Разработка Microfluidic приборы для изучения удлинение возможности Tip выращивания растительных клеток в чрезвычайно малых пространств
Summary
Мы опишем способ исследовать возможности растущего кончика растительных клеток, включая пыльцы трубы, корневые волоски и Мосс protonemata, чтобы растянуть через чрезвычайно узкие щели (~ 1 мкм) в устройство microfluidic.
Abstract
В естественных условиях, подсказка выращивания растительных клеток необходимо преодолеть целый ряд физических барьеров; Однако исследователи отсутствие методологии для визуализации клеточных поведение таких ограничительных условий. Для решения этой проблемы, мы разработали роста камеры для растущего кончика растительных клеток, которые содержат ряд узких, микро сфабрикованы пробелов (~ 1 мкм) в субстрате поли dimethylsiloxane (PDMS). Этот прозрачный материал позволяет пользователю контролировать кончик удлинение процессы в отдельных клетках во время проникновения микро покадровой изображений. С помощью этой экспериментальной платформы, мы наблюдали морфологические изменения в пыльцы трубы, как они проникли микро. В ходе этого процесса мы захватили динамические изменения в форме дневно обозначенные вегетативные ядра и сперматозоиды в пробирке пыльцы. Кроме того мы продемонстрировали возможности корневой волосы и protonemata мох проникнуть 1 мкм разрыв. Эта платформа в vitro могут быть использованы для изучения как отдельные клетки реагируют на физически ограниченного пространства и может обеспечить понимание механизмов Совет роста.
Introduction
После того, как зерна пыльцы прорастают на клеймо, каждое зерно производит один пыльцы труба, которая несет сперматозоиды яйцеклетка и центральная ячейка в яйцеклетку для Двойное оплодотворение. Пыльца трубы удлиненное через стиль и в конечном итоге достичь яйцеклетку путем зондирования несколько указания подсказки вдоль их способ1. Во время удлинения пыльца трубы сталкиваются ряд физических барьеров; передавая трек наполнен клетки, и пыльца трубы необходимо ввести минуту micropylar открытие яйцеклетку для достижения их целей (рис. 1A)2. Таким образом пыльца трубы должны иметь способность проникать физических препятствий, а терпимое отношение напряжений от их окружения. Корневые волоски являются еще одним типом растущего кончика растительной клетки, которые должны выдерживать физические препятствия в окружающей среде, в виде Упакованные почвенных частиц (рис. 1B).
Были изучены различные механические свойства труб пыльцы, включая тургор и жесткость клетки апикальной региона, которая может быть измерена с помощью зарождающегося плазмолиза метод3,4 и клеточных силовой микроскопии (CFM) 5 , 6, соответственно. Однако эти методы только не свидетельствуют ли пыльцы трубы способны удлинения через физические барьеры на пути их роста. Альтернативный метод, который позволяет удлинение трубки пыльцы наблюдаемого в естественных условиях — микроскопия два фотона7. Однако, с помощью этого метода, трудно наблюдать морфологические изменения в отдельных труб пыльцы глубоко внутри ткани яйцеклетку. Кроме того рост корня волос в почве могут быть визуализированы с помощью рентгеновская компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ)8, хотя и с низким разрешением. Здесь мы представляем метод, который может использоваться для приобретения изображения с высоким разрешением процесса деформации клетки на обычных микроскопа.
Общая цель метода, описанного здесь является для визуализации возможность удлинения подсказка выращивания растительных клеток, включая пыльцы трубы, корневые волоски и Мосс protonemata, в очень малых пространствах. Как микроприборов поли dimethylsiloxane (PDMS), представленные в этой рукописи оптически прозрачны и воздуха проницаемой, мы можем культура живых клеток внутри устройства и наблюдать за их поведением роста под микроскопом. Это также возможно для создания микро ~ нанометровом масштабе запрещено техника мягкой литографии9 с использованием формы. Эти функции позволяют нам изучить возможность удлинения подсказка выращивания растительных клеток в физически ограниченном среде.
В этой работе мы построен 1 мкм большой разрыв (4 мкм в высоту) в microfluidic приборы и изучил пыльцы трубок способность проникать эти искусственные препятствия, которые намного меньше, чем диаметр цилиндрических труб пыльцы (примерно 8 мкм). Эта экспериментальная платформа позволяет нам визуализировать пыльцы трубки ответ на microgaps и снимки промежуток времени ответа, которые отслеживать процесс деформации клетки. Мы также разработали Микроустройства, который может использоваться для изучения возможности проникновения корневой волосы и protonemata мох. Несколько микроприборов поступили на сегодняшний день, позволяющие визуализации корень10,11,12,13 и Мосс protonemata14 роста растений с высоким разрешением. В нашем устройстве ряд каналов корня волос роста связаны перпендикулярно к камере роста корня, и отдельные корневые волоски (примерно 7 мкм в диаметре) руководствуются аэрогидродинамических каналов с 1 мкм большой разрыв. Мы также выращиваются Мосс protonemata (примерно 20 мкм в диаметре) в микроустройств, содержащие microgaps для изучения их ответы на эти физические барьеры. Предлагаемый подход, основанный на microfluidic позволяет нам исследовать возможности клеток различных подсказка растущих растений удлиненное через чрезвычайно малых пространств, которые не могут быть рассмотрены любых других имеющихся в настоящее время методом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько важных шагов в протоколе необходимо следовать именно для получения результатов, представленных выше. Во-первых слой и стеклянных поверхностей нижней блюдо PDMS оба следует подходить плазмы для достаточное количество времени, прежде чем склеивания. В противном случае PDMS слой м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим H. Цуцуи и D. Курихара за предоставление нам трансгенных растений, в том числе т. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato линия и линия A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , соответственно. Эта работа получила поддержку от института трансформативных био-молекул Нагойский университет и сеть науки Японии расширенный завод. Финансовую поддержку для этой работы была представлена грантами от Японии науки и технологии (проект ERATO Грант нет. JPMJER1004 для т.г.), субсидий для научных исследований в инновационных областях (Nos. JP16H06465 и JP16H06464 для т.г.) и Япония общества для поощрения науки (JSP) дотаций для сложных поисковых исследований (Грант № 26600061 для Нью-Йорк и Грант № 25650075 и 15 K 14542 для я.с.).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
