Utviklingen av Microfluidic enheter å studere forlengelse evnen til tips voksende anlegget celler i svært små områder
Summary
Vi beskriver en metode for å undersøke evnen til tips voksende anlegget celler, inkludert pollen rør, rot hår, og moss protonemata, til å forlenge gjennom svært smale åpninger (~ 1 µm) i en microfluidic enhet.
Abstract
I vivo, tips voksende anlegget celler må overvinne en rekke fysiske barrierer; men mangler forskere metodikk for å visualisere mobilnettet atferd i slike restriktive. For å løse dette problemet, har vi utviklet vekst kammer for tips voksende anlegget celler som inneholder en rekke smale, mikro-fabrikkert hull (~ 1 µm) i en poly-dimethylsiloxane (PDMS)-underlaget. Dette transparent materiale lar brukeren overvåke tips forlengelse prosesser i enkeltceller under microgap penetrasjon av tidsinnstilt bildebehandling. Bruke denne eksperimentelle plattform, observerte vi morfologiske endringer i pollen rør som de trengte microgap. Vi fanget de dynamiske endringene i form av en fluorescently merket vegetative kjerne og sædceller i et pollen rør under denne prosessen. Videre vist vi evnen til rot hår og moss protonemata å trenge 1 µm gapet. Denne i vitro plattformen kan brukes til å studere hvordan individuelle celler svare på fysisk begrensede områder og gir innsikt i tips-vekst mekanismer.
Introduction
Når pollen korn spire på et stigma, produserer hver korn et enkelt pollen rør som bærer sædceller eggcelle og sentrale cellen i ovule for dobbel befruktning. Pollen rør forlenge gjennom stilen og til slutt komme til ovule ved sensing flere veiledning signaler langs deres måte1. Under elongation møter pollen rør en rekke fysiske barrierer; overfører sporet er fylt med celler, og pollen rør må angi minutt micropylar åpning av ovule å nå sine mål (figur 1A)2. Derfor må pollen rør ha muligheten til å trenge fysiske hindringer, mens tolerer kompresjons stress fra omgivelsene. Rothår er en annen type tips voksende anlegget celle som må tåle fysiske hindringer i miljøet, i form av pakket jordpartikler (figur 1B).
Ulike mekaniske egenskaper av pollen røret har blitt studert, inkludert turgor press og stivhet av cellens apikale regionen, som kan måles med begynnende plasmolysis metode3,4 og mobilnettet force mikroskopi (CFM) 5 , 6, henholdsvis. Men avslører metodene alene ikke om pollen rør kan elongating gjennom fysiske barrierer langs vekst banene. En alternativ teknikk som gjør at pollen tube forlengelse overvåket i vivo er to Foton mikroskopi7. Men med denne metoden, er det vanskelig å observere de morfologiske endringene i individuelle pollen rør dypt inne ovule vev. I tillegg kan rot hårvekst i jord visualiseres ved hjelp av X-ray beregnet tomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI)8, men med lav oppløsning. Her presenterer vi en metode som kan brukes til å hente høyoppløselige bilder av en celle deformasjon prosessen på konvensjonell mikroskop.
Det overordnede målet med metoden beskrevet her er å visualisere forlengelse evnen til tips voksende anlegget celler, inkludert pollen rør, rot hår, og moss protonemata, i svært små områder. Poly-dimethylsiloxane (PDMS) Micro Devices presentert i dette manuskriptet er optisk gjennomsiktige og luft gjennomtrengelig, vi kanne kulturen levende celler inne i enheten og observere virkemåtene vekst under et mikroskop. Det er også mulig å opprette mikro ~ nanometer skala spaces av myke litografi teknikk9 med bruk av formene. Disse funksjonene tillater oss å studere forlengelse evnen til tips voksende anlegget celler i et fysisk begrenset miljø.
I dette arbeidet vi bygget 1 µm bredt hull (4 µm i høyden) i microfluidic enheter og undersøkt muligheten for pollen rør å trenge disse kunstige hindringer som er mye mindre enn diameteren på sylindriske pollen røret (ca 8 µm). Denne eksperimentelle plattformen kan vi visualisere pollen rørets svar på microgaps og ta time-lapse bilder i svaret, som sporer cellens deformasjon prosessen. Vi har også utviklet Micro Devices som kan brukes til å undersøke gjennomtrenging evne av rot hår og moss protonemata. Flere Micro Devices er rapportert hittil at visualisering av rot10,11,12,13 og moss protonemata14 plantevekst i høy oppløsning. I vår enhet, en rekke rot hår vekst kanaler er vinkelrett koblet til en rot vekst kammer og personlige rot hår (ca 7 µm i diameter) er guidet til fluidic kanaler med en 1 µm bred hullet. Vi også kultivert moss protonemata (ca 20 µm i diameter) i en microdevice som inneholder microgaps for å undersøke sine svar på disse fysiske barrierer. Den foreslåtte microfluidic tilnærmingen tillater oss å utforske evnen til ulike tips voksende anlegget celler til å forlenge gjennom svært små områder, som ikke kan undersøkes med andre tilgjengelige metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere kritiske trinn i protokollen må følges nøyaktig for å få resultatene presentert ovenfor. Først må PDMS lag og glass bunnen rett overflater begge behandles med plasma en tilstrekkelig mengde tid før bånd. Ellers løsne PDMS laget lokalt fra glassplaten mens spissen voksende celler er krysset av microgaps. Et viktig skritt i roten håret og moss protonemata protokollen er sterilisering av microdevice. Normalt må rot hår og moss protonemata cellene være dyrket i microdevice for et par uker. Uten steriliser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker H. Tsutsui og D. Kurihara for å gi oss med transgene planter, inkludert T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -linjen og linjen A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for Transformative Bio-molekylene i Nagoya University og Japan avansert Plant Science nettverket. Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av tilskudd fra Japan vitenskap og teknologi Agency (ERATO prosjektstøtte nei. JPMJER1004 for th), en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (Nos. JP16H06465 og JP16H06464 for th), og Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) Grants-in-Aid for utfordrende utforskende forskning (grant nr. 26600061 for N.Y. og grant nr. 25650075 og 15 K 14542 for utleid).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
