Summary
このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。
Abstract
カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。
Introduction
カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。
カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。
カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。
この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。
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Protocol
1. 細胞や培養皿の準備
注: 組織培養層流フードの 1-3 の手順に従います。手袋を着用します。
- ガラス底培養皿を使用している場合は、フィブロネクチンとガラスをコートします。プラスチック製の食器を使用して手順 1.2 を省略します。
- フィブロネクチンの 0.1 mg/mL の溶液を作る: 9 mL の 1x PBS で 1 mg/mL フィブロネクチン溶液 1 mL を希釈します。
- 0.5-1 の各ウェルのガラス底をカバー フィブロネクチンの mL と室温で 1 5 分間インキュベートします。
- ピペットを使用して、フィブロネクチン ソリューションを収集、4 ° C で保存
メモ: フィブロネクチン ソリューションを複数回使用できます。 - 1-2 mL の 1x PBS、一度ガラスを洗浄し、PBS を離れて吸い出しなさい。
- (別大きさで分類された井戸に使用する細胞数の表 1参照) 適切な細胞の培養基の 2 mL で 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 x 10 の5セルをプレートします。安定 (ディスカッションを参照) カスパーゼ BiFC コンポーネントを表現する細胞ラインを使用している場合、2 x 10 の5セルをプレートし、治療手順 (手順 3) に進みます。
- 組織文化のインキュベーターで 37 ° C で一晩シャーレに付着します。
2. トランスフェクション細胞のカスパーゼ BiFC コンポーネントを紹介するには
- 適切なトランスフェクション試薬で細胞を transfect します。
注: このプロトコルは、最小限の毒性のために最適化された Lipofectamine 2000 の指示をについて説明します。このプロトコルは、LN18 細胞 MCF7 細胞、Hela 細胞で正常に使用されています。追加場合、トランスフェクション試薬は製造元の指示に従って、必要に応じて最適化します。- 生殖不能の管に低下した血清中メディアの 750 μ L にトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加します。
- 5 分間室温でインキュベートします。
- 追加 10 ng 記者プラスミド (蛍光蛋白質、例えば赤い蛍光蛋白質 [RFP] transfected セルにラベル付けするプラスミド) のために導入するのにも、各滅菌 1.5 mL チューブに。
- 20 追加各カスパーゼ BiFC プラスミドの ng (例えば、20 カスパーゼ-2 prodomain [C2 プロ] ng-VC と 20 ng C2 Pro (ヴァイオリン) の) 各管 (表 2) に。
- 低下した血清中のメディアを追加することにより 100 μ L の総ボリュームまで各チューブをもたらします。
- P200 ピペットを使用して、追加のトランスフェクション試薬溶液 100 μ L ステップ 2.1.2 からプラスミドの混合物に滴状に。
- プラスミド トランスフェクション試薬ミックス室温で 20 分間、インキュベートします。
- メディアや吸引でピペットを使用してセルからの吸引し、井戸の横にそっと血清無料メディアの 800 μ L をピペット p1000 ピペットを使用しています。
- P200 ピペットを使用して、各ウェルに滴状 DNA 脂質複合体の 200 μ L を追加します。
- 3 h の 37 ° C で培養孵卵器内のセルを孵化させなさい。
- ように注意して、単層を混乱させる、ピペットで吸引を使用して吸引により DNA 脂質複合体を含む血清無料メディアを削除します。
- 各ウェルの側を軽く下に予め温めておいた (37 ° C) 完全な成長媒体の 2 mL のピペットします。
- 最適な蛋白質の表現のための 24-48 時間培養のインキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
3. カスパーゼ活性化の誘導
- 薬やカスパーゼ活性化約 24 h 後トランスフェクションを誘導する刺激を扱います。
- 目的に薬物濃度予め加温 (37 ° C) イメージング メディア (Hepes [20 mM, pH 7.2 7.5] と 2-メルカプトエタノール [55 μ M] 補足の完全な成長媒体) とミックス優しくを追加 (表 3)。
- 吸引や吸引でピペットを使用してセルからメディアと井戸の横にそっと 3.1.1 から溶液 2 mL ピペット ピペットを使用して、その後。
- 未処理のコントロールと 1 つの井戸に薬物なしのイメージング メディアを追加します。
- 37 ° C で培養のインキュベーターで細胞をインキュベートかコマ撮り実験手順 4.3 に進みます。
4.カスパーゼ BiFC データ集録
-
単一の時間ポイント獲得のカスパーゼ BiFC
- 顕微鏡と蛍光光源の製造元の指示に従ってを入れます。
- RFP フィルターとレポーター遺伝子蛍光焦点の下のセルを検索します。
- 手集計カウンターを使用すると、視野の RFP 陽性の細胞のすべてをカウントします。数を記録します。
- 同じ視野を維持しながら GFP フィルター (または YFP フィルター使用可能な場合) に切り替えるし、緑も赤血球の数を数える手集計カウンターを使用して、(金星陽性)。金星陽性赤血球のみが評価されることを確保するため 2 つのフィルターを切り替える前後。レコード番号 (図 3)。
- 各プレートの 3 つの個々 の領域の少なくとも 100 の RFP 陽性細胞を数えます。
- 各エリアで金星正トランスフェクション細胞 (すなわち緑も赤細胞) の割合を計算します。標準偏差を取得する結果の割合を平均します。
-
カスパーゼ BiFC の 3次元イメージング
- 製造元の指示に従って顕微鏡をオンにし、集録ソフトウェアを起動します。
- 60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置
- 正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。
- 落射蛍光光源や顕微鏡アイピースや共焦点レーザーとコンピューターの画面のいずれかを使用して、目的のフィールドに移動します。
- RFP レーザやフィルターを使用してレポーター蛍光に焦点を当てます。
- 落射蛍光は、この時点までに使用されている場合、共焦点レーザー光源を切り替えるし、カメラによって獲得されたと集録ソフトウェア コンピューターの画面上で表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。
- ジョイスティック コントロールとフォーカス ホイールを使用して、微調整やセルの位置、フォーカス、ファインダーの中央にあるセル。お互いから分離され、重複していないセルを選択します。
- 実験用に最適な設定を決定するための出発点として、金星の RFP 割合のレーザー出力の 50%、100 ms で露光時間を入力します。
- ライブ キャプチャおよび検査結果の画像と両方のチャネルの付属表示ヒストグラム。
- 信号が少なく、イメージ作るは難しいが場合、は、画像の信号までの増減割合レーザー力および/または露出時間が長くなるよさそうです。
- 信号が飽和しないを確認します。顕著なピークは、各蛍光表示されるかどうかを確認する表示ヒストグラムを検査します。ピークを包含する全体のヒストグラム表示場合、は、低いレーザー力と露出設定 (図 2) を入力します。
- 信号の特定を確実に同じ条件の下で制御 (未処理または非導入) の細胞を可視化します。
注: 単色形質転換細胞は、クロス オーバーの制御にも使用できますが、信号が空間的に異なる (例えば細胞質とミトコンドリア) 場合これは必要ではありません。 - 選択または顕微鏡のソフトウェアで Z スタック モジュールを開きます。
- フォーカスつまみを使用して、セルの中心に対応する焦点の位置を近似します。
- セルが表示されなくなるまで、1 つの方向でピントを調整、トップの位置とこれを選択します。
- セルが再び表示されなくなるまで反対方向にフォーカスを調整し、下の位置としてこれを選択します。
- 最適ステップ サイズ (通常約 20 μ m) を選択し、自動的に上部と下部の位置の間 20 μ m の手順のそれぞれで各チャンネルで 1 つの画像を取るためにカメラを指示する集録を開始します。
- (図 4、映画 1) 3 D のイメージを再構築するのに 3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。
-
カスパーゼ BiFC のタイムラプス イメージング
- 実験する前に少なくとも 1 時間は顕微鏡をオンにし、37 ° C に温度を設定
- 40 x、60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置します。
- 正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。
- CO2発生源が利用できる場合は、プレート ホルダー上に CO2配信デバイス (通常提供する CO2管に接続されているプレキシ ガラス蓋) を置きます。CO2レベルを 5% に設定し、ソフトウェア内から CO2のコント ローラーをオンにします。CO2発生源が利用できない場合 20 mM Hepes にメディアをバッファーが含まれます。
- Transfected セルのフィールドに移動し、カメラによって獲得されたと RFP レーザーを使用して、コンピューター画面上の獲得ソフトウェアによって表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。
- 次の手順 4.2.8-4.2.12 RFP レーザーのレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力します。蛍光信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。
- 肯定的な制御を使用してサンプル (例については表 3を参照) で、以下 YFP レーザ光のレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力する手順 4.2.8-4.2.12。金星信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。
- プレートの各ウェル、記者を表現する 1 つまたは複数のセルを含む別の位置の数を選択します。
- 取られるフレームの時間経過および合計数の各フレーム間の時間間隔を入力します。次のフレームが行われる前にすべての選択した位置を取得する時間があることを確認します。
- 各位置に再アクセスして、修正し、必要に応じてフォーカスを更新します。
- 外部振動や温度の変化に起因する焦点のドリフトを修正するにフォーカス ドリフト補正システム (ある場合) をオンに。
- コマ撮りを開始し、データを保存します。
- (図 5、映画 2) 利用のイメージング ソフトウェアを使用してデータを分析します。
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Representative Results
カスパーゼ 2 BiFC による DNA 損傷の例は図 3に示します。カンプトテシン、トポイソメラーゼ私阻害剤は DNA の損傷・ カスパーゼ-2 の活性化を誘導するために使用されました。BiFC プローブを細胞に表現をし、セルの合計数を視覚化するために、赤の蛍光タンパク質 mCherry は記者として使用されました。金星蛍光グリーンでは、大涙点を表すカスパーゼ 2 近接を誘発します。金星-陽性細胞の割合を決定するため、これらの細胞を数えることができます。細胞内局在についての結論は、このようなイメージからも可能です。例で示すように、細胞質17のように核小体もカスパーゼ 2 誘導近接が検出されました。カスパーゼ活性化複合体の細胞内分布の高解像度の可視化を提供するために単一セルの 3 次元でイメージを作成できます。図 4は、このような 3 D 画像を表現する 2 つの方法を示しています。最初はセルの 3 D 再構成を生成します。緑と赤で核にカスパーゼ 2 BiFC のカンプトテシン誘導を例です。3 D 再構成は、細胞全体両方の蛍光物質の相対的なローカリゼーションを示しています。このタイプの結果表示は、単一軸 (映画 1) セルの回転、映画として提示されたときに特に有効です。2 番目のパネルは、同じセルの直交ビューです。これは、セル内の特定の位置にあるセルのxy、 xzとyzの可視化を提供します。この方法で結果の描写は 2D 形式で提示された 3 D データを解釈しやすく、雑誌記事のように発表に適してことができます。図 5は、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ治療神経膠芽腫細胞におけるカスパーゼ 2 BiFC のタイムラプス イメージングの例を示します (ムービー 2を参照してください)。グラフは、セル ( 20から適応) セルの数値全体の平均当たり平均金星強度の増加を示しています。この種類のデータは、1 つのグラフ上で単一のセルのトレースの数としても表示できます。例で示すように、カスパーゼによる近接の発症は処置に続く約 2 時間です。
図 1: カスパーゼ構造および分子蛍光補完 (BiFC) 方法論の概略図。(A)開始カスパーゼの一般的な構造。Prodomain 大小サブユニットと活性部位のシステインを含む保存 QACRG モチーフが描かれています。(B) BiFC 分割蛍光タンパク質単独で蛍光ではないが、蛍光分子相互作用の蛋白質に融合を改革に関連付けることができますを使用します。カスパーゼ BiFC、prodomain (Pro) のフルレングスのカスパーゼを半分 N 末端に融合または (金星 N) と C 末端に半分の金星 (ヴィーナス C)。単量体の状態でカスパーゼの融合蛋白質は蛍光ではありません。PIDDosome などの活性化プラットフォームに採用の時に、ここで示すように、金星の 2 つの半分の協会は強制金星蛍光性の増加として測定はカスパーゼによる近接を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な画像表示ヒストグラムを用いた飽和を認識します。最適な (上部のパネル) と飽和信号 (下のパネル) の例のとおりです。金星 (黄色のピーク) および RFP (赤いピーク) 信号が表示されます。強度を表し、y 軸は x 軸のピクセル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DNA 損傷に続くカスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC).Hela 細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントが表現された未処理(A)を左またはカンプトテシン (100 μ M) で治療(B)貴殿 183 局所薬 (20 μ M) が存在します。mCherry は、共同に蛍光レポーターとして表現されました。代表的な画像は、カンプトテシン処理細胞の処置に続く 16 h でカスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) のセルを表示します。スケール バーを表す 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) のローカリゼーション。カスパーゼ 2 BiFC コンポーネントおよび蛍光原子力記者を発現 Hela 細胞は、qVD 183 局所薬 (20 μ M) の存在下でカンプトテシン (20 μ M) と扱われました。Zまでの 0.1 μ m シリアル共焦点画像から構成される 3 D 再構成-セルの平面 24 h 後に行われた、緑赤とカスパーゼ 2 BiFC で核を示します。左側のパネルが 3 D の最大強度投影レンダリング復興を示しています (「ムービー 1」も参照).右側のパネルは、同じセルの直交スライス ビューを示しています。中央のボックス (青) がxy平面 (黄色) 右のボックスはyz平面、トップ ボックス (白) はxz平面。Yz 平面とxz平面交差十字線によるとしています。スケール バーを表す 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) のコマ(A) LN18 膠芽腫細胞をトランスフェクトしたカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントとボルテゾミブ投与した DsRed 水戸 (赤い) 赤い蛍光ミトコンドリア マーカー (15 nM) qVD 183 局所薬 (20 μ M) が存在します。セルが 37 ° C で共焦点顕微鏡に置かれ、8 h. 画像の金星蛍光 (の増加をもたらした 2 つのカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントの誘起近接時間経過表示から代表的な細胞の 2 分ごとに画像が撮影されました。緑) 時間をかけて。(B)各セルは、各時点での金星の平均強度を測定しました。金星の蛍光は、ボルテゾミブ治療後時間の経過とともに増加しました。未処理のコントロール部には、レーザー光 (図20から適応) からの低またはごくわずかな毒性条件が示されます。スケール バーを表す 20 μ m。 誤差範囲を表す 8 (コントロール) の平均 (SEM) の標準誤差および 14 (ボルテゾミブ) 個々 のセル (ムービー 2 を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プレートのサイズ | セルの数 | メディアのボリューム |
| 6 ウェル プレート | 1 x 10 の5細胞/ウェル | 2 mL |
| 12 ウェル プレート | 5 x 10 の4細胞/ウェル | 1 mL |
| 24 well プレート | 2.5 x 10 の4セル/も | 0.5 mL |
| 4 チャンバーディッシュ | 2.5 x 10 の4セル/室内 | 1 mL |
| 8 チャンバーディッシュ | 10 の4セル × 1.25/室内 | 0.5 mL |
表 1: プレートに細胞数のガイドライン。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) コンポーネントを安定に発現する細胞を使用して、プレートはここで示された金額を倍増します。
| プレートのサイズ | トランスフェクション試薬 | 低下した血清中メディア | 記者プラスミド | カスパーゼ-pro VC プラスミド | カスパーゼ-pro VN プラスミド | プラスミドのミックスに追加減少血清メディア | トランスフェクション試薬溶液プラスミドのミックスに追加 | 血清無料メディアがセルに追加されます。 |
| 6 ウェル プレート | 12 μ L/プレート | 750 Μ L | 10 ng | 20 ng | 20 ng | 100 μ L の合計 | 100 Μ L | 800 Μ L |
| 12 ウェル プレート | 12 μ L/プレート | 750 Μ L | 5 ng | 10 ng | 10 ng | 50 μ L の合計 | 50 Μ L | 400 Μ L |
| 24 well プレート | 12 μ L/プレート | 750 Μ L | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | 25 μ L の合計 | 25 Μ L | 200 Μ L |
| 4 チャンバーディッシュ | 4 μ L/プレート | 250 Μ L | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | 25 μ L の合計 | 25 Μ L | 200 Μ L |
| 8 チャンバーディッシュ | 4 μ L/プレート | 250 Μ L | 1.25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | 合計 12.5 μ L に | 12.5 Μ L | 100 Μ L |
表 2: トランスフェクション試薬のボリュームをお勧めします。メモ: 提案したプラスミドの量はスタート地点に過ぎません。信号が検出されない場合は、6 ウェル プレートのウェルあたり 20 200 ng からプラスミドを滴定することをお勧めします。
| カスパーゼ | 治療 | 濃度 | 時間 | 予想される結果 |
| カスパーゼ 1 | 過剰表現 ASC | 250 ng/6 ウェル プレートのウェル | 48 h | 50 %bifc 正 |
| カスパーゼ-2 | 過剰表現 RAIDD | 500 ng/6 ウェル プレートのウェル | 24 h | 90 %bifc 正 |
| カンプトテシン | 100 Μ M | 16 h | 30-60 %bifc 正 | |
| ヒート ショック | 45 ° C で 1 時間 | 16 h | 80 %bifc 正 | |
| カスパーゼ-4 | 発現 NALP1 | 250 ng/6 ウェル プレートのウェル | 48 h | 30 %bifc 正 |
| カスパーゼ-5 | 発現 IPAF | 250 ng/6 ウェル プレートのウェル | 48 h | 15 %bifc 正 |
テーブル 3: カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) の肯定的なコントロールの例です。条件と予想される結果をベース14,17,18を構築、Pro を使用してパブリッシュされたデータについて。共発現プラスミドは BiFC プラスミド (ステップ 2.1.4) と一緒に導入する必要があります。
映画 1: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) の 3 D のローカリゼーション。Y回転 3 D 再構成-共焦点画像からz軸-飛行機、hela 細胞の細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントおよび蛍光原子力記者が 16 h のカンプトテシン (20 μ M) と扱われた表現。映画は、カスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) の核を示しています。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 2: カスパーゼ 2 分子蛍光補完 (BiFC) のタイムラプス。LN18 膠芽腫細胞のカスパーゼ 2 BiFC コンポーネントをトランスフェクトしたし、ボルテゾミブによる治療 (15 nm) 8 時間 2 分ごとをイメージしました。映画は、カスパーゼ 2 BiFC (緑) と (赤) のミトコンドリアを示しています。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
このプロトコルでは、カスパーゼによる近接を測定する蛍光タンパク質を分割の使用について説明します。それは非常に明るく、非常にあると、巻き戻しである高速13分割金星この方法を選ばれました。したがって、カスパーゼ タンパク質相互作用ダイナミクスの実時間推定に近い金星カスパーゼによる近接時に巻き戻しの分析を提供できます。金星は金星 (ヴィーナス N または VN) から成るアミノ酸 1 173 の N 末端、2 少し重複フラグメントに分割され C 末端フラグメント (金星 C または VC) から成る残留 155-239。その他の分割の蛍光タンパク質が存在するが、分割 mCherry など、いくつかは 2 h まで巻き戻し21の 4 ° C で培養を必要とします。追加の分割蛍光タンパク質セルリアン (シアンの蛍光タンパク質のバージョン) を分割を含むと遠赤の分割 mLumin がまだこのコンテキスト13,22でテストされます。最終的には、これらの蛍光タンパク質がカスパーゼによる近接を測定に適して証明すると、複数のカスパーゼの同時評価これできます。
一般的に、分割蛍光フラグメントに、カスパーゼの prodomain (Pro) 領域を融合します。この地域はカスパーゼ活性化プラットフォームにバインドするために必要な最小限の部分を含む、カードまたは DED 相互作用モチーフを網羅します。Prodomain を使用しての利点は、セルに任意の酵素活性が発生しないことです。内因性カスパーゼのためのダウン ストリーム イベントの同時監視可能になります。までの研究動態およびカスパーゼ BiFC、prodomain と完全な長さのカスパーゼ14間のローカリゼーションにはほとんど差を示しています。ただし、フルレングスの構造は、低効率、プラスミド DNA の増加量のトランスフェクションを施行したと表現する傾向があります。さらに、式にカスパーゼによるアポトーシス誘導を防ぐためにセリンを触媒のシステインを変異させることをお勧めします。これらの欠点にもかかわらず、特定の調査は触媒ドメインの有無でカスパーゼによる近接でコンテキスト依存性の違いがあるかを決定するための完全な長さ BiFC ペアの同時解析を必要があります。
このプロトコルは、特に HeLa 細胞の適応です。同じプロトコルは、追加付着性のセルライン乳腺癌細胞ライン、MCF 7、神経膠芽腫細胞株、LN18、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) などに適しています。この議定書、新しいセル型を適用するとき、ユーザーがめっき、トランスフェクション条件を最適化することをお勧めします。プロトコルはセルを評価するために使用できる 2 つの主要な顕微鏡アプローチを記述: 落射蛍光と共焦点顕微鏡。共焦点の顕微鏡を使用している場合、セルは、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される高開口数目標の大半はプラスチック製の食器やガラスの厚さを貫通しないのでガラス coverslips にメッキする必要があります。したがって、最適な coverslip 厚さ 0.17 mm の埋め込み号 1.5 ガラス coverslips に皿を使用することをお勧めします。これらの料理の種類の数は利用可能な標準サイズのウェル プレートに、商工会議所のスライドに個々 の 3 cm の皿からその範囲。表 1と2は、めっき、トランスフェクションについてよくのさまざまなサイズを適応する方法を説明します。落射蛍光のイメージングはここで説明されている (4.1)、顕微鏡にロングパス目標が装備されている限り標準的なプラスチック組織培養皿で十分です。
このアプローチは、カスパーゼの活性化を測定する「点灯」メソッドでは効果的に、ので蛍光レポーターの包含はカスパーゼ記者の活性化のない状態で前に細胞の可視化を可能にし識別するために不可欠であります。transfected セル、トランスフェクションを使用します。別の記者の数を使用でき、1 つを選択するときの唯一の基準は、: 1) 蛍光体は、イメージング プロトコルによって容易に検出できるように十分に明るい・ 2) と YFP の蛍光スペクトルが重複しません。たとえば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) は、YFP フィルターまたは金星を検出するために使用するレーザーによって検出されますので記者として使用されませんする必要があります。これは、2 つの蛍光物質のスペクトル重複のためです。特定の細胞小器官に局在する fluorophore を選択する追加の定性的情報を提供できます。たとえば、タンパク質のターゲットした DsRed-水戸、赤色蛍光タンパク質など、ミトコンドリアが細胞の全体的な生存率に追加情報を提供することができますを使用します。ミトコンドリアは細胞死23の初期段階 (分裂) の断片化を受ける傾向があるし、これをした DsRed 水戸のような記者と想像できます。記者としての細胞小器官のマーカーの使用は、カスパーゼす BiFC の細胞内局在についての結論もできます。
カスパーゼ BiFC データを取得および分析できる方法の数があります。使用する方法は、探検するために、パラメーターによって決定されますを決定する (単一のセル位置や運動情報とエンドポイントの人口分析) と計測およびイメージング ソフトウェアの可用性。このプロトコルでは、カスパーゼ BiFC 実験単一の時間ポイントと時間経過のデータを取得するための結果を収集するいくつかの顕微鏡ベースのアプローチについて説明します。しかし、それは注意する必要がありますバリエーションと創造的カスパーゼ活性化経路を調査するためのこれらのアプローチの組み合わせの数です。
データ集録 (4.1) カスパーゼと細胞の割合を調べるため単一の時間ポイントは、単一の時間ポイントで近さを誘導されます。このプロトコルの 1 つは単に金星良い transfected セルの数をカウントします。したがって、非常に特殊な機器は必要ありませんと GFP (または YFP) でだけ最も基本的な落射蛍光顕微鏡と RFP フィルター、手集計カウンターが必要です。いくつかのイメージング システムは、プレートのウェルあたりの画像数の設定を自動的に取る自動化できます。このようなインストルメンテーションは、取得した画像のセルは同様に目視で数えることができるまたは、イメージング ソフトウェアを使用して量的に表わされます。三次元画像 (4.2) は、カスパーゼ BiFC セルの焦点面全体の高解像度の画像を提供します。金星と RFP (または選択したトランスフェクション レポーター) を励起レーザ共焦点顕微鏡、Z スタック機能が必要です。3 D レンダリング ソフトウェア モジュールの数は利用可能なデータを可視化する別の方法を提供します。解析の両方のこれらの種類、細胞とイメージを修正するか、後でそれらを評価することが可能です。固定のプロセスは、成果物を分析に加える金星信号を減少し、したがって、このアプローチは推奨されません。タイムラプス イメージング (4.3) は、カスパーゼ BiFC の同時位置と速度論的分析を提供するために使用できます。電動ステージを搭載した顕微鏡は、複数の位置の画像を撮影しても同じ実験で異なる治療グループの比較を設定できます。
時間経過、事項の数する必要があります考慮します。レーザー光光毒性や退色のためアーティファクトが発生することができ、両方の管理が必要があります。一般的には、両方を光 (手順 4.3.6-4.3.7 での入力割合が低いレーザー力と短い露光時間) の最低の可能な量を使用して回避できます。光毒性結果レーザー光が細胞死を誘導してのイメージ投射同じ条件下で未処理のセルとその細胞分裂が通常どおり続行されますを確認することによって制御できます。退色が発生する同じセルの撮影した複数の画像が蛍光性を減少させます。金星の蛍光タンパク質では、これはまれな問題を実際にかなりあります。退色の影響は、金星陽性細胞の多数の連続した画像を撮影蛍光性が安定していることを確認することによって決定できます。これはのみ同じレーザー パワーと露出の設定は、すべての実験に使われている限り、一度、実行する必要があります。撮影した画像の総数を減らすことによって、毒性またはフォトブリーチングによる影響を軽減もできます。これは、キャプチャ (ステップ 4.3.9) 間の時間間隔を短くしたり長くしたりによって達成することができます。16 h の時間経過で 5-10 分間隔を使用してを開始する良い場所です。Photoxicity が観測されない短い期間の実験が必要な場合、フレーム間の間隔を削減できます。カスパーゼ活性化が急速な場合は、短い時間間隔の短い実験が使用できます。たとえば、10 分間隔で 16 h 実験、合計 192 イメージをとること (各 fluorophore の 96)。1.5 m 間隔に 2 h 実験 160 の画像が得られます。したがって、長期および短期の実験はそれぞれ、レーザー光の合計金額を同様に細胞を公開でしょう。短時間の実験のためカスパーゼ活性化刺激を (ステップ 3 ステップの代わりに 4.3.11) 後コマ撮りキャプチャの開始の直前にメディアに直接追加できます。これを行うには、プレートからふたを外すし、ピペットを使用して刺激を含む溶液中をゆるやかに降下。プレートを押し合うとすぐにセルがまだ続行する前にフォーカスになっているを確認注意してください。
タイムラプスの実験を遂行した場合細胞の即時の環境に密接に似ている培養孵卵器を確認しますが重要ですも。環境コントロールの数が異なる顕微鏡セットで使用可能な ups。小さいステージ トップ インキュベーターとして全体の顕微鏡をカプセル化環境室が含まれます。これらのデバイスの両方通常お届け熱、CO2、および湿度を正確に制御することができる方法で商工会議所。CO2と温度の正確な制御は、原因は変動が焦点ドリフトすると CO2の欠如につながることができます予期しない温度、pH、細胞に有毒することができます上昇するメディアの実験の成功に不可欠です。CO2発生源が利用できない場合、メディアは Hepes (手順 3.1.1 参照) の添加によるバッファーに格納できます。CO2発生源が利用、場合でもは、イメージングの中に細胞を健康に保つために余分な措置として Hepes を含めることをお勧めします。ただし、Hepes、存在下でも CO2時間の長時間の不在は、細胞死を引き起こすことができます。したがって、[同じ条件と pH が安定していることを確認するための実験の結論では、メディアのカラー イメージを作成、未処理の細胞を検査することが重要です。そのフェノールレッドが金星信号に蛍光の貢献は最小限なので、このプロトコルで使用されるメディアのいずれかから除外する必要はありません注意してください。
数時間経過実験に起因する画像データを分析する使用可能なメソッドがあります。カスパーゼによる近接のタイミングを分析する最も簡単な方法は、transfected セルあたり金星ピクセルの平均強度を測定しました。図 3, , 図 4図 5に示すように、カスパーゼ 2 BiFC しばしば別の細胞内コンパートメントに位置する 1 つまたは複数の点として表示されます。画像解析に近づく巣、オブジェクトのサイズ、またはその他の類似した要素のメジャー番号がこれらの構造について有益な定量的なデータを得ることができます。すべてカスパーゼ BiFC 涙点として表示されます。たとえば、炎症性カスパーゼは拡散反射光蛍光、糸状の構造、およびセル18あたり 1 つまたは複数の点を含む異なる BiFC パターンを示しています。これらのパターンは、上流の活性化信号だけでなく、アクティブ化カスパーゼに依存していた。したがって、時間経過の結果に最も適した分析の種類は、観察される蛍光のパターニングの種類によって定まる主。
分析カスパーゼによって直接、または間接的細胞死経路を従事によってアポトーシスを誘導する、このプロトコルを使用するときに評価されている治療刺激の多くは。これにより細胞が縮小し、セルのイメージを非常に困難およびカスパーゼ BiFC の任意の特定のローカリゼーションを決定することは不可能それは、プレートからデタッチします。汎カスパーゼ阻害剤の包含はこの細胞死を防止します。カスパーゼの活性化プラットフォームと関連するカスパーゼの募集 BiFC は、カスパーゼの活性に依存しません。したがって、カスパーゼ阻害はこの手順の効果はありません、アポトーシスの膜の整合性のブレブ、剥離、最終的な損失などの下流の物理的特性を阻害します。したがって、エンドポイント解析 (ステップ 4.1) または Z スタック (ステップ 4.2) の実施、カスパーゼ阻害剤の包含は不可欠です。MOMP、(ホスファチジルコリン セリン露出を検出) するアネキシン V バインディングまたは propidium ヨウ素の取り込み (細胞膜透過を検出) するなどアポトーシス関連イベントがカスパーゼ BiFC、横を分析する場合は、コマ撮り実験を対照的のカスパーゼ阻害剤を省略し、これらのイベントの阻害を防ぐ必要があります。QVD 183 局所薬 (10-20 μ M) などのカスパーゼ阻害剤は、アポトーシス誘導刺激 (ステップ 3.1.1) を含むメディアでに追加する必要があります。カスパーゼ BiFC コンポーネントとアポトーシス誘導タンパク質の共発現、カスパーゼ阻害剤がステップ 2.1.12 に追加する必要があります。
カスパーゼ BiFC は生きた細胞のカスパーゼ活性化経路のイベントの視覚化に使用できるいくつかの利用可能なメソッドの 1 つは、いくつかの考察がこれらの実験を設計するとき考慮に入れする必要があります。このアプローチは過剰発現ベースであるために、特異性のコントロールが重要です。これは、2 つの方法のいずれかで実現できます。まず、カードまたは彼らは、カスパーゼとその活性化プラットフォーム間のバインドを混乱させるようなこと prodomain のカスパーゼの DED への単一の点突然変異の導入がカスパーゼ BiFC の強度と金星陽性の割合を減らす必要があります。セルです。たとえば、カスパーゼ 1 の prodomain で e D59 残渣の突然変異アダプター蛋白質 ASC (アポトーシス関連の斑点のような蛋白質、カードを含む) が中断され、均等に ASC 誘起カスパーゼ 1 BiFC 18,24 を妨害.第二に、カスパーゼ活性化プラットフォームを採用するアダプター蛋白質の欠乏は細胞の使用は特定の BiFC 信号が低下します。これは達成可能な場合、ノックアウト細胞を使用してまたは siRNA を用いた、またはアダプターの細胞を破壊するアプローチ CRISPR/Cas9 ベースします。したがって、カスパーゼ 2 アダプター蛋白質 RAIDD の枯渇は、熱衝撃や DNA 損傷14,17によるカスパーゼ 2 BiFC を完全にブロック。これらの実験のためノックアウトまたはノックダウン細胞をマッチさせたコントロール細胞 (すなわち野生型のごみ一致 MEF またはコントロール ノックダウン) と比較し、最適なトランスフェクション条件が等しいことを確認する評価されるべき新しい細胞ラインを使用する場合セルの行に渡って BiFC 記者の式。
このアプローチの第 2 の制限は、トランスフェクションを使用する場合、各セルは、各蛋白質の同量を表しているということを確認することは困難です。式が等しくない場合より高い周波数でプラットフォームに金星フラグメントが 1 つを募集することができます。これは完全蛍光信号をマスク、偽否定的な結果につながる可能性があります。この問題を克服するために安定的な細胞ラインの生成のカスパーゼ BiFC 記者の新しいバージョンは、最近報告された17だった。この新しいバージョンは、ウイルス 2 a 自己断ペプチド25で区切られた 1 つのオープンリーディング フレームの C2 Pro BiFC コンポーネントを表す構成要素から成っていた。したがって、BiFC コンポーネントは同じプロモーターから単一の mRNA として転写が VC と VN の融合蛋白質の化学量論と同じ量を生成する翻訳します。この構造を安定して表現する生成細胞一過性発現レポーター活性化は同様の傾向を示したがより敏感と表示される背景の蛍光性を下げます。したがって、カスパーゼ BiFC コンポーネントを安定して表現するレポーター細胞と組み合わせて使用する場合、上記のプロトコルが大幅簡略します。
日付データは、カスパーゼ BiFC コンポーネントと内因性のタンパク質の間干渉を最小限をお勧めします。たとえば、カスパーゼ 2 がある知られている上流 MOMP の活性化が、カスパーゼ 2 BiFC は MOMP 14の進行をブロックしていません。したがって、これらのレポーターは、支配的な否定的なやり方で行動するは表示されません。ただし、下流のイベントを同時に評価するには場合、実験の各セット内のこの調査する必要があります。このアプローチする最良の方法は、実験でよく導入した制御を含みます。細胞死の速度がカスパーゼ センサーの発現の有無は変更されない場合これはカスパーゼ BiFC コンポーネントが内因性機能を妨害していないことを示します。逆に、内因性カスパーゼ影響可能性があります BiFC 読み出しする効率、またはサイズや構造の形状。このため制御細胞のカスパーゼの欠乏で記者を表現します。
これらの制限にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法は補完でき、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化を測定するための現行のアプローチで改善もカスパーゼ活性化経路を調査する有用な方法です。測定誘導近接、活性化の最初の段階でこの手法はカスパーゼの活性化に関連付けられている自動処理など後の手順を測定に関連する問題を克服します。たとえば、死刑執行カスパーゼの胸の谷間を監視する西部のしみを使用している間カスパーゼ 3 およびカスパーゼ-7、活性化2カスパーゼを台無しことができますイニシエーターに対して同じアプローチを使用して正確な測定。これは、イニシエーター カスパーゼの開裂活性化4,26,27の不足のためです。実際には、多くのイニシエーター ・ カスパーゼは、活性酵素28を生成せずカスパーゼ 3 アポトーシス中に切断です。同様に、特定のカスパーゼのターゲットとして設計されているペプチド基板を用いた手法は、カスパーゼ29これらのシーケンスの重複の特異性を考慮する必要があります。これはそのようなアプローチは、カスパーゼの活性化を測定する使用ことはできませんが、結果を解釈するとき、欠点が承認されるべきとは限りません。カスパーゼ BiFC は、従来のメソッドを使用して結果を確認助けることができる別のアプローチを提供します。さらに、リアルタイムでカスパーゼ活性化複合体のアセンブリを追跡し、はっきりとサイズ、形状および複合体の局在を決定するための能力は、他の手段で評価することはできませんこの方法の重要な利点です。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
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