेटवर्क के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । इस कार्य के लिए वित्तीय सहायता जापान विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी एजेंसी (ERATO परियोजना अनुदान सं. से अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी । JPMJER1004 for T.H.), नवीन क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता (नग. JP16H06465 और JP16H06464 T.H. के लिए), और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) अनुदान में सहायता के लिए चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान (अनुदान सं २६६०००६१ N.Y. के लिए और अनुदान के लिए २५६५००७५ और 15K14542 के लिए Y.S.) ।
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
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