Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Belysning opp veier å Caspase aktivisering med resultatet av dette fluorescens Complementation

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/57316
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC); en imaging-basert metode som kan brukes til å visualisere indusert nærhet av initiatoren caspases, som er det første trinnet i aktivisering.

Abstract

Caspase familien til proteaser spille viktige roller i apoptose og medfødt immunitet. Blant disse er en undergruppe kalles initiator caspases de første være aktivert på disse veiene. Denne gruppen omfatter caspase-2,-8, og-9, samt den inflammatoriske caspases, caspase-1-4, og-5. Initiatoren caspases aktiveres alle som dimerization etter rekruttering til bestemte multiprotein komplekser kalt aktivisering plattformer. Caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC) er en bildebehandling tilnærming der delt fluorescerende proteiner smeltet til initiativtakeren caspases brukes til å visualisere rekruttering av initiatoren caspases deres aktivisering plattformer og den resulterende indusert nærhet. Denne fluorescens gir en presentasjon av en av de tidligste trinnene som kreves for initiatoren caspase aktivisering. Bruker en rekke ulike mikroskopi-baserte tilnærminger, kan denne teknikken gi kvantitative data om effektiviteten av caspase aktivisering opp på en befolkningsnivå samt kinetics størrelse og antall caspase aktivere caspase aktivisering komplekser på per celle basis.

Introduction

Caspase protease familien er kjent for sin avgjørende roller i apoptose og medfødt immunitet 1. På grunn av deres betydning, avgjøre når, hvor og hvor effektivt bestemte caspases aktiveres kan gi viktig innsikt i mekanismer for caspase aktivisering trasé. Den tenkelig basert protokollen beskrevet her kan effekten av de tidligste trinnene i caspase aktivisering kaskade. Denne teknikken utnytter dynamisk protein: protein interaksjoner som stasjonen caspase aktivisering.

I caspases kan deles inn i to grupper: initiator-caspases (caspase-1, -2, -4, 5,-8,-9, -10 og -12) og bøddelen caspases (caspase-3-6 og -7). Bøddelen caspases finnes i cellen som preformed dimers og aktiveres som spalting mellom store og små delenhet 2. Når aktivert, hveran mange strukturelle og regulatoriske proteiner som resulterer i apoptose 3. Initiator-caspases er det første caspases aktiveres i en sti og generelt utløse aktivering av bøddelen caspases. I motsetning til bøddelen caspases aktiveres initiatoren caspases som dimerization 4,5. Denne dimerization er tilrettelagt av rekruttering av inaktive monomerer til bestemte store molekylvekt komplekser kalles aktivisering plattformer. Montering av aktivisering er underlagt en rekke bestemt protein: protein interaksjoner. Disse er formidlet av bevarte protein samhandling motiver i den proform av initiatoren caspase og inkluderer død domene (DD), død effektor domene (DED) og caspase rekruttering domene (kort) 6 (figur 1A). Aktivisering plattformer inkluderer vanligvis en reseptor protein og en adapter protein. Reseptoren aktiveres vanligvis ved binding av en ligand, indusere en conformational endring som tillater oligomerization av mange molekyler. Reseptoren deretter rekrutter enten til caspase direkte eller adapter molekyler som igjen bringer caspase til komplekset. Dermed kommer mange caspase molekyler i nærheten tillater dimerization. Dette kalles indusert nærhet modell 7. Når dimerized, gjennomgår caspase autoprocessing, som serverer å stabilisere aktiv enzym 4,8. For eksempel er montering av den Apaf1 apoptosome utløst av cytochrome c etter utgivelsen fra mitokondrier i en prosess som kalles mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP). Apaf1 rekrutterer igjen caspase-9 til en samhandling som er formidlet av et kort i begge proteiner 9. Lignende protein interaksjoner resultat i samlingen CD95 død inducing signalering komplekse (plate) som fører til caspase-8 aktiveringen. PIDDosome, som kan aktivere caspase-2; og ulike inflammasome komplekser som starter caspase-1 aktivering 10,11,12. Dermed er initiatoren caspases rekruttert til bestemte aktivisering plattformer av en felles mekanisme indusert nærhet og dimerization, uten noe som ikke skjer aktivisering.

Caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC) er en bildebehandling-basert analyse som ble utviklet for å måle denne steg for aktivering av initiatoren caspases, slik at direkte visualisering av caspase indusert nærhet etter aktivisering plattform montering. Denne metoden tar fordel av egenskapene til split fluorescerende protein Venus. Venus er en lysere og mer photostable versjon av gule fluorescerende protein (YFP) som kan deles inn i to ikke-fluorescerende og litt overlappende fragmenter: N-terminus Venus (Venus N eller VN) og C-terminus Venus (Venus C eller VC). Disse fragmentene beholder refold og bli fluorescerende i nærheten 13. Hver Venus fragment er del av prodomain av caspase, som er den minimale delen av caspase som binder aktivisering-plattformen. Dette sikrer at caspases beholder ikke enzymatisk aktivitet og derfor samtidige analyse av nedstrøms hendelser knyttet endogene hendelser er mulig. Venus fragmenter refold når caspase prodomains rekrutteres aktivisering-plattformen og gjennomgå indusert nærhet. (Figur 1B). Den resulterende Venus fluorescensen kan brukes til nøyaktig og spesielt overvåke den subcellular lokaliseringen, kinetics og effektiviteten av montering av initiatoren caspase aktivisering plattformer i enkeltceller. Bildebehandling data kan skaffes ved AC confocal mikroskopi eller standard fluorescens mikroskopi og kan tilpasses mange forskjellige mikroskopi tilnærminger inkludert: time-lapse imaging for å spore caspase aktivisering i sanntid; Høyoppløselig bilde for presise avgjørelser av subcellular lokalisering; og sluttpunkt kvantifisering av effektiviteten av aktivisering.

Denne teknikken ble først utviklet for å undersøke aktivering av caspase-214. Mens aktivering plattformen for caspase-2 antas å være PIDDosome, bestående av reseptoren PIDD (p53-indusert protein med et død domene) og adapter RAIDD (RIP-assosiert ICH-1/CAD-3 homologe protein med en død-domene), PIDDosome-uavhengig caspase-2 aktivisering er rapportert. Dette tyder på at ekstra aktivering plattformer for caspase-2 finnes 15,16. Til tross for ikke å vite full komponentene i caspase-2 aktivisering plattformen, har caspase BiFC teknikken tillatt for vellykket avhør av caspase-2-signalveier på molekylært nivå 14,-17. Vi har også lykkes tilpasset denne protokollen for den inflammatoriske caspases (caspase-1-4, 5 og -12) 18 og i prinsippet den samme tilnærmingen bør være tilstrekkelig tilsvarende analysere hver av de gjenværende initiatoren caspases. Denne protokollen kan tilsvarende tilpasses å undersøke andre veier ble dimerization er store aktivering signal. For eksempel er STAT proteiner aktivert ved dimerization etter fosforylering av Janus kinase (JAK) 19. Dermed kan BiFC systemet brukes til å visualisere for STAT aktivisering, samt mange andre baner regulert av dynamisk protein interaksjoner. Følgende protokollen gir trinnvise instruksjoner for innføring av journalister i celler og metoder for bildeopptak og analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av celler og kultur retter

Merk: Utfør trinn 1-3 i vev kultur laminær strømning hette. Bruk hansker.

  1. Hvis bruker glass bunn retter, pels glasset med fibronectin. Gå til trinn 1.2 Hvis bruker plast retter.
    1. Lage en 0,1 mg/mL løsning av fibronectin: fortynne 1 mL 1 mg/mL fibronectin løsning i 9 mL 1 X PBS.
    2. Dekke glass nederst hver brønn med 0,5-1 mL av fibronectin og Inkuber for 1-5 minutter ved romtemperatur.
    3. Bruker en pipette, samle fibronectin løsningen og lagre på 4 ° C.
      Merk: Fibronectin løsningen kan brukes flere ganger.
    4. Vask glasset gang med 1-2 mL 1 X PBS, og Sug opp på PBS.
  2. Plate 1 x 105 celler per brønn av en 6-vel plate i 2 mL av den aktuelle cellen kultur medier (se tabell 1 for cellen tallene å bruke forskjellige størrelser brønner). Hvis bruker en celle linje som uttrykker stabilt caspase BiFC komponentene (se diskusjon), plate 2 x 105 celler og videre til behandling trinn (trinn 3).
  3. Lar celler å overholde parabolen overnatting på 37 ° C i en vev kultur inkubator.

2. hva celler å innføre caspase BiFC komponentene

  1. Transfect celler med passende transfection reagensen.
    Merk: Denne protokollen skisserer instruksjonene for Lipofectamine 2000, som er optimalisert for minimal toksisitet. Denne protokollen har blitt brukt i jakten celler, MCF7 celler og LN18 celler. Hvis bruker ekstra transfection reagenser følger produsentens instruksjoner og optimalisere etter behov.
    1. Legge til 12 µL av transfection reagensen 750 µL redusert serum medier i et sterilt rør.
    2. Inkuber ved romtemperatur for 5 min.
    3. Legge 10 ng av en reporter plasmider (en plasmider koding en fluorescerende protein, f.eks rød fluorescerende protein [RFP], som vil etiketten transfekterte cellene) til en bakteriefri 1.5 mL tube for hver godt å være transfekterte.
    4. Legge til 20 ng av hver caspase BiFC plasmider (f.eks20 ng caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC og 20 ng av C2 Pro-VN) til hver tube (tabell 2).
    5. Få hver rør opp til et totalt volum på 100 µL ved å legge til redusert serum media.
    6. Bruker en p200 pipette, legge 100 µL transfection reagens løsning fra trinn 2.1.2 til plasmider blanding på en dropwise måte.
    7. Inkuber plasmider-transfection reagens blandingen for 20 min ved romtemperatur.
    8. Sug opp media fra celler ved hjelp av en pipette eller med sugekopp, og deretter bruker en p1000 pipette, Pipetter 800 µL av serum gratis media forsiktig ned på siden av brønnen.
    9. Bruke en p200 pipette, legge til 200 µL av DNA-lipid kompleks dropwise i hver brønn.
    10. Inkuber cellene i en vev kultur inkubator på 37 ° C 3 h.
    11. Ta vare ikke å forstyrre monolayer, fjerne serum gratis media som inneholder DNA-lipid komplekser av aspirasjon bruke sugekraft eller en pipette.
    12. Pipetter 2 mL forvarmes (37 ° C) komplett vekst medier forsiktig ned på siden av hver brønn.
  2. Inkuber cellene på 37 ° C i en vev kultur inkubator 24-48 h for optimal protein uttrykk.

3. induksjon av caspase aktivisering

  1. Behandle med et stoff eller stimulans som induserer caspase aktivisering ca 24 h etter hva.
    1. Legg til ønskede konsentrasjonen av stoffet å pre varmet (37 ° C) tenkelig media (komplett vekst medier supplert med Hepes [20 mM, pH 7.2 7.5] og 2-mercaptoethanol [55 µM]) og bland forsiktig (tabell 3).
    2. Sug opp media fra celler ved hjelp av en pipette eller med sugekopp, og deretter bruker en pipette, Pipetter 2 mL løsningen fra 3.1.1 forsiktig ned på siden av brønnen.
    3. Legge til tenkelig media uten stoffet i en brønn som en ubehandlet kontroll.
  2. Inkuber cellene i en vev kultur inkubator på 37 ° C eller fortsette til trinn 4.3 for en time-lapse eksperiment.

4. Caspase BiFC datainnsamling

  1. Caspase BiFC for enkelt tidspunkt oppkjøp
    1. Slå på mikroskopet og fluorescerende lys kilden etter produsentens instruksjoner.
    2. Finne celler under RFP filteret og fokus på reporter genet fluorescens.
    3. Bruker en hånd-telleapparat teller, telle alle RFP-positive i feltet visual. Registrere.
    4. Samtidig opprettholde den samme synsfelt, bytte til GFP filter (eller YFP filteret hvis tilgjengelig) og bruker en hånd-telleapparat teller, antall røde celler som er også grønn (Venus-positive). Bytte frem og tilbake mellom de to filtrene slik at bare de red cellene evalueres for Venus-positivitet. Registrere nummeret (Figur 3).
    5. Telle minst 100 RFP-positive celler fra hver av tre individuelle områder av platen.
    6. I hvert område, beregning av Venus-positive transfekterte celler (i.e. røde celler som er grønne). Gjennomsnittlig resulterende prosenter for å få standardavvik.
  2. Tredimensjonale imaging av caspase BiFC
    1. Slå på mikroskopet følger produsentens instruksjoner og starte programmet oppkjøpet.
    2. Velg 60 x eller 63 x oljeobjektiv og Plasser en dråpe olje på målet
    3. Plass kultur rett på mikroskopet scenen med riktig plate abonnenten.
    4. Bruke enten en epifluorescence lyskilde og mikroskopet øyet stykke eller AC confocal lasere og skjermen, gå til et område.
    5. Fokus på reporter fluorescens bruke RFP laser eller filter.
    6. Hvis epifluorescence har blitt brukt opp til dette punktet, bytte lyskilden til AC confocal lasere og visualisere live bildet av cellene som ervervet av kameraet og vises av oppkjøpet programvaren på dataskjermen.
    7. Bruke kontrollen joysticken og fokus hjulet, finjustere fokus og plasseringen av cellene slik at cellene er i midten av søkeren. Velg cellene som er atskilt fra hverandre og ikke overlapper.
    8. Angi prosenten laser makt til 50% og eksponeringstid på 100 ms for både Venus og RFP som utgangspunkt til å bestemme optimale innstillingene som skal brukes for eksperimentet.
    9. Aktivere live fangst og se den resulterende bildet og tilhørende skjermen histogrammer for begge kanaler.
    10. Hvis signalet er lav, og bildet er vanskelig å se, øke prosentandelen laser makt og/eller i trinn til signalet i bildet ser bra.
    11. Kontroller at signalet ikke når metning. Inspisere vises histogrammet sørge for en distinkt peak er synlig for hver fluor. Hvis toppen omfatter hele histogramvisningen, angi lavere laser makt og eksponering innstillinger (figur 2).
    12. Visualisere kontrollen (ubehandlet eller ikke-transfekterte) celler under samme vilkår slik at signalet er bestemt.
      Merk: Én farge transfectants kan også brukes til å kontrollere for krysset, men hvis signalene romlig distinkte (f.eks mitokondrie versus cytosolic) Dette er ikke nødvendig.
    13. Velg eller åpne modulen Z stabel i mikroskopet programvaren.
    14. Hjelp av grovskruen, omtrentlig fokal posisjonen svarer til midten av cellen.
    15. Juster fokus i én retning til cellen er ikke lenger synlig, Velg denne som topplassering.
    16. Juster fokus i motsatt retning til cellen er igjen ikke lenger synlig og velger dette som nederst posisjon.
    17. Velg optimal trinn størrelsen (vanligvis ca 20 µm) og start oppkjøpet å instruere kameraet til å ta ett bilde i hver enkelt kanal på hvert 20 µm-trinn mellom posisjonene og topp og bunn.
    18. Bruk 3D-rendring programvare for å rekonstruere det 3D image (Figur 4film 1).
  3. Tidsinnstilt bildebehandling av caspase BiFC
    1. Minst 1 time før eksperimentet, slå på mikroskopet og sett temperaturen 37 ° C.
    2. Velg 40 x, 60 x eller 63 x oljeobjektiv og Plasser en dråpe olje på målet.
    3. Plass kultur rett på mikroskopet scenen med riktig plate abonnenten.
    4. Hvis en CO2 kilde er tilgjengelig, kan du plassere CO2 levering enheten (vanligvis plexiglass lokk festet til røret som leverer CO2) på toppen plate abonnenten. Angi CO2 til 5%, og slå på CO2 kontrolleren fra i programvaren. Hvis en CO2 kilde ikke er tilgjengelig, med 20 mM Hepes å bufre media.
    5. Naviger til et felt av transfekterte celler og visualisere live bildet av cellene som ervervet av kameraet og vises av oppkjøpet programvaren på dataskjermen bruke RFP laser.
    6. Følgende trinn 4.2.8-4.2.12, angi innstillingene for prosent laser makt og eksponering for RFP laser. Holde disse verdiene så lavt som mulig mens du fremdeles kunne gjenkjenne fluorescerende.
    7. Bruke en positiv kontroll prøve (se tabell 3 eksempler), følg trinnene 4.2.8-4.2.12 å legge inn innstillingene for prosent laser makt og eksponering for YFP laserlys. Holde disse verdiene så lavt som mulig mens du fremdeles kunne gjenkjenne Venus.
    8. For hver brønn av platen, velger du en rekke ulike stillinger som inneholder én eller flere celler uttrykke reporteren.
    9. Angi tidsintervallet mellom hver ramme av time-lapse og totalt antall rammer tas. Sikre det er på tide å skaffe alle valgte plasseringene før neste delbilde skal tas.
    10. Re-besøk hver posisjon og korrigere og oppdatere fokus etter behov.
    11. Til rette for fokal drift som kan skyldes endringer i temperatur og ytre vibrasjoner, slå på fokus drift korrigering (hvis tilgjengelig).
    12. Begynner den time-lapse og lagre dataene.
    13. Analysere dataene med tilgjengelige bilderedigeringsprogrammer (figur 5Movie 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på caspase-2 BiFC av DNA skade vises i Figur 3. Camptothecin, en topoisomerase jeg inhibitor, ble brukt til å indusere DNA skade og caspase-2 aktivisering. Den røde fluorescerende protein mCherry ble brukt som reporter å vise at celler uttrykke BiFC sonden og for å visualisere antall celler. Venus fluorescens vises i grønt og den store puncta representerer caspase-2 indusert nærhet. Disse cellene kan bli regnet for å finne ut prosentandelen av Venus-positive celler. Konklusjoner om subcellular lokalisering kan også gjøres fra slike bilder. I eksempelet ble caspase-2 indusert nærhet oppdaget i kjerne så vel som de cytoplasm 17. For å gi høy oppløsning visualisering av den subcellular lokaliseringen av caspase aktivisering komplekse, kan enkeltceller avbildes i tre dimensjoner. Figur 4 viser to måter å representere slik 3D-bilder. Først er å generere en 3D rekonstruksjon av cellen. Eksemplet viser camptothecin-indusert caspase-2 BiFC i grønt og kjernen i rødt. 3D rekonstruksjon viser den relative lokaliseringen av begge fluorophores hele celler. Denne typen vise søkeresultatene er spesielt effektivt når presentert som en film, roterende cellen rundt ett (film 1). Det andre panelet er ortogonale samme celle. Dette gir xy-, xz- og yz visualisering av cellen ved et bestemt punkt i cellen. Skildring av resultater på denne måten kan være mer egnet til papir presentasjonen som i et tidsskrift som det er lettere å tolke 3D data presenteres i 2D-format. Figur 5 viser et eksempel på tidsinnstilt bildebehandling av caspase-2 BiFC i en glioblastom celle linje behandlet med proteasome hemmer bortezomib (se også Movie 2). Diagrammet viser økningen i gjennomsnittlig Venus intensiteten per celle gjennomsnitt over en rekke celler (tilpasset fra 20). Denne typen data kan også vises som en rekke enkeltcelle spor på en graf. I eksempelet er utbruddet av caspase indusert nærhet ca 2 timer etter behandling.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av caspase struktur og resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC) metodikk. (A) generelle strukturen av en initiativtaker caspase. De prodomain, store og små underenheter og bevart QACRG motivet som inneholder den aktive området cystein er avbildet. (B) BiFC bruker delt fluorescerende proteiner som alene ikke fluorescerende men kan knytte reformere fluorescerende molekylet da smeltet samspill proteiner. For caspase BiFC, prodomain (Pro) eller fulle caspase er smeltet til N-terminalen halvparten (Venus-N) og C-terminalen halvparten (Venus-C) Venus. I monomerisk tilstand er caspase fusion proteiner ikke fluorescerende. Ved rekruttering til en aktivisering plattform, PIDDosome, som vist her, gjennomføres foreningen av de to halvdelene av Venus som representerer caspase indusert nærhet som måles som en økning i Venus fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representativt bilde for å anerkjenne metning ved hjelp av display histogrammet. Eksempler på optimal (øvre panel) og mettet signaler (nedre panel) vises. Venus (gul peak) og RFP (rød peak) signaler vises. X-aksen viser intensitet og y-aksen er antallet piksler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Caspase-2 resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC) etter DNA skade. Hela celler uttrykke caspase-2 BiFC komponentene ble etterlatt ubehandlet (A) eller behandlet med camptothecin (100 µM) (B) i nærvær av qVD-OPH (20 µM). mCherry var co uttrykt som fluorescerende reporter. Representant bilder viser celler (rød) med caspase-2 BiFC (grønn) i camptothecin-behandlet celler 16 h etter behandling. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: lokalisering av caspase-2 resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC). Hela celler uttrykke caspase-2 BiFC komponentene og fluorescerende kjernefysiske reporter ble behandlet med camptothecin (20 µM) i nærvær av qVD-OPH (20 µM). 3D rekonstruksjoner sammensatt fra 0,1 μm serielle AC confocal bilder til z-fly av cellen ble gjort etter 24 h og vise kjernen i rødt og caspase-2 BiFC i grønt. Informasjonsvinduet viser en 3D maksimale intensitet projeksjon gjengivelse rekonstruksjon (se også film 1). Panelet til høyre viser visningen ortogonale stykker av samme celle. Den midterste boksen (blå) er det xy flyet boksen rett (gul) er yz flyet og top-boks (hvit) er xz flyet. Yz og xz flyene krysser ifølge trådkorset. Skala stolper representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: tidsforløp for caspase resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC) (A) LN18 glioblastom celler transfekterte med caspase-2 BiFC komponenter og en rød fluorescerende mitokondrie markør (DsRed mito, rød) ble behandlet med bortezomib (15 nM) i nærvær av qVD-OPH (20 µM). Cellene ble plassert på AC confocal mikroskop på 37 ° C og bilder ble tatt hver 2 min for 8 h. bilder av representant celler fra time-lapse showet som indusert nærhet til de to caspase-2 BiFC komponentene resulterte i en økning i Venus fluorescens ( grønt) over tid. (B) gjennomsnittlig intensiteten av Venus i hver celle på hvert tidspunkt ble målt. Venus fluorescens økt etter bortezomib behandling. Divisjon i kontrollen ubehandlet angitt lav eller ubetydelig toksisitet forhold fra laserlys (figur tilpasset fra 20). Skala barer representerer 20 µm. feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM) på 8 (kontroll) og 14 (bortezomib) individuelle celler (se også Movie 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Størrelsen på platen Antall celler Volumet av media
6 plate vel 1 x 105 celler / vel 2 mL
12 godt plate 5 x 10-4 celler / vel 1 mL
24 godt plate 2.5 x 104 celler / godt 0,5 mL
4 kammer fatet 2.5 x 104 celler / kammer 1 mL
8 kammer fatet 1.25 x 104 celler / kammer 0,5 mL

Tabell 1: retningslinjer for antall celler til plate. Hvis bruker celler uttrykke stabilt caspase resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC) komponentene, doble plate beløpene som vises her.

Størrelsen på platen Hva reagens Redusert serum media Reporter plasmider Caspase-pro VC plasmider Caspase-pro VN plasmider Redusert serum media lagt til plasmider blanding Hva reagens løsning lagt til plasmider blanding Serum gratis media lagt til celler
6 plate vel 12 µL/plate 750 ΜL 10 ng 20 ng 20 ng til totalt 100 µL 100 ΜL 800 ΜL
12 godt plate 12 µL/plate 750 ΜL 5 ng 10 ng 10 ng til totalt 50 µL 50 ΜL 400 ΜL
24 godt plate 12 µL/plate 750 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng til totalt 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
4 kammer fatet 4 µL/plate 250 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng til totalt 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
8 kammer fatet 4 µL/plate 250 ΜL 1.25 ng 2.5 ng 2.5 ng til å summere 12.5 µL 12.5 ΜL 100 ΜL

Tabell 2: anbefalt av forbigående hva de anvendte reagensene. Merk: mengden plasmider foreslått er bare et utgangspunkt. Hvis du ikke finner noe signal, anbefales det å sjarmere plasmider fra 20-200 ng per brønn av en 6-vel plate.

Caspase Behandling Konsentrasjon Tid Forventede resultater
Caspase-1 Over uttrykt ASC 250 ng/vel en 6 plate vel 48 timer 50% BiFC positive
Caspase-2 Over uttrykt RAIDD 500 ng/vel en 6 plate vel 24 h 90% BiFC positive
Camptothecin 100 ΜM 16 h 30-60% BiFC positive
Heten støt 1t 45 ° c 16 h 80% BiFC positive
Caspase-4 Overexpressed NALP1 250 ng/vel en 6 plate vel 48 timer 30% BiFC positive
Caspase-5 Overexpressed IPAF 250 ng/vel en 6 plate vel 48 timer 15% BiFC positive

Tabell 3: eksempler på positive kontroller for caspase resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC). Betingelsene og forventede resultater er basert på publiserte data bruker Pro konstruerer 14,17,18. Co uttrykt plasmider bør være transfected sammen med BiFC plasmider (trinn 2.1.4)

Movie 1
Film 1: 3D lokalisering av caspase-2 resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC). 3D rekonstruksjon, roteres rundt y-aksen av AC confocal bilder gjennom z-fly en Hela celler uttrykke caspase-2-BiFC komponentene og fluorescerende kjernefysiske reporter ble behandlet med camptothecin (20 µM) for 16 h. Filmen viser caspase-2 BiFC (grønn) og kjernen (rød). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Movie 2: tidsforløp for caspase-2 resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC). LN18 glioblastom celler transfekterte med caspase-2 BiFC komponentene og behandlet med bortezomib (15 nm) ble fotografert hver 2 min 8 h. Filmen viser caspase-2 BiFC (grønn) og mitokondrier (rød). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen omhandler bruk av delt fluorescerende proteiner måle caspase indusert nærhet. Split Venus ble valgt for denne teknikken fordi det er svært lyse, svært photostable og den refolding er rask 13. Dermed kan analyse av Venus refolding på caspase indusert nærhet gi nær sanntid beregninger av caspase protein samhandling dynamics. Venus er delt inn i to litt overlappende fragmenter, N endestasjonen til Venus (Venus-N eller VN) bestående av aminosyrer 1-173 og C terminalen fragmentere (Venus-C eller VC) bestående av rester 155-239. Andre delt fluorescerende proteiner finnes, men noen som delt mCherry, krever inkubasjon på 4 ° C for opptil 2 timer for refolding 21. Ytterligere delte fluorescerende proteiner inkludert delt Cerulean (en versjon av cyan fluorescerende protein) og langt røde delt mLumin har ennå å bli testet i denne sammenheng 13,22. Til slutt, hvis disse fluorescerende proteiner bevise egnet for måling caspase indusert nærhet, kan dette tillate for samtidige vurdering av flere caspases.

Vanligvis er prodomain (Pro) regionen i caspase smeltet delt fluorescerende fragmenter. Dette området inneholder den minimale delen av caspase som trengs for å binde til aktivisering plattformen og omfatter kort eller DED samhandling motivet. Fordelen av benytter det prodomain er at det ikke innføre noen enzymatiske aktiviteten til cellene. Dette tillater samtidig overvåking av nedstrøms hendelser på grunn den endogene caspase. Forskningen til dags dato har vist liten forskjell i kinetics og lokalisering av caspase BiFC mellom den prodomain og full lengde caspase 14. Men full lengde sammensetningene tendens til å uttrykke med lavere effektivitet, nødvendiggjør transfection av økte mengder plasmider DNA. I tillegg er det anbefalt å mutere katalytisk cystein til en serine å hindre caspase-indusert apoptose på uttrykk. Til tross for disse ulempene, kan visse undersøkelser kreve samtidige analyse av full lengde BiFC par å fastslå om det er sammenheng-avhengige forskjeller i caspase indusert nærheten tilstedeværelse eller fravær av katalytisk domener.

Denne protokollen er spesielt tilpasset for HeLa celler. Samme protokoll fungerer bra for ekstra tilhenger cellelinjer inkludert mammary karsinom celle linjen, MCF-7, glioblastom celle linje, LN18 og mus embryonale fibroblaster (MEF). Det anbefales at du optimaliserer både plating og hva når tilpasse denne protokollen for en ny celle type. Protokollen beskriver to viktigste mikroskopi tilnærminger som kan brukes til å evaluere cellene: epifluorescence og AC confocal mikroskopi. Når du bruker AC confocal mikroskopi, må cellene være belagt på glass coverslips fordi flertallet av høy numeriske blenderåpning mål som brukes i forbindelse med AC confocal mikroskopi ikke vil trenge tykkelsen av plast retter eller glass lysbilder. Derfor er det anbefalt å bruke retter med innebygd nr 1.5 glass coverslips som har optimal dekkglassvæske tykkelsen på 0,17 mm. En rekke forskjellige typer rettene er tilgjengelig som spenner fra individuelle 3 cm retter, til kammeret lysbilder, til standard størrelse flere godt plater. Tabell 1 og 2 skissere hvordan å tilpasse plating og transfection instruksjonene for forskjellige godt størrelser. For epifluorescence imaging som er beskrevet her (4.1), standard plast vev kultur platene er tilstrekkelig som mikroskopet er utstyrt med lange pass mål.

Denne tilnærmingen er effektivt en "lys på" metode for å måle caspase aktivisering, er inkludering av fluorescerende reporter viktig både for å tillate visualisering av cellene før eller i fravær av aktivering av caspase reporter og for å identifisere transfekterte cellene, når forbigående transfection brukes. En rekke ulike journalister kan brukes og den eneste kriteriet når du velger en: 1) i fluorophore er tilstrekkelig lyst slik at det lett kan oppdages av tenkelig protokollen; og 2) spekteret sin fluorescerende ikke overlapper med YFP. For eksempel bør grønn fluorescerende protein (GFP) ikke brukes som reporter fordi det vil bli oppdaget av YFP filteret eller laser brukes til å oppdage Venus. Dette skyldes spectral overlappingen av to fluorophores. Velge en fluorophore som regionaliserer til en bestemt organelle kan gi ytterligere kvalitativ informasjon. For eksempel bruk av et protein som mål mitokondrier, som røde fluorescerende protein DsRed mito, kan gi tilleggsinformasjon om generelle levedyktigheten til cellen. Mitokondrier pleier å gjennomgå fragmentering (fisjon) i den tidlige fasen av celle død 23 og dette kan visualiseres med en reporter som DsRed mito. Bruk av en organelle markør som reporter kan også tillate konklusjoner om subcellular lokalisering av caspase BiFC gjøres.

Det finnes flere måter at caspase BiFC kan være kjøpt og analyseres. Avgjøre hvilken metode å bruke avgjøres av parameterne utforskes (sluttpunktet befolkningen analyse versus enkeltcelle posisjonelle eller kinetisk informasjon) og tilgjengeligheten av instrumentering og bildebehandlingsprogrammer. Denne protokollen skisserer noen mikroskop-baserte tilnærminger til å samle resultatene av en caspase BiFC eksperiment for å skaffe både enkelt tidspunkt og time-lapse data. Men det bør bemerkes at en rekke varianter og kombinasjoner av disse metodene brukes til å forhøre kreativt caspase aktivisering trasé.

Enkelt punkt datainnsamling (4.1) brukes til å finne prosenten av celler med caspase indusert nærhet til en eneste gang. For denne protokollen teller en bare antall transfekterte celler som er Venus-positive. Dermed svært spesialisert utstyr er ikke nødvendig og bare de mest grunnleggende epifluorescence mikroskopet med GFP (eller YFP) og RFP filter og en hånd telleapparat teller er nødvendig. Noen imaging-systemer kan automatiseres å automatisk ta en rekke bilder per brønn av en plate. Hvis slike instrumentation er tilgjengelig, cellene i ervervet bildene tilsvarende kan telles ved by visuell inspeksjon eller quantitated ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Tredimensjonale imaging (4.2) gir høy oppløsning bilder av caspase BiFC gjennom fokus flyene i cellen. AC confocal mikroskop med lasere som opphisse Venus og RFP (eller valgte transfection reporteren) og Z-stack evner er nødvendig. En rekke 3D-rendring programvaremoduler er tilgjengelige som gir forskjellige måter å visualisere data. For begge disse typer analyse er det mulig å fastsette celler og bilde eller vurdere dem senere. Men prosessen med fiksering minsker Venus signalet, som kan legge gjenstander til analyse og derfor denne tilnærmingen er ikke anbefalt. Tidsinnstilt bildebehandling (4.3) kan brukes til å gi samtidig kinetic og posisjonelle analyse av caspase BiFC. Mikroskop utstyrt med en motorisert scene kan defineres til å ta bilder av flere posisjoner og selv sammenligne ulike behandlingsgrupper i samme eksperiment.

For time-lapse, en rekke ekstra hensyn må tas i betraktning. Laserlys kan forårsake gjenstander på grunn av Phototoksisitet eller photobleaching, og begge må kontrolleres for. Generelt, kan begge unngås ved hjelp av lavest mulig beløpet av lyset (input lav prosentandel laser makt og kort eksponering ganger i trinn 4.3.6-4.3.7). Phototoksisitet resultater når laserlys induserer død i cellene og kontrolleres av imaging ubehandlet celler under samme vilkår og bekrefter at celledeling fortsetter som normalt. Photobleaching oppstår når flere bilder tatt på samme celle reduseres til fluorescens. Venus fluorescerende protein er ganske photostable, så dette er sjelden et problem i praksis. Effekten av photobleaching kan bestemmes ved å ta flere sekvensielle bilder i en Venus-positive celle og sikrer at fluorescensen forblir stabil. Dette bare må gjøres en gang, så lenge de samme laser makt og eksponering innstillingene brukes for hvert eksperiment. Virkninger som følge av Phototoksisitet eller photobleaching kan også begrenses ved å redusere antall bilder tatt. Dette kan oppnås ved å forlenge eller forkorte tidsintervallet mellom fanger (trinn 4.3.9). Bruke 5-10 min intervaller over en 16 h time-lapse er et godt sted å begynne. Hvis ingen photoxicity er observert eller kreves for eksperimenter av kortere varighet, reduseres intervallet mellom rammer. Hvis caspase aktivisering er rask, kan kortere eksperimenter med kortere tidsintervaller brukes. For eksempel for en 16 h eksperiment med 10 min intervaller kommer totalt 192 bilder (96 for hver fluorophore). En 2t eksperimentere med 1,5 m intervaller vil gi 160 bilder. Derfor vil den lange og korte eksperimenter hver utløse cellene til lignende totale mengder laserlys. For kort varighet eksperimenter kan caspase aktivere stimulans legges direkte til media umiddelbart før innvielsen av time-lapse fange (etter trinn 4.3.11 i stedet for i trinn 3). Gjør Fjern lokket fra platen og forsiktig innom en løsning som inneholder stimulans bruker en pipette. Ta vare ikke å skubbe platen og raskt sjekke at cellene er fortsatt i fokus før du fortsetter.

Når utføre time-lapse eksperimenter, er det også viktig å sørge for nærmiljøet cellene ligner det av en vev kultur inkubator. En rekke miljøkontroller er tilgjengelige på forskjellige mikroskop sett ups. Disse inkluderer mindre scenen topp inkubatorer samt miljømessige kamre som innkapsler hel mikroskopet. Begge disse enhetene gir vanligvis varme, CO2og fuktighet til kammeret på en måte som kan kontrolleres nøyaktig. Presis kontroll av CO2 og temperaturen er avgjørende for suksess for eksperimentet fordi uventede temperatur svingninger kan føre til fokal drift og fravær av CO2 fører pH i media å stige som kan være giftig for cellene. Hvis en CO2 kilde ikke er tilgjengelig, kan media bufres ved tilsetning av Hepes (se trinn 3.1.1). Selv om en CO2 kilde er tilgjengelig, anbefales det å inkludere Hepes i tenkelig medium som et ekstra tiltak å holde cellene sunn. Men selv i nærvær av Hepes, kan fravær av CO2 i lengre perioder føre celledød. Derfor er det viktig å kontrollere ubehandlet celler, fotografert under samme vilkår, og fargen på media ved avslutningen av å sikre at pH har vært stabil. Merk at fenol red ikke trenger å bli utelatt fra noen av mediene som brukes i denne protokollen siden bidraget fra autofluorescence til Venus signalet er minimal.

Det finnes flere tilgjengelige metoder for å analysere tenkelig dataene fra en tid forfalle eksperiment. Måle mener intensiteten av Venus piksler per transfekterte celle er den enkleste måten å analysere tidspunktet for caspase indusert nærhet. Som vist i Figur 3, Figur 4, figur 5, vises caspase-2-BiFC ofte som én eller flere puncta i forskjellige subcellular rom. Imaging analyse tilnærminger at måle antall foci, størrelse eller flere lignende faktorer kan gi informative kvantitative data om disse strukturene. Ikke alle caspase BiFC vises som puncta. For eksempel har de inflammatoriske caspases vist ulike BiFC mønstre inkludert diffus fluorescens, trådformede strukturer og ett eller flere puncta per celle 18. Disse mønstrene var avhengig av caspase aktivert og oppstrøms aktivering signaler. Derfor vil hvilken som er mest egnet for time-lapse resultatene hovedsakelig være diktert av fluorescerende mønstre som er observert.

Mange av behandling stimuli som vurderes når bruker denne protokollen vil indusere apoptose enten direkte gjennom caspase analysert, eller indirekte ved å engasjere en annen celle død veien. Dette fører til at cellene å krympe og koble fra platen, som gjør det svært vanskelig å image cellene og nesten umulig å fastslå noen bestemt lokalisering av caspase-BiFC. Inkludering av en pan-caspase hemmer vil hindre denne celledød. Rekruttering av caspases deres aktivisering plattformer og den tilknyttede caspase BiFC er ikke avhengig av katalytisk aktiviteten til caspase. Derfor caspase hemming har ingen virkning på dette trinnet, men vil hemme nedstrøms fysiske karakteristikkene av apoptose inkludert blebbing, avdeling og eventuell tap i plasma membranen integritet. Dermed, hvis utføre endepunktet analyse (trinn 4.1) eller Z stabler (trinn 4.2), inkludering av en caspase hemmer er viktig. For time-lapse eksperimenter derimot hvis apoptose-relaterte hendelser som MOMP, annexin V binding (å oppdage phosphatidyl serine eksponering) eller propidium iodide opptak (for å oppdage plasma membran permeabilization) skal analyseres sammen med caspase BiFC, den caspase hemmer skal utelates å hindre hemming av disse hendelsene. En caspase hemmer som qVD-OPh (10-20 µM) skal legges til i media som inneholder apoptose-inducing stimulans (trinn 3.1.1). Hvis co uttrykke et pro-apoptotisk protein caspase BiFC komponenter, bør den caspase inhibitor legges på trinn 2.1.12.

Caspase BiFC er en av de få tilgjengelige metodene som kan brukes til å visualisere hendelser i caspase aktivisering stier i lever celler, må en rekke vurderinger tas i betraktning når utforme disse eksperimentene. Denne tilnærmingen er overuttrykte-basert, er kontrollene for spesifisitet viktig. Dette kan gjøres på to måter. Først bør innføring av enkelt punkt mutasjoner i kortet eller DED av caspase prodomain slik at de forstyrre bindingen mellom caspase og dens aktivisering plattform redusere både intensiteten av caspase BiFC og andelen av Venus-positive celler. For eksempel mutasjon av rester D59 e i prodomain av caspase-1 forstyrrer binding til adapter protein ASC (apoptose-assosiert flekk som protein inneholder et kort) og like forstyrrer ASC-indusert caspase-1 BiFC 18,24 . Andre reduseres bruk av celler som er mangelfull i adapter proteiner som rekrutterer caspase aktivisering plattformen BiFC sender. Dette kan være oppnådd bruker knockout celler, hvis tilgjengelig, eller bruker siRNA eller CRISPR/Cas9-baserte tilnærminger til å tømme cellene i adapteren. Følgelig blokkert uttømming av caspase-2 adapter protein RAIDD fullstendig caspase-2 BiFC av varme støt eller DNA skade 14,17. For disse eksperimentene, knockout eller pusse celler skal sammenlignes med matchet kontroll celler (i.e. søppel-matchet vill-type MEF eller kontroll knockdown celler) og, hvis en ny cellen linje, optimal transfection forhold bør vurderes for å sikre lik uttrykk for BiFC reporteren over linjer.

En andre begrensning av denne tilnærmingen er at når du bruker forbigående transfection, er det vanskelig å sikre at hver celle er å uttrykke like mye hver protein. Hvis uttrykket er ulik, kunne en Venus fragment bli rekruttert til plattformen ved høyere frekvenser. Dette kan maskere full fluorescerende signalet og føre til falske negative resultater. Du løser dette problemet, var en ny versjon av caspase BiFC reporter for stabil linje generasjon nylig rapportert 17. Denne nye versjonen besto av en konstruksjon som uttrykt C2 Pro-BiFC komponentene på en enkelt åpent lesing ramme med viral 2A selv cleaving peptid 25. Derfor BiFC komponentene som en enkelt mRNA fra samme Promotøren men oversatt til å produsere stoichiometrically lik mengde VC og VN fusion proteiner. Cellelinjer generert for å uttrykke stabilt denne konstruksjonen vist lignende trender av aktivisering å transiently uttrykt journalistene men var både mer følsom og viste lavere bakgrunn fluorescens. Dermed kan over protokollen sterkt forenklet hvis brukes i forbindelse med reporteren linjer som uttrykker stabilt caspase BiFC komponenter.

Data hittil tyder minimale forstyrrelser mellom caspase BiFC komponentene og endogene proteiner. For eksempel caspase-2 er kjent for å være aktivert oppstrøms av MOMP men caspase-2 BiFC ikke blokkere progresjon av MOMP 14. Derfor vises ikke disse journalister til å handle på en dominerende negativ måte. Men hvis samtidig vurdere nedstrøms hendelser, bør dette bli undersøkt i hvert sett av eksperimenter. Inkludert en kontroll ikke-transfekterte i eksperimentet er den beste måten å nærme seg dette. Hvis the kinetics av celledød uendret med eller uten uttrykk for caspase sensoren, vil dette indikere at komponentene som caspase-BiFC ikke forstyrrer endogene funksjon. Omvendt, den endogene caspase muligens kan påvirke BiFC-avlesning i effektivitet eller i størrelse eller form av strukturer. Uttrykke reporteren i celler mangelfull for caspase kontrollerer for dette.

Til tross for disse begrensningene er caspase BiFC teknikken en nyttig metode for å avhøre caspase aktivisering veier som kan utfylle og selv forbedre eksisterende metoder å måle initiatoren caspase aktivisering. Ved måling indusert nærhet, det første trinnet i aktivisering, overvinner denne teknikken problemer forbundet med å måle senere trinn som caspase automatisk prosessering forbundet med aktivisering. For eksempel når du bruker western blot overvåke i spalting av bøddelen caspases, gir caspase-3 og caspase-7, et nøyaktig mål på aktivisering 2, bruker den samme tilnærmingen for initiatoren caspases kan være feil. Dette er fordi spalting av initiatoren caspases, ikke er tilstrekkelig for aktivisering 4,26,27. Faktisk er mange initiatoren caspases kløyvde under apoptose av caspase-3 uten å produsere aktive enzymer 28. Tilsvarende må teknikker basert på bruk av peptid underlag utformet som mål for spesifikk caspases ta hensyn til overlappende særegenheter av disse sekvensene caspases 29. Dette betyr ikke at slike tilnærminger kan ikke brukes til å måle caspase aktivisering, men ulempene bør anerkjennes når tolke resultatene. Caspase BiFC gir en alternativ tilnærming som kan hjelpe bekrefte resultater med mer konvensjonelle metoder. I tillegg er muligheten til å spore montering av caspase aktivisering komplekser i sanntid og tydelig angir størrelse, form og lokalisering av komplekser en betydelig fordel av denne teknikken som ikke er mulig å vurdere på andre måter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne alle tidligere medlemmer av Bouchier-Hayes laboratoriet som bidro til utviklingen av denne teknikken. Dette arbeidet ble finansiert delvis av en Texas Children's Hospital Pediatric Pilot prisen til LBH. Vi takker Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) for tillatelse til å inkludere data publisert i samarbeid med gruppen. Utviklingen av reagensene beskrevet ble støttet av cytometri og celle sortering kjernen ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 og NCRR S10RR024574) og hjelp av Joel M. Sederstrom

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes Mattek P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore FC010-10MG
DPBS Sigma D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668019
OPTI MEM I Invitrogen 31985088
C2-Pro VC plasmid Addgene 49261
C2-Pro VN plasmid Addgene 49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components available by request from LBH
DsRed mito plasmid Clontech 632421 similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES Invitrogen 15630106
2 Mercaptoethanol 1000X Invitrogen 21985023
q-VD-OPH Apex Bio A1901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
  2. Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
  3. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
  4. Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
  5. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  6. Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
  7. Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
  8. Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
  9. Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
  10. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  11. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  12. Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
  13. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  14. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  15. Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
  16. Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
  17. Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
  18. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
  19. Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
  20. Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
  21. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  22. Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
  23. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
  24. Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
  25. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  26. Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
  27. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  28. Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
  29. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).

Tags

Biokjemi problemet 133 Caspase apoptose resultatet av dette fluorescens Complementation mikroskopi Venus Time-lapse
Belysning opp veier å Caspase aktivisering med resultatet av dette fluorescens Complementation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes,… More

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation. J. Vis. Exp. (133), e57316, doi:10.3791/57316 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter