非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発
Summary
ルート毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の機能を調査し、マイクロ流体デバイス (〜 1 μ m) の非常に狭い隙間を延長する原糸をコケについて述べる。
Abstract
生体内で、植物細胞の先端成長は一連の物理的な障壁を克服するために必要があります。しかし、研究者は、このような制限の厳しい条件下での細胞挙動を可視化する方法論を欠いています。この問題に対処するためポリ ジメチルシロキサン (PDMS) 基板で、微細加工の狭いギャップ (〜 1 μ m) のシリーズを含む先端成長の植物細胞の培養室内で開発しました。この透明な材料では、タイムラプス イメージングによるギャップ浸透中に個々 の細胞における先端伸長プロセスを監視することができます。この実験のプラットフォームを使用して、彼らが侵入、ギャップとして花粉管の形態変化が観察。このプロセス中には、蛍光に分類された栄養核の形状の動的変化と花粉管内の精子細胞を捕獲しました。さらに、我々 は 1 μ m ギャップを貫通する根毛とコケ原糸体の機能を示した。この体外プラットフォームは物理的に制約された空間にどのように個々 の細胞応答を研究に使用することができ、先端成長メカニズムに洞察力を提供する可能性があります。
Introduction
柱頭に花粉が発芽後、各結晶粒は卵細胞と中央細胞二重受精胚珠内に精子細胞を運ぶ 1 つの花粉管を生成します。花粉管は細長いスタイルを通じて、最終的にその方法1に沿って複数指導の手がかりを感知して胚珠に到達します。延長の間に花粉管発生一連の物理的な障壁。送信トラックは細胞と花粉管が彼らのターゲット (図 1 a)2に到達する胚珠の分の珠孔開口部を入力してください。したがって、花粉管には、自分の周囲から圧縮応力を許容しながら、物理的な障害を貫通する能力が必要です。根毛は詰められた土粒子 (図 1 b) の形式で、環境の物理的な障害に耐える必要がありますヒント成長の植物細胞の別のタイプです。
花粉管の各種力学的性質が研究されている、膨圧と初期原形質分離方法3,4と細胞の顕微鏡を使用して測定することができます細胞の頂部の剛性などを含む(CFM)5,6、それぞれ。ただし、これらの方法を単独で花粉管が伸長成長軌道に沿って物理障壁をことができるかどうかは公表しません。監視されている体内に花粉管伸長を可能にする方法は、2 光子顕微鏡7です。ただし、この方法では、個々 の花粉管の形態学的変化を観察することは困難だ胚珠組織の奥深く。さらに、土壌の根毛成長視覚化できます x 線断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)8を使用して低解像度ではあります。従来の顕微鏡で細胞の変形過程の高解像度の画像を取得する方法を紹介します。
ここで説明したメソッドの全体的な目標は、根毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の伸長機能を視覚化し、コケ原糸体、非常に小さなスペースにすることです。本稿で提示ポリ-新規 PDMS マイクロ光学的に透明な空気し透水性、デバイス内部の生きている細胞の培養ができ、顕微鏡下で生育過程を観察します。また、マイクロを作成することが可能だ 〜 金型の使用ソフト ・ リソグラフィー技術9ナノメートル スケール スペース。これらの機能は、物理的に限られた環境での植物細胞の先端成長の伸び能力を研究することを許可します。
この作品は、マイクロ流体デバイスの 1 μ m の広いギャップ (高さ 4 μ m) を構築し、円筒の花粉管 (約 8 μ m) の直径よりもはるかに小さいこれらの人工の障害物を貫通する花粉管の能力を検討しました。この実験のプラットフォームは、私たち microgaps に花粉管の応答を可視化し、細胞の変形過程を追跡する、応答の時間経過の画像をキャプチャできます。根毛とコケ原糸体の浸透能力を調査するため使用することができますマイクロ デバイスを開発しました。いくつかのマイクロ デバイスは、ルート10、11,12,13とコケ原糸体14生育高解像度での可視化を有効にする日付を報告されています。我々 のデバイスでルート成長室一連の根毛成長チャネルは垂直で個々 のルート毛 (直径約 7 μ m) は、1 μ m のワイド ギャップと流路に導かれています。モスも培養を行ったこれらの物理的な障壁への応答を調べる microgaps を含むマイクロ デバイスの原糸体 (直径約 20 μ m)。提案マイクロ ベースのアプローチでは、他の現在利用可能な方法で検査することはできません非常に小さなスペースを延長する様々 なヒント成長植物細胞の機能を探索することが出来ます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルのいくつかの重要な手順は、上記に示した結果を得るために正確に続くことに必要があります。まず、PDMS 層およびガラス底皿の表面両方扱われなければならないプラズマ接合前に、の時間の十分な量の。それ以外の場合、先端成長のセルは、microgaps を交差させている間、ガラス面から PDMS 層可能性がありますデタッチ ローカル。根毛とコケ原糸体のプロトコルの別の重要なステ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato線、シロイヌナズナ UBQ10pro::H2B mClover線をそれぞれ含むトランスジェニック植物をご提供する、h. 筒井と + 栗原に感謝します。この作業によって、研究所のトランスフォーマティブ生命分子の名古屋大学と日本高等植物科学ネットワークに対応しました。この仕事のための財政支援は、日本科学技術振興機構からの補助金によって提供された (ERATO プロジェクト許可なし。T. h. の JPMJER1004)、革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP16H06465 と t. h. のための JP16H06464)、挑戦的萌芽研究 (25650075, 15 K 14542 ニューヨークとグラント番のグラント号 26600061 ある) の科学振興費の日本社会。
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
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