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Biochemistry

Caspase सक्रियण Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता का उपयोग करने के लिए रास्ते प्रकाश

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/57316
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC); एक इमेजिंग आधारित विधि है कि सर्जक caspases, जो उनके सक्रियण में पहला कदम है की प्रेरित निकटता कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

caspase परिवार apoptosis और जंमजात उन्मुक्ति में आवश्यक भूमिका निभाते हैं । इन के अलावा, एक उपसमूह सर्जक caspases के रूप में जाना जाता है पहले इन रास्ते में सक्रिय हो रहे हैं । इस समूह में caspase-2,-8, और-9, साथ ही भड़काऊ caspases, caspase-1,-4, और-5 शामिल हैं । प्रारंभक caspases सभी सक्रियण प्लेटफॉर्म नामक विशिष्ट multiprotein परिसरों में भर्ती के बाद dimerization द्वारा सक्रिय हैं । Caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) एक इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण है, जहां विभक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन सर्जक caspases से जुड़े करने के लिए अपने सक्रियण प्लेटफार्मों और परिणामी के लिए caspases की भर्ती कल्पना किया जाता है प्रेरित निकटता । यह प्रतिदीप्ति प्रारंभिक caspase सक्रियण के लिए आवश्यक चरणों में से किसी एक का readout प्रदान करता है । विभिन्न माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण के एक नंबर का उपयोग करना, इस तकनीक एक जनसंख्या स्तर पर caspase सक्रियण की दक्षता पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं और साथ ही caspase सक्रियण के कैनेटीक्स और आकार और caspase की संख्या को सक्रिय प्रति सेल के आधार पर परिसरों ।

Introduction

caspase को चिढ़ाने वाले परिवार को apoptosis और जन्मजात उन्मुक्ति 1में अपनी अहम भूमिकाओं के लिए जाना जाता है । क्योंकि उनके महत्व के, निर्धारित कब, कहां, और कैसे कुशलता से विशिष्ट caspases सक्रिय कर रहे है caspase सक्रियकरण रास्ते के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इमेजिंग आधारित प्रोटोकॉल यहां वर्णित caspase सक्रियकरण झरना में जल्द कदम के दृश्य सक्षम बनाता है । इस तकनीक गतिशील प्रोटीन का लाभ लेता है: प्रोटीन बातचीत है कि ड्राइव caspase सक्रियण ।

caspases दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: सर्जक caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, और-12) और जल्लाद caspases (caspase-3,-6, और-7) । जल्लाद caspases कोशिका में विद्यमान dimers के रूप में मौजूद हैं और बड़ी और छोटी उपइकाई 2के बीच दरार द्वारा सक्रिय हैं । जब सक्रिय, वे कई संरचनात्मक और नियामक apoptosis 3में जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन सट । सर्जक caspases पहले caspases को एक मार्ग में सक्रिय कर रहे हैं और आम तौर पर जल्लाद caspases के सक्रियण को ट्रिगर कर रहे हैं. जल्लाद caspases के विपरीत, फलत caspases dimerization 4,5से सक्रिय होते हैं । इस dimerization निष्क्रिय मोनोमर के विशिष्ट बड़े आणविक भार सक्रियण प्लेटफार्मों के रूप में जाना जाता परिसरों की भर्ती द्वारा सुविधा है । सक्रियण प्लेटफार्मों के विधानसभा विशिष्ट प्रोटीन की एक श्रृंखला से नियंत्रित होता है: प्रोटीन बातचीत । इन संरक्षित प्रोटीन बातचीत सर्जक caspase के रूप में मौजूद रूपांकनों द्वारा मध्यस्थता कर रहे है और मृत्यु डोमेन (डीडी), मृत्यु प्रभाव डोमेन (DED) और caspase भर्ती डोमेन (कार्ड) 6 (चित्रा 1a) शामिल हैं । सक्रियण प्लेटफार्मों आम तौर पर एक रिसेप्टर प्रोटीन और एक अनुकूलक प्रोटीन शामिल हैं । रिसेप्टर आमतौर पर एक ligand के बंधन पर सक्रिय है, एक गठन परिवर्तन है कि कई अणुओं के oligomerization के लिए अनुमति देता है उत्प्रेरण. रिसेप्टर तो या तो caspase सीधे या एडेप्टर अणुओं है कि बारी में परिसर में caspase लाने के लिए भर्ती । इस प्रकार, कई caspase अणुओं dimerization की अनुमति करीब निकटता में आते हैं । यह प्रेरित निकटता मॉडल के रूप में जाना जाता है 7. एक बार dimerized, caspase प्रक्रिया है, जो सक्रिय एंजाइम 4,8को स्थिर करने के लिए कार्य करता है । उदाहरण के लिए, Apaf1 apoptosome के विधानसभा cytochrome सी द्वारा एक प्रक्रिया में mitochondria से अपनी रिहाई के बाद शुरू हो रहा है mitochondrial बाहरी झिल्ली permeabilization (MOMP) बुलाया । Apaf1 बारी में भर्ती caspase-9 एक संपर्क है कि दोनों प्रोटीन 9में एक कार्ड मौजूद द्वारा मध्यस्थता है के माध्यम से । इसी तरह के प्रोटीन बातचीत CD95 मौत उत्प्रेरण संकेत जटिल (डिस्क) के विधानसभा में परिणाम है कि caspase-8 सक्रियण की ओर जाता है; PIDDosome, जो caspase-2 को सक्रिय कर सकते हैं; और विभिंन inflammasome परिसरों कि आरंभ caspase-1 सक्रियकरण 10,11,12। इस प्रकार, सर्जक caspases प्रेरित निकटता और dimerization, जिसके बिना सक्रियण नहीं हो जाएगा में जिसके परिणामस्वरूप एक आम तंत्र द्वारा विशिष्ट सक्रियण प्लेटफार्मों पर भर्ती कर रहे हैं ।

Caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) एक इमेजिंग आधारित परख कि सर्जक caspases के सक्रियकरण में यह पहला कदम मापने के लिए विकसित किया गया है, Caspase प्रेरित निकटता के प्रत्यक्ष दृश्य सक्रियकरण मंच निंनलिखित की अनुमति विधानसभा. इस विधि भाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस के गुणों का लाभ लेता है । वीनस पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) है कि दो गैर फ्लोरोसेंट और थोड़ा अतिव्यापी टुकड़े में अलग किया जा सकता है की एक उज्जवल और अधिक photostable संस्करण है: n-वीनस (वीनस n या VN) के टर्मिनस और सी-वीनस (वीनस सी या कुलपति) की टर्मिनस । इन टुकड़ों को फिर से गुना और फ्लोरोसेंट हो जब करीब निकटता 13में करने की क्षमता बनाए रखने । प्रत्येक वीनस टुकड़ा caspase के डोमेन से जुड़े हुए है, जो caspase के ंयूनतम भाग है कि सक्रियण मंच को बांधता है । यह सुनिश्चित करता है कि caspases एंजाइमी गतिविधि बरकरार नहीं है और इसलिए अंतर्जात घटनाओं से जुड़े बहाव की घटनाओं के समवर्ती विश्लेषण संभव है । वीनस टुकड़े जब caspase डोमेन सक्रियण मंच के लिए भर्ती कर रहे हैं और प्रेरित निकटता से गुजरना । (चित्र 1b) । परिणामस्वरूप वीनस प्रतिदीप्ति सही और विशेष रूप से उपसेलुलर स्थानीयकरण, कैनेटीक्स, और एकल कोशिकाओं में सर्जक caspase सक्रियण प्लेटफार्मों की विधानसभा की दक्षता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इमेजिंग डेटा फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा या मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और वास्तविक समय में caspase सक्रियण ट्रैक करने के लिए समय-चूक इमेजिंग: सहित विभिन्न सूक्ष्म दृष्टिकोण के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता; सेलुलर स्थानीयकरण के सटीक निर्धारण के लिए उच्च संकल्प इमेजिंग; और सक्रियण की दक्षता के अंत बिंदु ठहराव ।

यह तकनीक पहले caspase-214के सक्रियकरण की जांच के लिए विकसित किया गया था । जबकि caspase के लिए सक्रियण मंच-2 के लिए PIDDosome, रिसेप्टर PIDD से मिलकर माना जाता है (एक मौत डोमेन के साथ p53-प्रेरित प्रोटीन) और अनुकूलक छापा मारा (चीर एसोसिएटेड इच-1/सीएडी-3 मुताबिक़ प्रोटीन के साथ एक मौत डोमेन), PIDDosome-निर्दलीय caspase-2 सक्रियण रिपोर्ट किया गया है । यह पता चलता है कि caspase-2 के लिए अतिरिक्त सक्रियण प्लेटफॉर्म 15,16मौजूद हैं । caspase-2 सक्रियकरण मंच के पूर्ण घटकों को जानने के बावजूद नहीं, caspase BiFC तकनीक आणविक स्तर 14,17पर caspase-2 संकेत मार्ग के सफल पूछताछ के लिए अनुमति दी गई है । हम भी सफलतापूर्वक भड़काऊ caspases के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है (caspase-1,-4,-5 और-12) 18 और, सिद्धांत रूप में, एक ही दृष्टिकोण को इसी तरह शेष सर्जक caspases में से प्रत्येक का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । इस प्रोटोकॉल इसी तरह अंय रास्ते की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता था dimerization एक प्रमुख संकेत सक्रिय है । उदाहरण के लिए, स्टेट प्रोटीन जानुस् कळेनासे (JAK) द्वारा dimerization निम्नलिखित फास्फारिलीकरण द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 19. इस प्रकार, BiFC प्रणाली स्टेट सक्रियकरण के लिए कल्पना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अंय गतिशील प्रोटीन बातचीत द्वारा विनियमित रास्ते इस्तेमाल किया जा सकता है । निंन प्रोटोकॉल कक्षों में रिपोर्टर्स के परिचय के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है और साथ ही छवि प्राप्ति और विश्लेषण के लिए तरीके भी उपलब्ध कराता है ।

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Protocol

1. कोशिकाओं और संस्कृति व्यंजन की तैयारी

नोट: एक टिशू कल्चर लामिना फ्लो हूड में चरण 1-3 प्रदर्शन. दस्ताने पहनें ।

  1. यदि ग्लास नीचे व्यंजन का उपयोग कर, कोट fibronectin के साथ कांच । यदि प्लास्टिक व्यंजन का उपयोग कर 1.2 कदम के लिए छोड़ें ।
    1. 1 एक्स पंजाब के 9 मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम/एमएल fibronectin समाधान की 1 मिलीलीटर पतला: fibronectin के 0.1 मिलीग्राम/
    2. fibronectin के 0.5-1 मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर 1-5 मिनट के लिए मशीन के साथ एक अच्छी तरह से कांच के नीचे कवर ।
    3. एक पिपेट का उपयोग कर, fibronectin समाधान इकट्ठा और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
      नोट: fibronectin समाधान एकाधिक बार उपयोग किया जा सकता है ।
    4. 1-2 मिलीलीटर 1 X पंजाबियों के साथ एक बार गिलास धो, और महाप्राण बंद पंजाबियों ।
  2. प्लेट 1 एक्स 10 उचित सेल संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति5 कोशिकाओं (सेल संख्या के लिए अलग आकार के कुओं के लिए उपयोग करने के लिए 1 तालिका देखें) । यदि एक सेल लाइन है कि छुरा caspase BiFC घटकों (चर्चा देखें), प्लेट 2 x 105 कोशिकाओं और उपचार कदम (चरण 3) के लिए आगे बढ़ना का उपयोग कर ।
  3. कोशिकाओं को एक ऊतक संस्कृति मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पकवान का पालन करने की अनुमति दें ।

2. caspase BiFC घटकों को लागू करने के लिए कक्षों की अभिकर्मक

  1. उपयुक्त अभिकर्मक रिएजेंट के साथ Transfect कक्ष ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल Lipofectamine 2000, जो ंयूनतम विषाक्तता के लिए अनुकूलित किया गया है के लिए निर्देश रूपरेखा । इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग हेला कक्षों, MCF7 कक्षों और LN18 कक्षों में किया गया है । यदि अतिरिक्त अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग करने के निर्माता के निर्देशों का पालन करें और अनुकूलित के रूप में की जरूरत है ।
    1. एक बाँझ ट्यूब में कम सीरम मीडिया के 750 µ l को अभिकर्मक रिएजेंट के 12 µ l जोड़ें ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    3. जोड़ें 10 एक रिपोर्टर प्लाज्मिड के एनजी (एक प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन कूटबंधन, जैसे लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन [आरएफपी], कि transfected कोशिकाओं लेबल होगा) एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए एक अच्छी तरह से करने के लिए transfected ।
    4. जोड़ें 20 प्रत्येक caspase BiFC प्लाज्मिड के एनजी (उदा, 20 caspase के एनजी-2 डोमेन [c2 प्रो]-कुलपति और 20 c2 प्रो-VN के एनजी) प्रत्येक ट्यूब (तालिका 2) ।
    5. कम सीरम मीडिया जोड़कर प्रत्येक ट्यूब 100 µ एल की कुल मात्रा तक ले आओ ।
    6. एक p200 पिपेट का प्रयोग, 2.1.2 मिश्रण करने के लिए एक प्लाज्मिड तरीके से कदम dropwise से अभिकर्मक रिएजेंट समाधान के 100 µ एल जोड़ें ।
    7. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्लाज्मिड-अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण की मशीन ।
    8. एक पिपेट या चूषण के साथ का उपयोग कर कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण और फिर, एक p1000 पिपेट का उपयोग कर, पिपेट के 800 µ एल सीरम मुक्त मीडिया धीरे के पक्ष के नीचे अच्छी तरह से.
    9. एक p200 पिपेट का प्रयोग, डीएनए के 200 µ एल जोड़-लिपिड परिसर dropwise प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ।
    10. 3 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
    11. ध्यान में रखते हुए monolayer को बाधित करने के लिए नहीं है, सीरम मुक्त मीडिया डीएनए युक्त आकांक्षा से कोलेस्ट्रॉल या एक पिपेट के साथ उपयोग कर ।
    12. पिपेट के 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पूरा विकास मीडिया धीरे एक अच्छी तरह से नीचे की ओर ।
  2. इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 24-48 एच के लिए एक ऊतक संस्कृति मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को मशीन ।

3. caspase सक्रियण की प्रेरण

  1. एक दवा या उत्तेजना है कि caspase सक्रियण लगभग 24 घंटे के बाद अभिकर्मक लाती है के साथ इलाज ।
    1. पूर्व गर्म करने के लिए दवा की वांछित एकाग्रता जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस) इमेजिंग मीडिया (पूर्ण विकास मीडिया Hepes के साथ पूरक [20 मिमी, पीएच 7.2-7.5] और 2-mercaptoethanol [55 µ m]) और धीरे मिश्रण (तालिका 3) ।
    2. एक पिपेट या चूषण के साथ का उपयोग कर कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण और फिर, एक पिपेट का उपयोग कर, पिपेट से समाधान के 2 मिलीलीटर धीरे से नीचे की ओर अच्छी तरह से 3.1.1 ।
    3. एक इलाज नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से दवा के बिना इमेजिंग मीडिया जोड़ें ।
  2. एक ऊतक संस्कृति मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन या एक समय चूक प्रयोग के लिए 4.3 कदम आगे बढ़ना ।

4. Caspase BiFC डाटा अर्ज

  1. सिंगल टाइम पॉइंट अर्जन के लिए Caspase BiFC
    1. माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत पर निर्माता के निर्देशों के बाद चालू करें ।
    2. आरएफपी फिल्टर के नीचे कोशिकाओं का पता लगाएं और रिपोर्टर जीन प्रतिदीप्ति पर ध्यान दें ।
    3. एक हाथ से मिलान काउंटर का उपयोग करना, दृश्य क्षेत्र में आरएफपी-सकारात्मक कोशिकाओं के सभी गिनती । संख्या रिकॉर्ड है ।
    4. एक ही दृश्य फ़ील्ड को बनाए रखते हुए, GFP फ़िल्टर (या YFP फ़िल्टर यदि उपलब्ध हो) पर स्विच करें और, एक हाथ से मिलान काउंटर का उपयोग करके, लाल कोशिकाओं की संख्या भी हरा (वीनस-पॉजिटिव) गिनती । केवल लाल कोशिकाओं वीनस-धनात्मकता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए दो फिल्टर के बीच आगे और पीछे स्विच. संख्या रिकॉर्ड (आरेख 3) ।
    5. प्लेट के प्रत्येक तीन अलग-अलग क्षेत्रों से आरएफपी-धनात्मक कोशिकाओं की गणना
    6. प्रत्येक क्षेत्र में, वीनस-पॉजिटिव transfected कोशिकाओं (यानी लाल कोशिकाओं है कि भी हरे रंग की) के प्रतिशत की गणना । परिणामी प्रतिशत को मानक विचलन प्राप्त करने के लिए औसत ।
  2. caspase BiFC की तीन आयामी इमेजिंग
    1. निर्माता के निर्देशों के बाद माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें ।
    2. 60x या 63x तेल उद्देश्य का चयन करें और उद्देश्य पर तेल की एक बूंद जगह
    3. सही प्लेट धारक का उपयोग करते हुए माइक्रोस्कोप स्टेज पर कल्चरल डिश लगाएं ।
    4. या तो एक epifluorescence प्रकाश स्रोत और माइक्रोस्कोप आंख टुकड़ा या फोकल पराबैंगनीकिरण और कंप्यूटर स्क्रीन का उपयोग करना, ब्याज की एक क्षेत्र के लिए नेविगेट ।
    5. आरएफपी लेजर या फिल्टर का उपयोग कर रिपोर्टर प्रतिदीप्ति पर ध्यान दें ।
    6. यदि epifluorescence इस बिंदु तक इस्तेमाल किया गया है, फोकल पराबैंगनीकिरण के लिए प्रकाश स्रोत स्विच और कैमरे द्वारा अधिग्रहीत और कंप्यूटर स्क्रीन पर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदर्शित के रूप में कोशिकाओं की लाइव छवि कल्पना ।
    7. जॉयस्टिक नियंत्रण और फ़ोकस व्हील का उपयोग करके, कक्षों की फ़ोकस और स्थिति को ठीक ट्यून करें, ताकि कक्ष दृश्य खोजक के केंद्र में हों. उन कक्षों को चुनें जो एक दूसरे से अलग होते है और अधिव्याप्त नहीं होते हैं ।
    8. इनपुट प्रतिशत लेजर बिजली 50% करने के लिए और जोखिम समय के लिए 100 ms में दोनों शुक्र और आरएफपी के लिए इष्टतम सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए प्रयोग करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में निर्धारित करें ।
    9. लाइव कैप्चर चालू करें और परिणामी छवि और दोनों चैनल के लिए प्रदर्शन हिस्टोग्राम के साथ निरीक्षण ।
    10. यदि संकेत कम है और छवि को बाहर करना कठिन है, प्रतिशत लेजर शक्ति और वृद्धि में/या जोखिम समय बढ़ाने जब तक छवि में संकेत अच्छा लग रहा है ।
    11. सुनिश्चित करें कि संकेत संतृप्ति तक पहुंच नहीं है । निरीक्षण हिस्टोग्राम सुनिश्चित करें कि एक अलग चोटी प्रत्येक fluor के लिए दृश्यमान है बनाने के लिए । यदि शिखर पूरे हिस्टोग्राम प्रदर्शन, इनपुट कम लेजर शक्ति और प्रदर्शन सेटिंग्स (चित्रा 2) शामिल हैं ।
    12. नियंत्रण (अनुपचारित या गैर-transfected) कक्षों को समान शर्तों के अंतर्गत विज़ुअलाइज़ करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि संकेत विशिष्ट है.
      नोट: एकल रंग transfectants भी अंतरराष्ट्रीय के लिए नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अगर संकेतों को विशेष रूप से अलग कर रहे हैं (उदा mitochondrial बनाम cytosolic) यह आवश्यक नहीं है ।
    13. का चयन करें या माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में जेड स्टैक मॉड्यूल खोलें ।
    14. फोकस घुंडी का उपयोग करना, अनुमानित फोकल स्थिति कोशिका के केंद्र के लिए इसी.
    15. फ़ोकस को एक दिशा में तब तक समायोजित करें जब तक कक्ष अब दृश्यमान न हो, इसे शीर्ष स्थिति के रूप में चुनें ।
    16. विपरीत दिशा में फ़ोकस को तब तक समायोजित करें जब तक कि कक्ष फिर से दृश्यमान न हो और निचली स्थिति के रूप में यह चयनित हो ।
    17. इष्टतम चरण आकार चुनें (आमतौर पर लगभग 20 µm) और कैमरे को स्वचालित रूप से प्रत्येक चैनल में शीर्ष और नीचे के पदों के बीच 20 µm कदम में से प्रत्येक पर एक छवि लेने के लिए निर्देश देने के अधिग्रहण शुरू करते हैं ।
    18. 3 डी छवि (चित्रा 4, फिल्म 1) को फिर से संगठित करने के लिए 3 डी प्रतिपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
  3. caspase BiFC की समय-चूक इमेजिंग
    1. प्रयोग करने से पहले कम से 1 ज, माइक्रोस्कोप पर बारी और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है ।
    2. 40x, 60x, या 63x तेल उद्देश्य का चयन करें और उद्देश्य पर तेल की एक बूंद जगह है ।
    3. सही प्लेट धारक का उपयोग करते हुए माइक्रोस्कोप स्टेज पर कल्चरल डिश लगाएं ।
    4. यदि एक सह2 स्रोत उपलब्ध है, तो कं2 डिलिवरी डिवाइस को रखें (आमतौर पर एक सामिल ढक्कन जो कि प्लेट होल्डर के ऊपर कं2बचाता है) से जुड़ा होता है । 5% करने के लिए सह2 स्तर सेट और सॉफ्टवेयर के भीतर से सह2 नियंत्रक पर बारी । यदि कोई सह2 स्रोत उपलब्ध नहीं है, तो मीडिया बफ़र करने के लिए 20 mM Hepes शामिल करें ।
    5. transfected कोशिकाओं के एक क्षेत्र में नेविगेट और कैमरे द्वारा अधिग्रहीत और आरएफपी लेजर का उपयोग कर कंप्यूटर स्क्रीन पर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदर्शित के रूप में कोशिकाओं की लाइव छवि कल्पना ।
    6. कदम 4.2.8-4.2.12, इनपुट प्रतिशत लेजर शक्ति और आरएफपी लेजर के लिए जोखिम समय के लिए सेटिंग्स के बाद । कम के रूप में संभव के रूप में इन मूल्यों रखें, जबकि अभी भी फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा ।
    7. एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना का उपयोग (उदाहरण के लिए तालिका 3 देखें), YFP लेजर प्रकाश के लिए प्रतिशत लेजर शक्ति और जोखिम समय के लिए सेटिंग्स इनपुट करने के लिए कदम 4.2.8-4.2.12 का पालन करें. इन मूल्यों को यथासंभव कम रखें जबकि अभी भी वीनस सिग्नल का पता लगाने में सक्षम है ।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट के लिए, विभिंन पदों है कि एक या एक से अधिक रिपोर्टर एक्सप्रेस कोशिकाओं को शामिल की एक संख्या का चयन करें ।
    9. इनपुट समय-चूक और फ्रेम की कुल संख्या के प्रत्येक फ्रेम के बीच समय अंतराल लिया जाएगा । सुनिश्चित करें कि अगले फ्रेम से पहले सभी चयनित पदों को प्राप्त करने के लिए समय है लिया जाना है ।
    10. प्रत्येक स्थिति पर पुन: जाएं और आवश्यकतानुसार फ़ोकस को सही और अद्यतित करें ।
    11. फोकल बहाव है कि तापमान या बाहरी कंपन में परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं के लिए सही करने के लिए, फोकस बहाव सुधार प्रणाली पर बारी (यदि उपलब्ध है) ।
    12. समय-चूक शुरू करें और डेटा को सहेजें ।
    13. उपलब्ध इमेजिंग सॉफ़्टवेयर (चित्र 5, चलचित्र 2) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

डीएनए क्षति से प्रेरित caspase-2 BiFC का एक उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है । Camptothecin, एक चतुर्थ तोपोइसोमेरसे मैं अवरोध करनेवाला, डीएनए नुकसान और caspase-2 सक्रियण प्रेरित किया गया । लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry एक रिपोर्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है दिखाने के लिए कि कोशिकाओं BiFC जांच एक्सप्रेस और मदद करने के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या कल्पना । वीनस प्रतिदीप्ति हरे रंग में दिखाया गया है और बड़े puncta caspase-2 प्रेरित निकटता का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन कोशिकाओं को वीनस-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए गिना जा सकता है. उपसेलुलर स्थानीयकरण के बारे में निष्कर्ष भी ऐसी छवियों से बनाया जा सकता है । दिखाए गए उदाहरण में, caspase-2 प्रेरित निकटता nucleolus के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य 17 में पाया गया । caspase सक्रियण जटिल के उपसेलुलर स्थानीयकरण के उच्च संकल्प दृश्य प्रदान करने के लिए, एकल कोशिकाओं तीन आयामों में imaged किया जा सकता है । चित्रा 4 ऐसे 3 डी छवियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए दो तरीके से पता चलता है. पहले सेल के एक 3d पुनर्निर्माण उत्पंन करने के लिए है । उदाहरण लाल रंग में हरे और नाभिक में camptothecin प्रेरित caspase-2 BiFC से पता चलता है । 3 डी पुनर्निर्माण दोनों fluorophores के रिश्तेदार स्थानीयकरण कोशिकाओं भर से पता चलता है । इस प्रकार के परिणाम प्रदर्शन विशेष रूप से प्रभावी है जब किसी चलचित्र के रूप में प्रस्तुत किया गया है, तो कक्ष को एक एकल अक्ष (चलचित्र 1) के आसपास घुमाना । दूसरा पैनल इसी सेल का ओर्थोगोनल व्यू है । यह कक्ष के xy, xz, और yz दृश्य को कक्ष में किसी विशेष बिंदु पर प्रदान करता है । इस तरह के परिणामों का चित्रण अधिक एक पत्रिका लेख में जैसे एक कागज प्रस्तुति के लिए उपयुक्त हो सकता है के रूप में यह एक 2d प्रारूप में प्रस्तुत 3 डी डेटा की व्याख्या आसान है । चित्रा 5 एक ग्लियोब्लास्टोमा सेल proteasome अवरोधक bortezomib के साथ इलाज लाइन में caspase-2 BiFC की समय चूक इमेजिंग का एक उदाहरण दिखाता है (यह भी फिल्म 2देखें) । यह ग्राफ़ कक्षों की संख्या में औसत रूप से औसत वीनस तीव्रता में वृद्धि दिखाता है ( 20से अनुकूलित) । इस प्रकार का डेटा एक ग्राफ़ पर एकल कक्ष ट्रैस की संख्या के रूप में भी प्रदर्शित किया जा सकता है. दिखाया उदाहरण में, caspase प्रेरित निकटता की शुरुआत के बारे में 2 एच उपचार के बाद है ।

Figure 1
चित्र 1: caspase संरचना और bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) पद्धति की योजनाबद्ध । (क) एक सर्जक caspase की सामान्य संरचना. डोमेन, बड़ी और छोटी उप इकाई, और संरक्षित QACRG आकृति जिसमें सक्रिय साइट cysteine हैं, दर्शाया गया है । (ख) BiFC विभाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करता है कि अकेले फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं, लेकिन जब प्रोटीन बातचीत करने के लिए जुड़े फ्लोरोसेंट अणु सुधार सहयोगी कर सकते हैं । caspase BiFC के लिए, डोमेन (प्रो) या पूर्ण लंबाई caspase एन-टर्मिनल आधा (वीनस-एन) के लिए और वीनस के सी-टर्मिनल आधे (वीनस-सी) से जुड़े हुए है । उनके monomeric राज्य में caspase फ्यूजन प्रोटीन फ्लोरोसेंट नहीं हैं. एक सक्रियकरण मंच के लिए भर्ती पर, जैसे PIDDosome के रूप में, यहां दिखाया गया है, वीनस के दो हिस्सों के संघ caspase प्रेरित निकटता है कि वीनस प्रतिदीप्ति में वृद्धि के रूप में मापा जाता है का प्रतिनिधित्व लागू है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रदर्शन हिस्टोग्राम का उपयोग कर संतृप्ति पहचानने के लिए प्रतिनिधि छवि. इष्टतम (ऊपरी पैनल) और संतृप्त संकेतों (निचले पैनल) के उदाहरण दिखाए जाते हैं । इसमें वीनस (पीली चोटी) और आरएफपी (लाल चोटी) के सिग्नल दिखाए गए हैं । x-अक्ष तीव्रता इंगित करता है और y-अक्ष पिक्सेल्स की संख्या है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Caspase-2 bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) डीएनए क्षति के बाद । हेला caspase-2 BiFC घटक व्यक्त कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया गया (क) या camptothecin के साथ इलाज (100 µ m) (ख) qVD-OPH (20 µ m) की उपस्थिति में । mCherry सह एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में व्यक्त किया गया । प्रतिनिधि छवियां कोशिकाओं (लाल) caspase-2 BiFC (हरी) के साथ camptothecin-इलाज कोशिकाओं में 16 h उपचार के बाद दिखाते हैं । स्केल पट्टियां 20 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: caspase-2 के स्थानीयकरण bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) । हेला कोशिकाओं caspase-2 BiFC घटकों और एक फ्लोरोसेंट परमाणु रिपोर्टर एक्सप्रेस µ-qVD (20 OPH एम) की उपस्थिति में camptothecin (20 µ मीटर) के साथ इलाज किया गया । 3 डी के z-विमान के माध्यम से 0.1 माइक्रोन धारावाहिक फोकल छवियों से बना पुनर्निर्माण 24 घंटे के बाद किया गया और लाल और caspase में नाभिक शो-2 हरे रंग में BiFC । वाम पैनल एक 3 डी अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्रतिपादन पुनर्निर्माण दिखाता है (यह भी फिल्म 1 देखें) । दायां फलक उसी कक्ष के ओर्थोगोनल स्लाइस दृश्य दिखाता है । मध्य बॉक्स (नीला) xy विमान है, सही बॉक्स (पीला) yz विमान है, और शीर्ष बॉक्स (सफेद) xz विमान है । पार बाल के अनुसार yz और xz विमानों को काटना । स्केल पट्टियां 10 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: caspase bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक की समय-चूक (BiFC) (क) LN18 ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के साथ transfected caspase-2 BiFC घटकों और एक लाल फ्लोरोसेंट mitochondrial मार्कर (DsRed-मिळो, लाल) bortezomib (15 एनएम) के साथ qVD-OPH (20 µ एम) की उपस्थिति में इलाज किया गया । कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक फोकल माइक्रोस्कोप पर रखा गया था और छवियों को समय चूक शो से प्रतिनिधि कोशिकाओं के 8 घंटे की छवियों के लिए हर 2 मिनट के लिए लिया गया था कि दो caspase-2 BiFC घटकों के प्रेरित निकटता वीनस प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई ( ग्रीन) समय के साथ । (ख) प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक कोशिका में शुक्र की औसत तीव्रता मापी जाती थी. bortezomib उपचार के बाद समय के साथ वीनस प्रतिदीप्ति बढ़ गई । अनुपचारित नियंत्रण में विभाजन लेजर प्रकाश से कम या नगण्य विषाक्तता की स्थिति का संकेत ( 20से अनुकूलित आंकड़ा) । स्केल पट्टियाँ 20 µm. error पट्टियों का प्रतिनिधित्व करते हैं (SEM) 8 (नियंत्रण) और 14 (bortezomib) व्यक्तिगत कोशिकाओं का मतलब मानक त्रुटि (यह भी फिल्म 2 देखें). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्लेट का आकार कक्षों की संख्या मीडिया की मात्रा
6 वेल प्लेट 1 x 105 कोशिकाओं को अच्छी तरह से/ 2 मिलीलीटर
12 वेल प्लेट 5x 104 सेल/ 1 मिलीलीटर
24 वेल प्लेट 2.5 x 104 कक्ष/ 0.5 मिलीलीटर
4 चैंबर डिश 2.5 x 104 कक्ष/ 1 मिलीलीटर
8 चैंबर डिश सवा x 104 कक्ष/ 0.5 मिलीलीटर

तालिका 1: कक्षों की संख्याओं के लिए दिशा-निर्देश प्लेट. यदि छुरा caspase bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC) घटक, प्लेट डबल व्यक्त यहां दिखाया मात्रा का उपयोग कर ।

प्लेट का आकार अभिकर्मक रिएजेंट कम सीरम मीडिया रिपोर्टर प्लाज्मिड Caspase-प्रो वीसी प्लाज्मिड Caspase-प्रो VN प्लाज्मिड कम सीरम मीडिया प्लाज्मिड मिश्रण करने के लिए जोड़ा अभिकर्मक रिएजेंट समाधान प्लाज्मिड मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया सीरम मुक्त मीडिया कोशिकाओं को जोड़ा
6 वेल प्लेट 12 µ l थाली/ 750 µ एल 10 एनजी 20 एनजी 20 एनजी को कुल 100 µ l 100 µ l 800 µ l
12 वेल प्लेट 12 µ l थाली/ 750 µ एल 5 एनजी 10 एनजी 10 एनजी को कुल 50 µ l 50 µ l 400 µ l
24 वेल प्लेट 12 µ l थाली/ 750 µ एल 2.5 एनजी 5 एनजी 5 एनजी को कुल 25 µ l 25 µ l 200 µ l
4 चैंबर डिश 4 µ l थाली/ 250 µ l 2.5 एनजी 5 एनजी 5 एनजी को कुल 25 µ l 25 µ l 200 µ l
8 चैंबर डिश 4 µ l थाली/ 250 µ l सवा एनजी 2.5 एनजी 2.5 एनजी को कुल 12.5 µ l 12.5 µ l 100 µ l

तालिका 2: परिवर्तनीय अभिकर्मक के लिए उपयोग किए गए एजेंट की अनुशंसित वॉल्यूम. नोट: प्लाज्मिड की राशि का सुझाव दिया केवल एक प्रारंभिक बिंदु है । कोई संकेत का पता चला है, तो यह एक 6-well थाली के प्रति अच्छी तरह से 20-200 एनजी से प्लाज्मिड अनुमापन करने के लिए सिफारिश की है ।

Caspase उपचार एकाग्रता समय अपेक्षित परिणाम
Caspase-1 अधिक व्यक्त ए एस सी 250 अच्छी तरह से एक 6 प्लेट के एनजी/ 48 ज ५० टक्के BiFC सकारात्मक
Caspase-2 मतदानकर्मियों ने किया छापा एक 6 अच्छी तरह से थाली के 500 एनजी/ 24 ज ९० टक्के BiFC सकारात्मक
Camptothecin 100 µ मी 16 ज 30-60% BiFC सकारात्मक
हीट शॉक 45 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज 16 ज ८० टक्के BiFC सकारात्मक
Caspase-4 व्यक्ती NALP1 250 अच्छी तरह से एक 6 प्लेट के एनजी/ 48 ज ३० टक्के BiFC सकारात्मक
Caspase-5 व्यक्ती IPAF 250 अच्छी तरह से एक 6 प्लेट के एनजी/ 48 ज १५ टक्के BiFC सकारात्मक

तालिका 3: caspase bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) के लिए धनात्मक नियंत्रणों के उदाहरण. शर्तों और अपेक्षित परिणाम प्रकाशित डेटा के आधार पर प्रो constructes 14,17,18का उपयोग कर रहे हैं । सह-व्यक्त plasmids के साथ transfected होना चाहिए BiFC plasmids (Step 2.1.4)

Movie 1
Movie 1:3d स्थानीयकरण of caspase-2 bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC). 3 डी पुनर्निर्माण, एक हेला कोशिकाओं के जेडविमान के माध्यम से फोकल छवियों के वाई-अक्ष के चारों ओर घुमाया caspase-2-BiFC घटकों और एक फ्लोरोसेंट परमाणु रिपोर्टर camptothecin के साथ इलाज किया गया (20 µ एम) 16 के लिए एच । फिल्म caspase-2 BiFC (ग्रीन), और नाभिक (लाल) से पता चलता है । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
Movie 2: caspase की समय-चूक-2 bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) । LN18 ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं caspase-2 BiFC घटकों के साथ transfected और bortezomib (15 एनएम) के साथ इलाज किया गया 8 घंटे के लिए हर 2 मिनट imaged । फिल्म caspase-2 BiFC (ग्रीन), और mitochondria (लाल) से पता चलता है । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इस प्रोटोकॉल caspase प्रेरित निकटता को मापने के लिए भाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग पर चर्चा की । इस तकनीक के लिए भाजित वीनस को चुना गया क्योंकि यह बहुत चमकीला, अत्यधिक photostable है और इसका खुलासा तेजी से 13है । इस प्रकार, caspase प्रेरित निकटता पर खुलासा वीनस के विश्लेषण caspase प्रोटीन संपर्क गतिशीलता के वास्तविक समय के आकलन के करीब प्रदान कर सकते हैं । शुक्र दो थोड़ा अतिव्यापी टुकड़ों में विभाजित है, N वीनस के टर्मिनस (वीनस-n या VN) एमिनो एसिड 1-173 और सी टर्मिनल टुकड़ा (वीनस-सी या कुलपति) अवशेषों शामिल 155-239 । अंय विभाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन मौजूद है लेकिन कुछ, ऐसे विभाजन mCherry के रूप में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए 21गुना के लिए मशीन की आवश्यकता है । भाजित आसमानी सहित अतिरिक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन भाजित (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक संस्करण) और अब तक लाल विभाजन mLumin अभी तक इस संदर्भ में परीक्षण किया जा 13,22। अंत में, यदि इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन caspase प्रेरित निकटता को मापने के लिए उपयुक्त साबित, यह एकाधिक caspases के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति सकता है ।

आम तौर पर, caspase के डोमेन (प्रो) क्षेत्र विभाजित फ्लोरोसेंट टुकड़े करने के लिए जुड़े हुए है । इस क्षेत्र में सक्रियण प्लेटफ़ॉर्म से बाइंड करने के लिए आवश्यक caspase का ंयूनतम भाग होता है और कार्ड या DED सहभागिता आकृति शामिल होती है । डोमेन का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह कोशिकाओं को किसी भी एंजाइमी गतिविधि का परिचय नहीं है । यह अंतर्जात caspase के कारण बहाव की घटनाओं की एक साथ निगरानी के लिए अनुमति देता है । अनुसंधान की तारीख को कैनेटीक्स और डोमेन के बीच caspase BiFC के स्थानीयकरण और पूर्ण लंबाई caspase 14में थोड़ा अंतर दिखाया गया है । हालांकि, पूर्ण लंबाई के निर्माण के लिए कम कुशलता के साथ व्यक्त करते हैं, प्लाज्मिड डीएनए की वृद्धि हुई मात्रा के अभिकर्मक necessitating । इसके अलावा, यह अभिव्यक्ति पर caspase प्रेरित apoptosis को रोकने के लिए एक serine के लिए उत्प्रेरक cysteine रूपांतरित करना करने के लिए सिफारिश की है । इन कमियों के बावजूद, कुछ जांच पूरी लंबाई BiFC जोड़े के समवर्ती विश्लेषण की आवश्यकता को निर्धारित कर सकते है अगर वहां संदर्भ caspase उपस्थिति या उत्प्रेरक डोमेन की अनुपस्थिति में निकटता प्रेरित में मतभेद हैं ।

यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से हेला कक्षों के लिए अनुकूलित है । एक ही प्रोटोकॉल स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन, MCF-7, ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन, LN18, और माउस भ्रूण fibroblasts (MEF) सहित अतिरिक्त अनुयाई सेल लाइनों के लिए अच्छी तरह से काम करता है । यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता इस प्रोटोकॉल को किसी नए कक्ष प्रकार में रूपांतरित करते समय दोनों को चढ़ाना और अभिकर्मक शर्तों को ऑप्टिमाइज़ करता है । epifluorescence और फोकल माइक्रोस्कोप: प्रोटोकॉल दो मुख्य सूक्ष्म दृष्टिकोण है कि कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन. जब फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, कोशिकाओं कांच coverslips पर चढ़ाया जाना चाहिए क्योंकि उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के बहुमत है कि फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है प्लास्टिक के बर्तन या कांच स्लाइड की मोटाई घुसना नहीं होगा । इस प्रकार, यह ०.१७ mm की इष्टतम coverslip मोटाई है कि एंबेडेड नहीं 1.5 ग्लास coverslips के साथ व्यंजन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । इन व्यंजनों के विभिंन प्रकार के एक नंबर उपलब्ध है कि व्यक्तिगत 3 मुख्यमंत्री व्यंजन से लेकर, मानक आकार बहु अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, कक्ष स्लाइड के लिए । टेबल 1 और 2 रूपरेखा कैसे अलग अच्छी तरह से आकार के लिए चढ़ाना और अभिकर्मक निर्देश अनुकूलित करने के लिए । epifluorescence इमेजिंग है कि यहां वर्णित है (4.1) के लिए, मानक प्लास्टिक ऊतक संस्कृति प्लेटों के रूप में लंबे समय के रूप में माइक्रोस्कोप लंबे पास उद्देश्यों के साथ सुसज्जित है जब तक पर्याप्त हैं ।

क्योंकि इस दृष्टिकोण को प्रभावी ढंग से एक "पर रोशनी" विधि caspase सक्रियण को मापने के लिए है, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के शामिल करने से पहले या caspase रिपोर्टर के सक्रियण के अभाव में कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति के लिए आवश्यक है और पहचान transfected कोशिकाओं, जब क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है । विभिंन पत्रकारों के एक नंबर और इस्तेमाल किया जा सकता है केवल जब एक को चुनने के मानदंड हैं: 1) fluorophore पर्याप्त उज्ज्वल इतना है कि यह आसानी से इमेजिंग प्रोटोकॉल द्वारा पता लगाया जा सकता है; और 2) अपनी फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम YFP के साथ ओवरलैप नहीं करता है । उदाहरण के लिए, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह YFP फ़िल्टर या वीनस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल लेजर द्वारा पता लगाया जाएगा । यह दो fluorophores के वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण है । एक fluorophore है कि एक विशिष्ट organelle के लिए स्थानीयकरण का चयन अतिरिक्त गुणात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन का उपयोग करें कि mitochondria लक्ष्य, जैसे लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed-मिळो, सेल की समग्र व्यवहार्यता पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं । Mitochondria को कोशिका मृत्यु 23 के प्रारंभिक दौर के दौरान विखंडन (विखंडन) से गुजरना करते है और यह DsRed की तरह एक रिपोर्टर-मिळो के साथ visualized किया जा सकता है । एक रिपोर्टर के रूप में एक organelle मार्कर का उपयोग भी caspase BiFC के उपसेलुलर स्थानीयकरण के बारे में निष्कर्ष की अनुमति कर सकते है बनाया जाएगा ।

वहां तरीकों की एक संख्या है कि caspase BiFC डेटा प्राप्त किया जा सकता है और विश्लेषण कर रहे हैं । जो विधि का उपयोग करने के लिए तय मापदंडों द्वारा पता लगाया जाएगा (समापन बिंदु जनसंख्या विश्लेषण बनाम एकल कोशिका स्थिति या काइनेटिक जानकारी) और इंस्ट्रूमेंटेशन और इमेजिंग सॉफ्टवेयर की उपलब्धता । इस प्रोटोकॉल दोनों एकल समय अंक और समय चूक डेटा प्राप्त करने के लिए एक caspase BiFC प्रयोग के परिणामों को इकट्ठा करने के लिए कुछ सूक्ष्मदर्शी आधारित दृष्टिकोण की रूपरेखा । तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विविधताओं और इन तरीकों के संयोजन के लिए रचनात्मक caspase सक्रियण रास्ते पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कई ।

एकल समय बिंदु डेटा प्राप्ति (4.1) का उपयोग caspase प्रेरित निकटता वाले कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए किया जाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए, एक बस transfected कोशिकाओं है कि वीनस-सकारात्मक है की संख्या मायने रखता है । इस प्रकार, अति विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और केवल एक GFP (या YFP) और आरएफपी फिल्टर और एक हाथ टैली काउंटर के साथ सबसे बुनियादी epifluorescence माइक्रोस्कोप की जरूरत है । कुछ इमेजिंग प्रणालियों स्वचालित रूप से एक थाली के प्रति अच्छी तरह से छवियों का एक सेट संख्या ले स्वचालित किया जा सकता है । यदि ऐसी इंस्ट्रूमेंटेशन उपलब्ध है, तो अधिग्रहीत छवियों में कोशिकाओं को इसी तरह दृश्य निरीक्षण, या इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantitated द्वारा गिना जा सकता है । तीन आयामी इमेजिंग (4.2) सेल के फोकल विमानों भर में caspase BiFC के उच्च संकल्प छवियों प्रदान करता है । वीनस और आरएफपी (या चुना अभिकर्मक रिपोर्टर) और जेड-स्टैक क्षमताओं को उत्तेजित कि पराबैंगनीकिरण के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है । 3 डी प्रतिपादन सॉफ्टवेयर मॉड्यूल के एक नंबर उपलब्ध है कि डेटा कल्पना करने के लिए अलग तरीके प्रदान कर रहे हैं । विश्लेषण के इन दोनों प्रकार के लिए, यह कोशिकाओं और छवि ठीक है या उंहें एक बाद में बिंदु पर आकलन संभव है । हालांकि, निर्धारण की प्रक्रिया वीनस संकेत कम करता है, जो विश्लेषण के लिए कलाकृतियों जोड़ सकता है और इसलिए इस दृष्टिकोण की सिफारिश नहीं है । समय चूक इमेजिंग (4.3) caspase BiFC के एक साथ काइनेटिक और स्थिति विश्लेषण प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक motorists एक मोटर चालित मंच के साथ सुसज्जित करने के लिए कई पदों की छवियों को लेने के लिए स्थापित किया जा सकता है और यहां तक कि एक ही प्रयोग में अलग उपचार समूहों की तुलना ।

समय-चूक के लिए, अतिरिक्त विचार की एक संख्या को ध्यान में रखा जाना चाहिए । लेजर लाइट phototoxicity या photobleaching के कारण कलाकृतियों का कारण बन सकती है और दोनों के लिए नियंत्रित होने की जरूरत है । सामान्य में, दोनों प्रकाश की सबसे कम संभव राशि का उपयोग करके बचा जा सकता है (इनपुट कम प्रतिशत लेजर शक्ति और कम जोखिम बार 4.3.6-4.3.7 में कदम). Phototoxicity परिणाम जब लेजर प्रकाश कोशिकाओं में मौत लाती है और एक ही स्थिति के तहत इमेजिंग अनुपचारित कोशिकाओं के लिए नियंत्रित किया जा सकता है और पुष्टि की है कि कोशिका विभाजन के रूप में सामांय आय । Photobleaching तब होती है जब एक ही कक्ष के लिया एकाधिक छवियां प्रतिदीप्ति घटाता है । वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन काफी photostable है, इसलिए यह शायद ही कभी व्यवहार में एक समस्या है । photobleaching के प्रभाव एक शुक्र-सकारात्मक कोशिका के कई अनुक्रमिक छवियों को लेने और सुनिश्चित करना है कि प्रतिदीप्ति स्थिर रहता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यह केवल एक बार किया जाना चाहिए, जब तक एक ही लेजर शक्ति और प्रदर्शन सेटिंग्स हर प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है । phototoxicity या photobleaching के कारण प्रभाव पर कब्जा कर लिया छवियों की कुल संख्या को कम करने के द्वारा भी कम किया जा सकता है. यह लंबी या कब्जा (चरण 4.3.9) के बीच समय अंतराल छोटा करके प्राप्त किया जा सकता है । एक 16 घंटे की चूक पर 5-10 मिनट के अंतराल का प्रयोग एक अच्छी जगह के लिए शुरू है । यदि कोई photoxicity मनाया जाता है या कम अवधि के प्रयोगों की आवश्यकता है, फ्रेम के बीच अंतराल को कम किया जा सकता है । यदि caspase सक्रियण तेजी से है, कम समय अंतराल के साथ छोटे प्रयोगों इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, 10 मिनट के अंतराल के साथ 16 h प्रयोग के लिए, कुल 192 छवियां ली जाएंगी (96 प्रत्येक fluorophore के लिए) । 1.5 मीटर के अंतराल के साथ एक 2 एच प्रयोग 160 छवियां निकलेगा । इसलिए, लंबी और छोटी प्रयोगों प्रत्येक लेजर प्रकाश की इसी तरह की कुल मात्रा के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश होगा । कम अवधि के प्रयोगों के लिए caspase सक्रिय उत्तेजना सीधे मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है तुरंत समय चूक कब्जा की दीक्षा से पहले (चरण 4.3.11 के बजाय चरण 3 पर) । ऐसा करने के लिए, प्लेट से ढक्कन निकालें और धीरे एक पिपेट का उपयोग कर उत्तेजना युक्त समाधान में ड्रॉप । ध्यान रखें कि प्लेट को झटका न करें और जल्दी से जांच लें कि आगे बढ़ने से पहले कोशिकाएं अभी भी फोकस में हैं ।

जब समय चूक प्रयोगों बाहर ले जाने, यह भी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं के तत्काल पर्यावरण बारीकी से एक ऊतक संस्कृति मशीन के जैसा दिखता है । पर्यावरण नियंत्रण के एक नंबर अलग माइक्रोस्कोप सेट अप पर उपलब्ध हैं । इन छोटे चरण शीर्ष मशीन के साथ ही पर्यावरण मंडलों कि पूरे माइक्रोस्कोप encapsulate शामिल हैं । इन उपकरणों के दोनों आम तौर पर गर्मी, सह2उद्धार, और एक तरह से है कि ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है में चैंबर के लिए आर्द्रता । सह2 और तापमान के सटीक नियंत्रण प्रयोग की सफलता के लिए आवश्यक है, क्योंकि अप्रत्याशित तापमान में उतार चढ़ाव फोकल बहाव और सह की अनुपस्थिति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं2 कारण मीडिया के पीएच को वृद्धि करने के लिए कि कोशिकाओं को विषाक्त किया जा सकता है । यदि एक सह2 स्रोत उपलब्ध नहीं है, तो मीडिया Hepes के अतिरिक्त द्वारा बफ़र किया जा सकता है (चरण 3.1.1 देखें) । भले ही एक सह2 स्रोत उपलब्ध है, यह कोशिकाओं को स्वस्थ रखने के लिए एक अतिरिक्त उपाय के रूप में इमेजिंग माध्यम में Hepes को शामिल करने के लिए सिफारिश की है । हालांकि, यहां तक कि Hepes की उपस्थिति में, समय की लंबी अवधि के लिए2 सह के अभाव कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है । इसलिए, यह इलाज कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक ही स्थिति के तहत imaged, और प्रयोग के समापन पर मीडिया का रंग यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीएच स्थिर बनी हुई है । ध्यान दें कि phenol red के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया मीडिया में से किसी से लोप होने की जरूरत नहीं है autofluorescence शुक्र संकेत करने के लिए योगदान के बाद से कम है ।

एक समय चूक प्रयोग से उत्पंन इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध तरीकों की एक संख्या है । transfected सेल प्रति वीनस पिक्सल का मतलब तीव्रता मापने caspase प्रेरित निकटता के समय का विश्लेषण करने के लिए सबसे सरल तरीका है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, चित्रा 4, चित्रा 5, caspase-2 BiFC अक्सर एक या एक से अधिक puncta विभिन्न उपसेलुलर डिब्बों में स्थित के रूप में प्रकट होता है. इमेजिंग विश्लेषण दृष्टिकोण है कि घावों की संख्या को मापने, वस्तु आकार, या अतिरिक्त समान कारकों इन संरचनाओं के बारे में जानकारीपूर्ण मात्रात्मक डेटा उपज कर सकते हैं । नहीं सभी caspase BiFC puncta के रूप में प्रकट होता है । उदाहरण के लिए, भड़काऊ caspases अलग BiFC पैटर्न फैलाना प्रतिदीप्ति, रेशा संरचनाओं, और एक या एक से अधिक puncta प्रति सेल 18सहित दिखा दिया है । इन नमूनों सक्रिय caspase पर निर्भर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नदी के ऊपर सक्रिय संकेतों थे । इसलिए, विश्लेषण के प्रकार है कि समय चूक परिणामों के लिए सबसे उपयुक्त है काफी हद तक फ्लोरोसेंट पैटर्न है कि मनाया जाता है के प्रकार से तय किया जाएगा ।

उपचार उत्तेजनाओं कि मूल्यांकन कर रहे है जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे है के कई apoptosis या तो सीधे caspase के माध्यम से विश्लेषण या परोक्ष रूप से एक अलग कोशिका मृत्यु मार्ग आकर्षक द्वारा प्रेरित करेगा । यह कोशिकाओं को सिकोड़ें और थाली से अलग करने के लिए कारण बनता है, जो यह बहुत मुश्किल कोशिकाओं और caspase-BiFC के किसी भी विशिष्ट स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए लगभग असंभव छवि के लिए बनाता है । एक पैन caspase अवरोधक का समावेश इस सेल मौत को रोकने जाएगा । उनके सक्रियण प्लेटफार्मों और संबद्ध caspase BiFC को caspases की भर्ती caspase की उत्प्रेरक गतिविधि पर निर्भर नहीं है । इसलिए, caspase निषेध इस कदम पर कोई प्रभाव नहीं होगा, लेकिन blebbing, टुकड़ी, और प्लाज्मा झिल्ली अखंडता में अंतिम नुकसान सहित apoptosis के बहाव शारीरिक विशेषताओं को बाधित करेगा । इस प्रकार, अगर समापन बिंदु विश्लेषण (4.1 कदम) या जेड के ढेर (कदम 4.2), एक caspase अवरोधक के शामिल किए जाने के लिए आवश्यक है । इसके विपरीत में समय चूक प्रयोगों के लिए, यदि apoptosis-MOMP, annexin V बाध्यकारी जैसे घटनाओं से संबंधित (phosphatidyl serine एक्सपोजर का पता लगाने के लिए) या propidium आयोडाइड (प्लाज्मा झिल्ली permeabilization का पता लगाने के लिए) caspase BiFC के साथ विश्लेषण किया जा रहे हैं, caspase अवरोधक इन घटनाओं के निषेध को रोकने के लिए लोप किया जाना चाहिए । ऐसे qVD-OPh (10-20 µ एम) के रूप में एक caspase अवरोधक के लिए मीडिया है कि apoptosis उत्प्रेरण उत्तेजना (कदम 3.1.1) शामिल में जोड़ा जाना चाहिए । यदि कं caspase BiFC घटकों के साथ एक समर्थक अपोप्तोटिक प्रोटीन व्यक्त, caspase अवरोधक कदम 2.1.12 में जोड़ा जाना चाहिए ।

जबकि caspase BiFC कुछ उपलब्ध तरीकों में से एक है जो caspase सक्रियण मार्ग में लाइव कोशिकाओं में घटनाओं की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन प्रयोगों को डिज़ाइन करते समय ध्यान में कई विचार किए जाने चाहिए । क्योंकि इस दृष्टिकोण व्यक्त-आधारित है, विशिष्टता के लिए नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं । यह दो तरीकों में से एक में पूरा किया जा सकता है । पहला, कार्ड या caspase डोमेन के DED में एकल बिंदु उत्परिवर्तनों का परिचय इस तरह है कि वे caspase और उसके सक्रियकरण मंच के बीच बंधन बाधित caspase BiFC की तीव्रता दोनों और वीनस का प्रतिशत कम होना चाहिए सकारात्मक कोशिकाओं. उदाहरण के लिए, अवशेषों के उत्परिवर्तन D59 caspase के डोमेन में ई-1 बाधित अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी के लिए बाध्यकारी (apoptosis-जुड़े धब्बा प्रोटीन की तरह एक कार्ड युक्त) और समान रूप से बाधित ए एस सी प्रेरित caspase-1 BiFC 18,24 . दूसरा, कोशिकाओं है कि अनुकूलक प्रोटीन की कमी है कि सक्रियण मंच के लिए caspase भर्ती विशिष्ट BiFC संकेतों में कमी होगी का उपयोग करें । यह नॉकआउट कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, अगर उपलब्ध है, या सिरना या CRISPR/Cas9 आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए अनुकूली की कोशिकाओं को चूस । तदनुसार, caspase के घट-2 अनुकूलक प्रोटीन पूरी तरह से अवरुद्ध caspase-2 गर्मी सदमे या डीएनए क्षति से प्रेरित BiFC 14,17मारा । इन प्रयोगों के लिए, नॉकआउट या पछाड़ना कोशिकाओं मिलान नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलना की जानी चाहिए (यानी कूड़े से मिलान जंगली प्रकार MEF या नियंत्रण पछाड़ना कोशिकाओं) और, अगर एक नई कोशिका लाइन का उपयोग किया जाता है, इष्टतम अभिकर्मक शर्तों के बराबर सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए कक्ष पंक्तियों में BiFC रिपोर्टर की अभिव्यक्ति ।

इस दृष्टिकोण की एक दूसरी सीमा है कि, क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करना मुश्किल है कि प्रत्येक कोशिका प्रत्येक प्रोटीन की बराबर मात्रा व्यक्त कर रही है । यदि अभिव्यक्ति असमान है, एक वीनस टुकड़ा उच्च आवृत्तियों पर मंच पर भर्ती किया जा सकता है । यह पूर्ण फ्लोरोसेंट संकेत मुखौटा और झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस समस्या से उबरने के लिए स्थिर सेल लाइन जनरेशन के लिए caspase BiFC रिपोर्टर का एक नया वर्जन हाल ही में 17बताया गया । इस नए संस्करण एक निर्माण कि वायरल 2a स्वयं से अलग एक खुला पढ़ने के फ्रेम पर प्रो C2-BiFC घटक व्यक्त की शामिल-सट पेप्टाइड 25. इसलिए, BiFC घटक एक ही प्रवर्तक से एक एकल mRNA के रूप में लिखित लेकिन कुलपति और VN फ्यूजन प्रोटीन के stoichiometrically बराबर मात्रा में उत्पादन के लिए अनुवाद कर रहे हैं । इस कक्ष को छुरे से व्यक्त करने के लिए उत्पंन लाइनों के निर्माण के क्षणिक रिपोर्टर व्यक्त करने के लिए सक्रियण के समान प्रवृत्तियों का प्रदर्शन किया, लेकिन दोनों और अधिक संवेदनशील थे और कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शित । इस प्रकार, इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल बहुत अगर रिपोर्टर सेल लाइनों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि छुरा caspase BiFC घटक व्यक्त सरलीकृत ।

तिथि करने के लिए डेटा caspase BiFC घटकों और अंतर्जात प्रोटीन के बीच ंयूनतम हस्तक्षेप का सुझाव देते हैं । उदाहरण के लिए, caspase-2 के ऊपर MOMP के ऊपर सक्रिय होने के लिए जाना जाता है लेकिन caspase-2 BiFC ने MOMP 14की प्रगति को ब्लॉक नहीं किया । इस प्रकार, इन पत्रकारों को एक प्रमुख नकारात्मक फैशन में अभिनय नहीं दिखाई देते हैं । हालांकि, अगर एक साथ बहाव की घटनाओं का मूल्यांकन, यह प्रयोग के प्रत्येक सेट के भीतर जांच की जानी चाहिए । एक नियंत्रण गैर transfected सहित प्रयोग में अच्छी तरह से इस दृष्टिकोण का सबसे अच्छा तरीका है । यदि कोशिका मृत्यु के कैनेटीक्स के साथ या caspase संवेदक की अभिव्यक्ति के बिना अपरिवर्तित हैं, यह संकेत देगा कि caspase-BiFC घटक अंतर्जात फ़ंक्शन के साथ हस्तक्षेप नहीं कर रहे हैं । इसके विपरीत, अंतर्जात caspase संभवतः BiFC readout को प्रभावित कर सकता है, या तो दक्षता में या संरचनाओं के आकार या आकृति में । caspase के लिए कमी कोशिकाओं में रिपोर्टर व्यक्त इस के लिए नियंत्रित करेगा ।

इन सीमाओं के बावजूद, caspase BiFC तकनीक caspase सक्रियण मार्ग है कि पूरक कर सकते है और यहां तक कि मौजूदा दृष्टिकोण पर सुधार करने के लिए सर्जक caspase सक्रियण उपाय पूछताछ करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । प्रेरित निकटता मापने के द्वारा, सक्रियण में पहला कदम, इस तकनीक caspase ऑटो-सक्रियण के साथ जुड़े प्रसंस्करण के रूप में बाद में कदम मापने के साथ जुड़े समस्याओं पर काबू । उदाहरण के लिए, जबकि पश्चिमी दाग का उपयोग करने के लिए जल्लाद caspases, caspase-3 और caspase-7 के दरार की निगरानी, सक्रियकरण के एक सटीक उपाय 2प्रदान करता है, सर्जक caspases के लिए एक ही दृष्टिकोण का उपयोग त्रुटिपूर्ण हो सकता है । यह इसलिए है क्योंकि प्रारंभकर्ता caspases के क्लीवेज, सक्रियण के लिए 4,26,27के लिए पर्याप्त नहीं है । वास्तव में, कई सर्जक caspases सक्रिय एंजाइमों के उत्पादन के बिना caspase-3 द्वारा apoptosis के दौरान सट रहे हैं 28. इसी तरह, विशिष्ट caspases के लिए लक्ष्य के रूप में डिजाइन पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग कर के आधार पर तकनीक को ध्यान में caspases 29के लिए इन दृश्यों के अतिव्यापी विशिष्टताओं को ध्यान में रखना की जरूरत है । इसका मतलब यह नहीं है कि ऐसे दृष्टिकोण caspase सक्रियण को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है, लेकिन कमियां स्वीकार किया जाना चाहिए जब परिणामों की व्याख्या । Caspase BiFC एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि मदद कर सकते है और अधिक परंपरागत तरीकों का उपयोग कर परिणामों की पुष्टि प्रदान करता है । इसके अलावा, वास्तविक समय में caspase सक्रियण परिसरों के विधानसभा ट्रैक करने के लिए और स्पष्ट रूप से आकार, आकृति और परिसरों के स्थानीयकरण निर्धारित करने की क्षमता इस तकनीक है कि अंय साधनों से मूल्यांकन संभव नहीं है की एक महत्वपूर्ण लाभ है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम Bouchier-Hayes लैब जो इस तकनीक के विकास में योगदान के सभी पिछले सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम एक टेक्सास बच्चों के अस्पताल बाल चिकित्सा पायलट पुरस्कार LBH को भाग में वित्त पोषित किया गया । हम Joya चंद्रा (एमडी एंडरसन, ह्यूस्टन, टेक्सास) को उसकी टीम के सहयोग से प्रकाशित आंकड़ों को शामिल करने की अनुमति के लिए धंयवाद । रिएजेंट के विकास Cytometry और NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, और NCRR S10RR024574) और योएल एम Sederstrom की सहायता से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में कोर छंटाई सेल द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes Mattek P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore FC010-10MG
DPBS Sigma D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668019
OPTI MEM I Invitrogen 31985088
C2-Pro VC plasmid Addgene 49261
C2-Pro VN plasmid Addgene 49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components available by request from LBH
DsRed mito plasmid Clontech 632421 similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES Invitrogen 15630106
2 Mercaptoethanol 1000X Invitrogen 21985023
q-VD-OPH Apex Bio A1901

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References

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Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation. J. Vis. Exp. (133), e57316, doi:10.3791/57316 (2018).

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