Summary
Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.
Abstract
La famiglia di caspase di proteasi svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi e l'immunità innata. Tra questi, un sottogruppo conosciuto come initiator caspases sono il primo a essere attivato in queste vie. Questo gruppo include il caspase-2, -8 e -9, come pure i caspases infiammatori, caspasi-1, -4 e -5. I caspases iniziatore sono tutti attivati di dimerizzazione successivo all'assunzione di specifici complessi multiproteici chiamati piattaforme di attivazione. Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un approccio basato su formazione immagine dove dividere le proteine fluorescenti fuse initiator caspases sono utilizzati per visualizzare il reclutamento delle caspasi iniziatore a loro piattaforme di attivazione e la conseguente prossimità di indotto. Questa fluorescenza consente una lettura di uno dei primi passaggi richiesti per l'attivazione di caspase iniziatore. Utilizzando un numero di differenti approcci basati su microscopia, questa tecnica è in grado di fornire dati quantitativi sull'efficienza dell'attivazione di caspase a livello di popolazione, nonché la cinetica di attivazione delle caspasi e la dimensione e il numero di attivazione di caspase complessi su base per cella.
Introduction
La famiglia di proteasi caspasi è noti per i loro ruoli critici nell'apoptosi e immunita ' 1. A causa della loro importanza, determinare quando, dove e quanto efficientemente caspases specifici vengono attivati può fornire le comprensioni cruciale nei meccanismi della caspasi vie di attivazione. Il protocollo base imaging qui descritto consente la visualizzazione dei primi passi nella cascata di attivazione di caspasi. Questa tecnica sfrutta le interazioni dinamiche della proteina: l'attivazione di caspase che in auto.
I caspases possono essere divisi in due gruppi: i caspases iniziatore (caspasi-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e i caspases boia (caspase-3, -6 e -7). I caspases boia sono presenti nella cellula come dimeri preformati e vengono attivati tramite fenditura tra le grandi e piccole subunità 2. Quando attivato, essi fendere numerose proteine strutturali e regolatorie conseguente apoptosi 3. I caspases iniziatore sono i caspases primi di essere attivato in un percorso e attivano l'attivazione delle caspasi boia. A differenza di caspases boia, initiator caspases sono attivati da dimerizzazione 4,5. La dimerizzazione è facilitata dal reclutamento di monomeri inattivi per specifiche grande peso molecolare complessi noti come piattaforme di attivazione. Montaggio di piattaforme di attivazione è regolato da una serie di interazioni specifiche: proteina. Questi sono mediati dai motivi di interazione della proteina conservata presente nel proform di caspase l'iniziatore e includere il dominio di morte (DD), dominio effector di morte (DED) e caspase recruitment domain (CARD) 6 (Figura 1A). Piattaforme di attivazione in genere comprendono una proteina recettore e una proteina dell'adattatore. Il recettore è solitamente attivato al momento di legame di un ligando, che induce un cambiamento conformazionale che permette per l'oligomerizzazione di numerose molecole. Il recettore quindi neanche reclute il caspase direttamente o molecole di adattatore che a sua volta portano il caspase al complesso. Così, numerose molecole di caspase mai avvicinare permettendo la dimerizzazione. Questo è noto come la prossimità indotta modello 7. Una volta dimerized, le caspasi subisce autoprocessing, che serve a stabilizzare l'enzima attivo 4,8. Ad esempio, Assemblea dell'apoptosoma Apaf1 viene attivato dal citocromo c dopo il suo rilascio dai mitocondri in un processo chiamato permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP). Apaf1 reclute a sua volta caspase-9 attraverso un'interazione che è mediata da una carta presente in sia proteine 9. Risultato di interazioni proteina simile all'Assemblea della CD95 morte inducendo complessi di segnalazione (disco) che conduce all'attivazione di caspasi-8; il PIDDosome, che può attivare le caspasi-2; e vari complessi inflammasome che avviano l'attivazione di caspasi-1 10,11,12. Così, initiator caspases sono reclutati per piattaforme di attivazione specifico da un meccanismo comune conseguente indotto vicinanza e dimerizzazione, senza la quale non si verificherà l'attivazione.
Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un test basato su formazione immagine che è stato sviluppato per misurare questo primo passo nell'attivazione delle caspasi iniziatore, che permette la visualizzazione diretta di caspasi indotta prossimità seguendo piattaforma di attivazione Assemblea. Questo metodo sfrutta le proprietà della proteina fluorescente Spalato Venus. Venus è un più luminoso e più fotostabile versione di proteina fluorescente gialla (YFP) che possa essere divisi in due frammenti non fluorescenti e leggermente sovrapposti: N-terminale di Venus (Venus N o VN) e C-terminale di Venus (Venus C o VC). Questi frammenti mantengono la capacità di ripiegare e diventa fluorescente quando nella prossimità vicina 13. Ogni frammento di Venus è fuso il propeptide della caspasi, che è la parte minima della caspasi che si lega alla piattaforma di attivazione. Questo assicura che i caspases non mantengono l'attività enzimatica e pertanto sono possibile analisi simultanea degli eventi a valle associati agli eventi endogeni. Il Venus frammenti ripiegare quando il prodomains di caspasi sono reclutati per la piattaforma di attivazione e sottoposti a prossimità indotta. (Figura 1B). La fluorescenza di Venus risultante utilizzabile con precisione e in particolare monitorare la localizzazione subcellulare, la cinetica e l'efficienza dell'Assemblea delle piattaforme di attivazione di caspase iniziatore in singole cellule. Dati di imaging possono essere acquistati mediante microscopia confocale o mediante microscopia a fluorescenza standard e può essere adattato a una serie di approcci di microscopia diversi tra cui: Time-lapse di imaging per monitorare l'attivazione di caspase in tempo reale; formazione immagine ad alta risoluzione per la determinazione precise della localizzazione subcellulare; e la quantificazione di punto finale dell'efficienza dell'attivazione.
Questa tecnica in primo luogo è stata sviluppata per studiare l'attivazione di caspase-214. Mentre la piattaforma di attivazione di caspase-2 è pensata per essere il PIDDosome, che consiste del recettore PIDD (proteina p53-indotta con un dominio di morte) e l'adattatore RAIDD (proteina omologa di RIP-collegata ICH-1/CAD-3 con un dominio di morte), L'attivazione di caspase-2 PIDDosome-indipendente è stata segnalata. Ciò suggerisce che l'attivazione di ulteriori piattaforme per caspase-2 esista 15,16. Pur non sapendo i componenti completo della piattaforma attivazione di caspase-2, la caspasi BiFC tecnica ha permesso per l'interrogatorio di successo delle vie di segnalazione di caspase-2 al livello molecolare 14,17. Abbiamo adattato con successo anche questo protocollo per i caspases infiammatori (caspasi-1, -4, -5 e -12) 18 e, in linea di principio, lo stesso approccio dovrebbe essere sufficiente allo stesso modo analizzare ciascuno dei rimanenti initiator caspases. Questo protocollo allo stesso modo potrebbe essere adattato per studiare altre vie erano dimerizzazione è un importante segnale d'attivazione. Ad esempio, le proteine STAT sono attivati da dimerizzazione dopo fosforilazione da Janus chinasi (JAK) 19. Così, il sistema di BiFC potrebbe essere utilizzato per visualizzare per attivazione STAT così come molte altre vie regolamentati da interazioni proteina dinamico. Il seguente protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'introduzione dei reporter nelle cellule nonché metodologie di analisi e acquisizione delle immagini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione delle cellule e piastre di coltura
Nota: Eseguire i passaggi 1-3 in cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Indossare i guanti.
- Se utilizza piatti di fondo di vetro, ricoprire il vetro con fibronectina. Andare al passaggio 1.2 se utilizza piatti di plastica.
- Fare una soluzione di 0,1 mg/mL di fibronectina: diluire 1 mL di soluzione di fibronectina 1 mg/mL in 9 mL di 1X PBS.
- Coprire il fondo di vetro di ciascun pozzetto con 0,5-1 mL di fibronectina e incubare per 1-5 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando una pipetta, raccogliere la soluzione di fibronectina e conservare a 4 ° C.
Nota: La soluzione di fibronectina può essere riutilizzata più volte. - Lavare il vetro una volta con 1-2 mL 1 X PBS e aspirare di PBS.
- Piastra di 1 x 105 cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di terreno di coltura cella appropriata (Vedi tabella 1 per i numeri di cellulare da utilizzare per diverse dimensioni pozzi). Se utilizzando una linea cellulare che esprime stabilmente i caspase BiFC componenti (vedi discussione), 2 x 105 cellule del piatto e procedere con il passaggio di trattamento (passaggio 3).
- Consentire alle cellule di aderire al piatto durante la notte a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto.
2. transfezione delle celle per introdurre i componenti BiFC caspase
- Transfect cellule con il reagente di transfezione appropriato.
Nota: Questo protocollo delinea le istruzioni per Lipofectamine 2000, che è stato ottimizzato per tossicità minima. Questo protocollo è stato utilizzato con successo in cellule Hela, cellule MCF7 e cellule LN18. Se si utilizza ulteriori reagenti di transfezione seguono le istruzioni del produttore e ottimizzare come necessario.- Aggiungere 12 µ l del reagente di transfezione di 750 µ l di media riduttori del siero in una provetta sterile.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 10 ng di un plasmide del reporter (un plasmide che codifica una proteina fluorescente, per esempio rosso proteina fluorescente [RFP], che verrà assegnata l'etichetta cellule transfected) in una provetta sterile 1,5 mL per ciascun pozzetto per essere transfected.
- Aggiungere 20 ng di ogni plasmide BiFC caspasi (ad es., 20 ng di caspase-2 propeptide [C2 Pro]-VC e 20 ng di C2 Pro-VN) ad ogni provetta (tabella 2).
- Portare ogni tubo fino ad un volume totale di 100 µ l con l'aggiunta di siero riduttore media.
- Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 100 µ l di soluzione di reagente di transfezione dal punto 2.1.2 alla miscela del plasmide in modo goccia a goccia.
- Incubare il mix di reagente di transfezione plasmide per 20 min a temperatura ambiente.
- Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta p1000, pipettare 800 µ l di media liberi del siero delicatamente verso il basso il lato del bene.
- Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 200 µ l del complesso DNA-lipidico goccia a goccia in ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C per 3 h.
- Avendo cura di non perturbare il monostrato, rimuovere il supporto gratuito di siero contenente i complessi DNA-lipidico dall'aspirazione mediante aspirazione o con una pipetta.
- Pipettare 2 mL di pre-riscaldata (37 ° C) completa crescita media delicatamente verso il basso il lato di ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto per 24-48 h per espressione proteica ottimale.
3. induzione di attivazione delle caspasi
- Trattare con un farmaco o stimolo che induce caspase attivazione circa 24 h dopo la transfezione.
- Aggiungere la concentrazione del farmaco per pre-riscaldati (37 ° C) avviabile (media di crescita completa completati con Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-mercaptoetanolo [55 µM]) e mescolare delicatamente (tabella 3).
- Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta, pipettare 2 mL della soluzione da 3.1.1 inclinate leggermente il bordo del pozzo.
- Aggiungere avviabile senza la droga in un pozzetto come controllo non trattato.
- Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C o procedere a passo 4.3 per un esperimento di time-lapse.
4. Acquisizione dati di Caspase BiFC
-
Caspase BiFC per acquisizione di punto singolo tempo
- Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente seguendo le istruzioni del produttore.
- Trovare le celle sotto al filtro RFP e concentrarsi sulla fluorescenza del gene reporter.
- Utilizzando un contatore di mano-tally, contare tutte le celle di RFP-positivi nel campo visivo. Il numero di record.
- Pur mantenendo il campo visivo stesso, passare al filtro GFP (o filtro YFP se disponibile) e, utilizzando un contatore di mano-tally, contare il numero di globuli rossi che sono anche verde (Venus-positivo). Passare avanti e indietro tra i due filtri per garantire che solo gli eritrociti vengono valutati per Venus-positività. Registrare il numero (Figura 3).
- Contare almeno 100 cellule RFP-positive da ciascuna delle tre aree individuali della piastra.
- In ogni area, calcolare la percentuale di cellule Venus-positive trasfettate (cioè globuli rossi che sono anche verdi). Media le percentuali risultanti per ottenere la deviazione standard.
-
Formazione immagine tridimensionale di caspase BiFC
- Accendere il microscopio seguendo le istruzioni del produttore e lanciare il software di acquisizione.
- Selezionare la x 60 o 63 x olio obiettivo e mettere una goccia di olio sull'obiettivo
- Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.
- Utilizzando una sorgente di luce di epifluorescenza e l'oculare del microscopio o i laser confocale e lo schermo del computer, passare a un campo di interesse.
- Concentrarsi sulla fluorescenza reporter utilizzando il laser RFP o filtro.
- Se epifluorescenza è stato utilizzato fino a questo punto, passare alla sorgente di luce laser confocale e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer.
- Utilizzando il joystick e la ghiera di messa a fuoco, mettere a punto la messa a fuoco e la posizione delle cellule così che le cellule sono al centro del mirino. Selezionare le celle che sono separate gli uni dagli altri e non si sovrappongano.
- Ingresso della potenza del laser di percentuale al 50% e il tempo di esposizione a 100 ms per Venus e RFP come punto di partenza per determinare le impostazioni ottimali da utilizzare per l'esperimento.
- Accendere l'acquisizione live e controllare l'immagine risultante e l'accompagnamento visualizzazione istogrammi per entrambi i canali.
- Se il segnale è basso e l'immagine è difficile da fare fuori, aumentare il tempo di alimentazione e/o l'esposizione di laser delle percentuale con incrementi fino a quando il segnale dell'immagine sembra buono.
- Assicurarsi che il segnale non raggiunge la saturazione. Ispezionare la visualizzazione istogramma per assicurarsi che un picco distinto è visibile per ogni fluor. Se il picco comprende la visualizzazione dell'istogramma intero, ingresso inferiore impostazioni di alimentazione e l'esposizione di laser (Figura 2).
- Visualizzare le cellule di controllo (non trattata o non trasfettate) alle stesse condizioni per garantire che il segnale è specifico.
Nota: Singolo colore trasfettanti utilizzabile anche al controllo di crossover, ma se i segnali sono spazialmente distinte (per esempio mitocondriale contro citosolica) questo non è necessario. - Selezionare o aprire il modulo dello stack Z nel software microscopio.
- Utilizzando la manopola di messa a fuoco, approssimativa della posizione focale corrispondente al centro della cella.
- Regolare il fuoco in una direzione fino a quando la cella non è visibile, selezionare questa come la posizione superiore.
- Regolare il fuoco in direzione opposta fino a quando la cella non è ancora visibile e selezionare questa opzione come posizione più bassa.
- Scegliere la dimensione ottimale passaggio (solitamente circa 20 µm) e avviare l'acquisizione per indicare alla fotocamera di scattare automaticamente una singola immagine in ogni canale a ciascuno dei 20 µm passi tra le posizioni superiore e inferiore.
- Utilizzare software di rendering 3D per ricostruire l'immagine 3D (Figura 4Movie 1).
-
Time-lapse imaging di caspase BiFC
- Almeno 1 h prima dell'esperimento, accendere il microscopio e impostare la temperatura a 37 ° C.
- Selezionare la x 40, 60 x o obiettivo di olio x 63 e mettere una goccia di olio sull'obiettivo.
- Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.
- Se una fonte di CO2 è disponibile, è possibile collocare il dispositivo di consegna di CO2 (solitamente un coperchio di plexiglass attaccato al tubo che trasporta la CO2) sopra il portatarga. Impostare la CO2 livello al 5% e accendere il CO2 controller all'interno del software. Se non è disponibile una fonte di CO2 , includono 20 mM Hepes memorizzare nel buffer i media.
- Passare a un campo di cellule trasfettate e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer usando il laser RFP.
- A seguito di passaggi 4.2.8-4.2.12, input le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per il laser RFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale fluorescente.
- Utilizzo di un controllo positivo del campione (Vedi tabella 3 per esempi), seguire passaggi 4.2.8-4.2.12 per immettere le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per la luce di laser YFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale di Venus.
- Per ciascun pozzetto della piastra, scegliere un numero di posizioni diverse che contengono una o più cellule che esprimono il reporter.
- Immettere l'intervallo di tempo tra ogni fotogramma del time-lapse e totale il numero di fotogrammi da adottare. Assicurare che non c'è tempo per acquisire tutte le posizioni selezionate prima il fotogramma successivo è quello di essere preso.
- Ri-visitare ogni posizione, correggere e aggiornare lo stato attivo in base alle necessità.
- Per correggere la deriva focale che può derivare da cambiamenti di temperatura o vibrazioni esterne, attivare il sistema di correzione del drift di messa a fuoco (se disponibile).
- Iniziare il time-lapse e salvare i dati.
- Analizzare i dati utilizzando il software di imaging disponibili (Figura 5film 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nella Figura 3è riportato un esempio di caspase-2 BiFC indotta da danno del DNA. Camptotecine, una topoisomerasi io inibitore, è stato usato per indurre il danno del DNA, attivazione di caspase-2. La mCherry proteina fluorescente rosso è stato utilizzato come reporter per mostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e per aiutare a visualizzare il numero totale di cellule. Fluorescenza di Venus è mostrato in verde e la grande puncta rappresentano caspase-2 indotta prossimità. Queste cellule possono essere contati per determinare la percentuale di cellule positive di Venus. Conclusioni sulla localizzazione subcellulare possono anche essere effettuate in tali immagini. Nell'esempio riportato, caspase-2 indotta prossimità è stato rilevato nel nucleolo pure come il citoplasma 17. Per fornire una visualizzazione ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare dell'attivazione di caspase complesso, singole cellule possono essere imaged in tre dimensioni. La figura 4 Mostra due modi di rappresentare tali immagini 3D. Il primo è quello di generare una ricostruzione in 3D della cella. Nell'esempio viene illustrato BiFC di caspase-2 indotta da camptotecine in verde e nucleo in rosso. La ricostruzione 3D Mostra la localizzazione relativa dei due fluorofori in tutto le cellule. Questo tipo di visualizzazione dei risultati è particolarmente efficace quando si presenta come un film, ruotando la cella attorno ad un asse singolo (1 film). Il secondo pannello è la vista ortogonale della cella stessa. Questo fornisce la visualizzazione xy, xze yz della cella in un particolare punto nella cella. Rappresentazione dei risultati in questo modo può essere più adatto a una presentazione di carta come in un articolo di giornale, come è più facile interpretare i dati 3D presentati in un formato 2D. Figura 5 viene illustrato un esempio di time-lapse imaging della caspase-2 BiFC in una linea cellulare di glioblastoma trattata con bortezomib di inibitore del proteasoma (veda inoltre film 2). Il grafico mostra l'aumento dell'intensità media di Venus per cella media attraverso un numero di cellule (adattato da 20). Questo tipo di dati visualizzabili anche come numero di tracce di singola cella in un grafico. Nell'esempio illustrato, l'insorgenza di caspasi indotta prossimità è circa 2 h dopo il trattamento.
Figura 1: schematica della struttura di caspase e metodologia di complementazione (BiFC) fluorescenza bimolecolare. (A) struttura generale di un iniziatore caspasi. Sono raffigurati le subunità propeptide, grandi e piccole e il motivo QACRG conservato che contiene la cisteina del sito attivo. (B) BiFC utilizza proteine fluorescenti di Spalato che da soli non sono fluorescenti ma possono associare per riformare la molecola fluorescente quando fusa a proteine interagenti. Per caspase BiFC, il propeptide (Pro) o full-length caspase è fusa al N-terminale metà (Venus-N) e al C-terminale metà (Venus-C) di Venere. Nel loro stato monomerico le proteine di fusione di caspase non sono fluorescenti. Dopo il reclutamento di una piattaforma di attivazione, quali il PIDDosome, come illustrato di seguito, associazione delle due metà di Venere viene applicata che rappresenta caspasi indotta prossimità che è misurata come un aumento nella fluorescenza di Venus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagine rappresentativa per il riconoscimento di saturazione mediante l'istogramma Visualizza. Vengono illustrati esempi di segnali saturi (Pannello inferiore) e ottimale (Pannello superiore). I segnali RFP (picco rosso) e Venere (picco giallo) sono indicati. L'asse x indica l'intensità e l'asse y è il numero di pixel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: complementazione di fluorescenza bimolecolare Caspase-2 (BiFC) seguendo il danno del DNA. Cellule HeLa, che esprimono le componenti di BiFC caspase-2 sono state lasciate non trattati (A) o trattate con camptotecine (100 µM) (B) in presenza di qVD-OPH (20 µM). mCherry era co-espressi come reporter fluorescente. Immagini rappresentative mostrano cellule (rosso) con BiFC caspase-2 (verde) in cellule trattate con camptotecine 16 h dopo il trattamento. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: localizzazione di complementazione bimolecolare fluorescenza caspase-2 (BiFC). Cellule HeLa esprimendo i componenti di BiFC caspase-2 e un reporter fluorescente nucleare sono state trattate con camptotecine (20 µM) in presenza di qVD-OPH (20 µM). Ricostruzioni 3D composto da 0,1 μm immagini confocal seriale attraverso il z-aereo della cellula sono state fatte dopo 24 h e mostrare il nucleo in rosso e caspase-2 BiFC in verde. Il pannello di sinistra mostra una ricostruzione di rendering 3D di intensità massima proiezione (cfr. anche il film 1). Il pannello di destra mostra la visualizzazione ortogonale fette della stessa cella. La casella centrale (blu) è il piano xy , la casella a destra (giallo) è il piano yz e bauletto (bianco) è il piano xz . I piani yz e xz si intersecano secondo il puntatore a croce. Barre della scala rappresentano 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Time-lapse di caspase complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC) (A) LN18 glioblastoma cellule trasfettate con i componenti di BiFC caspase-2 e un indicatore rosso fluorescente mitocondriale (DsRed-mito, rosso) sono stati trattati con bortezomib (15 nM) in presenza di qVD-OPH (20 µM). Le cellule sono state collocate su un microscopio confocale a 37 ° C e immagini sono state scattate ogni 2 min per 8 h. immagini di cellule rappresentative dello show time-lapse che la vicinanza indotta dei due componenti BiFC caspase-2 ha provocata un aumento nella fluorescenza Venus ( verde) nel corso del tempo. (B) è stata misurata l'intensità media di Venere in ogni cella in ogni momento. Fluorescenza di Venus è aumentato nel corso del tempo dopo il trattamento di bortezomib. Divisione del controllo non trattato indicato condizioni di tossicità basso o trascurabile dalla luce laser (figura adattata da 20). Scala bar rappresentano 20 µm. barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM) di 8 (controllo) e 14 (bortezomib) singole celle (Vedi anche film 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dimensioni della piastra | Numero di celle | Volume di supporti di |
| 6 piastra ben | 1 x 105 cellule / bene | 2 mL |
| piastra di ben 12 | 5 x 104 cellule / bene | 1 mL |
| piastra di ben 24 | 2,5 x 104 celle / bene | 0,5 mL |
| piatto 4 camera | 2,5 x 104 celle / camera | 1 mL |
| piatto 8 camera | 1,25 x 104 celle / camera | 0,5 mL |
Tabella 1: linee guida per i numeri delle cellule alla piastra. Se usando le cellule che esprimono le componenti di complementazione (BiFC) fluorescenza bimolecolare caspasi, piastra doppia gli importi indicati qui.
| Dimensioni della piastra | Reagente di transfezione | Riduttore del siero media | Reporter del | Plasmide VC caspase-pro | Plasmide VN caspase-pro | Media di siero riduttore aggiunto al mix di plasmide | Soluzione di reagente di transfezione aggiunto al mix di plasmide | Media liberi del siero, aggiunto alle cellule |
| 6 piastra ben | 12 µ l/piastra | 750 Μ l | 10 ng | 20 ng | 20 ng | a totale 100 µ l | 100 Μ l | 800 Μ l |
| piastra di ben 12 | 12 µ l/piastra | 750 Μ l | 5 ng | 10 ng | 10 ng | in totale 50 µ l | 50 Μ l | 400 Μ l |
| piastra di ben 24 | 12 µ l/piastra | 750 Μ l | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | in totale 25 µ l | 25 Μ l | 200 Μ l |
| piatto 4 camera | 4 µ l/piastra | 250 Μ l | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | in totale 25 µ l | 25 Μ l | 200 Μ l |
| piatto 8 camera | 4 µ l/piastra | 250 Μ l | 1,25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | a totale 12,5 µ l | 12,5 Μ l | 100 Μ l |
Tabella 2: consigliato volumi dei reagenti usati per trasfezione transiente. Nota: la quantità di plasmide suggerito è solo un punto di partenza. Se non viene rilevato alcun segnale, è consigliabile per titolare il plasmide da 20-200 ng per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
| Caspasi | Trattamento | Concentrazione | Tempo | Risultati attesi |
| Caspasi-1 | Sovraespressa ASC | 250 ng/pozzetto di una piastra ben 6 | 48 h | 50% BiFC positivo |
| Caspase-2 | Over-RAIDD | 500 ng/pozzetto di una piastra ben 6 | 24 h | 90% BiFC positivo |
| Camptothecin | 100 ΜM | 16 h | 30-60% BiFC positivo | |
| Scossa di calore | 1 h a 45 ° C | 16 h | 80% BiFC positivo | |
| Caspasi-4 | NALP1 iperespresso | 250 ng/pozzetto di una piastra ben 6 | 48 h | 30% BiFC positivo |
| Caspasi-5 | IPAF iperespresso | 250 ng/pozzetto di una piastra ben 6 | 48 h | 15% BiFC positivo |
Tabella 3: esempi di controlli positivi per complementazione bimolecolare fluorescenza di caspase (BiFC). Le condizioni e i risultati attesi sono basati su dati pubblicati utilizzando il Pro costruisce 14,17,18. Co-espressi plasmidi dovrebbero essere transfected a fianco i plasmidi BiFC (passo 2.1.4)
Movie 1: localizzazione 3D di complementazione bimolecolare fluorescenza caspase-2 (BiFC). Ricostruzione 3D, ruotato intorno al y-asse delle immagini confocal attraverso la z-aereo di un Hela delle cellule che esprimono le componenti di caspase-2-BiFC e un reporter fluorescente nucleare sono stati trattati con camptotecine (20 µM) per 16 h. Il filmato mostra BiFC caspase-2 (verde) e il nucleo (rosso). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 2: Time-lapse di complementazione bimolecolare fluorescenza caspase-2 (BiFC). LN18 glioblastoma cellule trasfettate con i componenti di BiFC caspase-2 e trattati con bortezomib (15 nm) erano imaged ogni 2 min per 8 h. Il filmato mostra BiFC caspase-2 (verde) ed i mitocondri (rosso). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di proteine fluorescenti di Spalato per misurare caspasi indotta prossimità. Venus di Spalato è stato scelto per questa tecnica perché è molto luminoso, altamente fotostabili e il ripiegamento è veloce 13. Così, l'analisi di Venere ripiegamento su caspasi indotta prossimità può fornire vicino le valutazioni in tempo reale delle dinamiche di interazione della proteina caspasi. Venus è diviso in due frammenti leggermente sovrapposti, il capolinea di N di Venus (Venus-N o VN) composto da aminoacidi 1-173 e il terminale C del frammento (Venus-C o VC) composto da residui 155-239. Altre proteine fluorescenti di Spalato esistono ma alcuni, come Spalato mCherry, richiedono incubazione a 4 ° C per 2 h per ripiegamento 21. Proteine fluorescenti suddivisi aggiuntivi tra cui dividere Cerulean (una versione di ciano proteina fluorescente) e il mLumin di Spalato lontano rosso devono ancora essere testato in questo contesto 13,22. In definitiva, se queste proteine fluorescenti rivelarsi adatte a misurare caspasi indotta prossimità, questo potrebbe consentire la valutazione simultanea dei caspases multiple.
Generalmente, il propeptide regione (Pro) del caspase viene fuso i frammenti fluorescenti di Spalato. Questa regione contiene la minima parte di caspase necessario per associare alla piattaforma di attivazione e comprende il motivo di interazione CARD o DED. Il vantaggio di utilizzare il propeptide è che non introduce alcuna attività enzimatica per le cellule. Ciò consente il monitoraggio simultaneo degli eventi a valle a causa della caspasi endogeno. La ricerca fin qui ha mostrato poca differenza nella cinetica e localizzazione della caspasi BiFC tra il propeptide e la piena lunghezza caspase 14. Tuttavia, i costrutti full-length tendono ad esprimere con minore efficienza, rendendo necessaria la transfezione di una maggiore quantità di DNA plasmidico. Inoltre, si consiglia di mutare la cisteina catalitica di una serina per prevenire l'apoptosi indotta da caspasi su espressione. Nonostante questi inconvenienti, alcune indagini possono richiedere l'analisi simultanea delle coppie BiFC integrale per determinare se ci sono differenze di contesto-dipendente in prossimità di caspasi indotta in presenza o assenza dei domini catalitici.
Questo protocollo è specificamente adattato per cellule HeLa. Lo stesso protocollo funziona bene per linee di cellule aderenti supplementari incluse la linea cellulare di carcinoma mammario MCF-7, la linea cellulare di glioblastoma, LN18 e fibroblasti embrionali del mouse (MEF). È consigliabile che l'utente ottimizza la placcatura e la transfezione condizioni quando si adatta questo protocollo per un nuovo tipo di cella. Il protocollo descrive due approcci di microscopia principale che possono essere utilizzati per valutare le cellule: epifluorescenza e microscopia confocale. Quando si utilizza la microscopia confocale, cellule devono essere placcate su vetrini coprioggetti perché la maggior parte degli obiettivi di apertura numerica elevata che vengono utilizzati in combinazione con la microscopia confocale non penetra lo spessore dei piatti di plastica o lastre di vetro. Pertanto, è consigliabile usare i piatti con lamelle di vetro incorporato n. 1.5 che hanno lo spessore ottimale coprioggetto di 0,17 mm. È disponibile un numero di diversi tipi di questi piatti che spaziano da piatti individuali 3 cm, a diapositive di alloggiamento, a piastre multi-pozzetto di dimensioni standard. Tabelle 1 e 2 contorni come adattare le istruzioni di placcatura e transfezione per le diverse taglie di bene. Per l'epifluorescenza imaging che è descritto qui (4.1), piastre di coltura del tessuto plastica standard sono sufficienti, purché il microscopio è dotato di obiettivi di passaggio lungo.
Perché questo approccio è effettivamente un metodo di "luci" per misurare l'attivazione delle caspasi, l'inclusione di un reporter fluorescente è essenziale per permettere la visualizzazione delle celle prima o in assenza di attivazione del reporter caspasi sia per identificare le cellule trasfettate, quando viene utilizzata la trasfezione transiente. Può essere utilizzato un numero di diversi giornalisti e l'unico criterio quando si sceglie uno è: 1) il fluoroforo è sufficientemente luminoso in modo che può essere facilmente individuata dal protocollo di formazione immagine; e 2) il suo spettro fluorescente non coincide con quella di YFP. Ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP) non dovrebbe essere utilizzata come un reporter perché verrà rilevato dal filtro YFP o laser usato per rilevare Venus. Ciò è dovuto la sovrapposizione spettrale dei due fluorofori. Scegliendo un fluoroforo che localizza un organello specifico può fornire ulteriori informazioni qualitative. Ad esempio, utilizzare di una proteina che obiettivi i mitocondri, come ad esempio la proteina fluorescente rossa DsRed-mito, possono fornire informazioni aggiuntive sulla redditività complessiva della cella. I mitocondri tendono a subire la frammentazione (fissione) durante le prime fasi di cellule morte 23 e questo può essere visualizzato con un reporter come DsRed-mito. L'uso di un indicatore di organello come un reporter può anche permettere conclusioni sulla localizzazione subcellulare di caspase BiFC da effettuarsi.
Ci sono un certo numero di modi che caspase BiFC dati possono essere acquisiti e analizzati. Decidere quale metodo utilizzare sarà determinato dai parametri da esplorare (analisi di popolazione di endpoint contro informazioni posizionali o cinetica singola cella) e la disponibilità di strumentazione e software di imaging. Questo protocollo descrive alcuni approcci basati su microscopio a raccogliere i risultati di una caspasi BiFC esperimento per l'acquisizione di punti di sola volta sia dati time-lapse. Tuttavia, dovrebbe essere notato che un numero di variazioni e combinazioni di questi approcci da utilizzare creativamente interrogare vie di attivazione di caspasi.
Unico punto di tempo acquisizione dati (4.1) viene utilizzato per determinare la percentuale di cellule con caspasi indotta prossimità presso un unico punto di tempo. Per questo protocollo, uno conta semplicemente il numero di cellule trasfettate Venus-positivi. Così, non è richiesta attrezzatura altamente specializzata e solo il più semplice microscopio a epifluorescenza con GFP (o YFP) e filtro RFP e un contatore di riscontro di mano è necessario. Alcuni sistemi di imaging possono essere automatizzati per prendere automaticamente un determinato numero di immagini per pozzetto di una piastra. Se tale strumentazione è disponibile, le cellule nelle immagini acquisite possono essere similmente contate mediante ispezione visiva, o quantificati utilizzando software di imaging. L'imaging tridimensionale (4.2) fornisce immagini ad alta risoluzione di caspase BiFC in tutto i piani focali della cella. Un microscopio confocale laser che eccita Venere e RFP (o il reporter di transfezione selezionate) e funzionalità Z-stack è necessaria. È disponibile un numero di moduli software di rendering 3D che forniscono diversi modi per visualizzare i dati. Per entrambi questi tipi di analisi, è possibile fissare le cellule e immagine o li valutano in un momento successivo. Tuttavia, il processo di fissazione diminuire il segnale di Venus, che potrebbe aggiungere artefatti per l'analisi e quindi questo approccio non è consigliato. Time-lapse imaging (4.3) utilizzabile per fornire l'analisi cinetica e posizionale simultanea di caspase BiFC. Un microscopio equipaggiato con un tavolino motorizzato impostabile a prendere le immagini delle posizioni multiple e anche confrontare diversi gruppi di trattamento nello stesso esperimento.
Per time-lapse, una serie di considerazioni aggiuntive dovrebbe essere presi in considerazione. La luce laser può causare artefatti a causa di fototossicità o photobleaching ed entrambi devono essere controllati per. In generale, entrambi può essere evitati utilizzando la minor quantità possibile di luce (tempi di potenza e breve esposizione ingresso bassa percentuale laser in passi 4.3.6-4.3.7). Fototossicità risultati quando la luce laser induce la morte nelle cellule e può essere controllata per le cellule non trattate nelle stesse condizioni di imaging e confermando che la divisione cellulare procede normalmente. Photobleaching si verifica quando più immagini scattate della stessa cella diminuisce la fluorescenza. La proteina fluorescente di Venus è abbastanza fotostabili, quindi questo è raramente un problema in pratica. Gli effetti di photobleaching possono essere determinati prendendo numerose immagini sequenziali di una cella di Venus-positivo e garantendo che la fluorescenza rimane stabile. Questo deve solo essere fatto una volta, purché le stesse impostazioni di potenza e l'esposizione laser sono utilizzate per ogni esperimento. Effetti a causa di fototossicità o photobleaching possono essere attenuati anche riducendo il numero totale di immagini acquisite. Ciò può essere ottenuto accorciando o allungando l'intervallo di tempo tra acquisizioni (passo 4.3.9). Utilizzo di intervalli di 5-10 min sopra un h 16 Time-lapse è un buon punto di partenza. Se non photoxicity è osservato o esperimenti di durata più breve sono richiesti, può essere ridotto l'intervallo tra i fotogrammi. Se l'attivazione delle caspasi è rapido, possono essere utilizzati più brevi esperimenti con intervalli di tempo più brevi. Ad esempio, per un esperimento di 16 h con intervalli di 10 minuti, un totale di 192 immagini si terrà (96 per ogni fluoroforo). Un esperimento di 2 h con intervalli di 1,5 m produce 160 immagini. Gli esperimenti di lunghi e brevi di conseguenza, sarebbero esporre le cellule a simili quantità totale di luce laser. Per esperimenti di breve durata il caspase stimolo di attivazione possa essere aggiunti direttamente ai media immediatamente prima dell'inizio dell'acquisizione del time-lapse (dopo passo 4.3.11 anziché al passaggio 3). Per effettuare questa operazione, rimuovere il coperchio dalla piastra e rilasciare delicatamente in una soluzione contenente lo stimolo utilizzando una pipetta. Fare attenzione a non si accalcano la piastra e verificare velocemente che le cellule sono ancora a fuoco prima di procedere.
Quando compiere esperimenti in time-lapse, è anche fondamentale per assicurarsi che l'ambiente circostante delle cellule molto simile a quella di un incubatore di coltura del tessuto. Un numero di controlli ambientali è disponibile sul microscopio diversi set up. Questi includono più piccole incubatrici top di fase, nonché camere ambientali che incapsulano il microscopio intero. Entrambi questi dispositivi di solito fornire calore, CO2e l'umidità alla camera in un modo che può essere controllato con precisione. Il controllo preciso di CO2 e temperatura è essenziale per il successo dell'esperimento perché imprevisto temperatura fluttuazioni possono portare a focale drift e assenza di CO2 fa sì che il pH dei media a salire che può essere tossici per le cellule. Se una fonte di CO2 non è disponibile, i media possono essere memorizzati nel buffer con l'aggiunta di Hepes (Vedi punto 3.1.1). Anche se una fonte di CO2 è disponibile, è consigliabile includere Hepes nel mezzo di imaging come una misura supplementare per mantenere le cellule sane. Tuttavia, anche in presenza di Hepes, l'assenza di CO2 per periodi prolungati di tempo può causare la morte delle cellule. Pertanto, è importante controllare le cellule non trattate, imaged sotto le stesse condizioni e il colore del supporto a conclusione dell'esperimento per garantire che il pH è rimasta stabile. Si noti che il rosso fenolo non deve necessariamente essere omesso da qualsiasi supporto utilizzato nel presente protocollo, poiché il contributo di autofluorescenza per il segnale di Venus è minimo.
Ci sono diversi metodi disponibili per analizzare i dati di imaging risultanti da un esperimento di lasso di tempo. Misurando l'intensità media del pixel di Venus per cellulari trasfettate è il modo più semplice per analizzare i tempi di caspasi indotta prossimità. Come illustrato nella Figura 3, Figura 4, Figura 5, il BiFC caspase-2 compare spesso come uno o più puncta situato in diversi compartimenti subcellulari. Analisi di imaging si avvicina che misura numeri di fuochi, dimensioni dell'oggetto o altri fattori simili possono produrre dati quantitativi ben informativi su queste strutture. Non tutte le caspasi BiFC appare come puncta. Ad esempio, i caspases infiammatori hanno mostrato diversi BiFC patterning, incluse singola o multiple puncta per cella 18fluorescenza diffusa e strutture filamentose. Questi modelli erano dipendente da caspasi attivata così come i segnali di attivazione a Monte. Di conseguenza, il tipo di analisi che è più adatto per i risultati di time-lapse in gran parte sarà dettato dal tipo di campitura fluorescente che è osservata.
Molti gli stimoli di trattamento che vengono valutati quando usando questo protocollo può indurre apoptosi direttamente tramite il caspase analizzati o indirettamente coinvolgendo una via di morte delle cellule differenti. Ciò induce le cellule a restringersi e staccare dalla piastra, che lo rende molto difficile per le celle di immagine e quasi impossibile da determinare qualsiasi localizzazione specifica di caspase-BiFC. L'inclusione di un inibitore di pan-caspase impedirà questa morte delle cellule. Il reclutamento delle caspasi alle loro piattaforme di attivazione e il caspase associato BiFC non dipende l'attività catalitica della caspasi. Di conseguenza, inibizione di caspase non avrà alcun effetto su questo passaggio, ma inibisce le caratteristiche fisiche a valle dell'apoptosi compreso blebbing, distacco e della eventuale perdita di integrità della membrana del plasma. Così, se effettuare analisi di punto finale (punto 4.1) o stack Z (passo 4.2), l'inclusione di un inibitore di caspase è essenziale. Per time-lapse esperimenti al contrario, se apoptosis-relativi eventi quali MOMP, annexin V che lega (per rilevare l'esposizione fosfatidil serina) o captazione dello ioduro di propidio (per rilevare la permeabilizzazione della membrana del plasma) devono essere analizzati al fianco di caspase BiFC, il inibitore di caspase deve essere omesso per evitare l'inibizione di questi eventi. Un inibitore di caspase come qVD-OPh (10-20 µM) dovrebbe aggiungersi nei media che contiene lo stimolo che inducono apoptosi (punto 3.1.1). Se co-che esprimono una proteina pro-apoptotica con i componenti di BiFC caspasi, l'inibitore di caspase dovrebbe essere aggiunto al passo 2.1.12.
Mentre caspase BiFC è uno dei pochi metodi disponibili che possono essere utilizzati per visualizzare gli eventi in vie di attivazione di caspase in cellule vive, una serie di considerazioni deve tener conto durante la progettazione di questi esperimenti. Poiché questo approccio è basato su sovraespressione, controlli per specificità sono importanti. Questo può essere realizzato in uno dei due modi. In primo luogo, introduzione delle singole mutazioni puntiformi nella carta o DED del propeptide tale che interrompono l'associazione tra la caspasi e la sua piattaforma di attivazione di caspase dovrebbe diminuire l'intensità della caspasi BiFC sia la percentuale di Venus-positivo cellule. Ad esempio, mutazione del residuo D59 e nel propeptide di caspase-1 interrompe il legame per la proteina dell'adattatore ASC (apoptosi-speck-come proteina collegata contenente una scheda) e ugualmente sconvolge indotta da ASC caspase-1 BiFC 18,24 . In secondo luogo, utilizzo di cellule che sono carenti nelle proteine adattatrici che reclutano le caspasi alla piattaforma di attivazione diminuirà segnali specifici BiFC. Questo può essere realizzato utilizzando cellule ad eliminazione diretta, se disponibile, o utilizzando siRNA o basate su CRISPR/Cas9 si avvicina per esaurire le cellule dell'adattatore. Di conseguenza, lo svuotamento della proteina caspase-2 adattatore RAIDD completamente bloccato BiFC caspase-2 indotta da shock termico o DNA danni 14,17. Per questi esperimenti, il KO o celle di colpo dovrebbero essere rispetto alle cellule di controllo abbinati (cioè cucciolata-abbinato cellule wild type MEF o controllo atterramento) e, se viene utilizzata una nuova linea di cella, le condizioni ottimali di transfezione dovrebbero essere valutate per assicurare uguale espressione del reporter BiFC attraverso linee cellulari.
Una seconda limitazione di questo approccio è che, quando si utilizza la trasfezione transiente, è difficile garantire che ogni cellula esprime quantità uguali di ogni proteina. Se espressione non è uguale, un frammento di Venus potrebbe essere assunti per la piattaforma alle frequenze più alte. Questo potrebbe mascherare il segnale completo fluorescente e portare a risultati falsi negativi. Per ovviare a questo problema, una nuova versione del caspase BiFC reporter per la generazione di linea cellulare stabile è stato recentemente segnalato 17. Questa nuova versione ha consistito di un costrutto che esprime i componenti C2 Pro-BiFC su un telaio di lettura aperto singolo separato dai peptidi self-che fende virale 2A 25. Pertanto, i componenti BiFC sono trascritti come un singolo mRNA da stesso promotore ma tradotto per produrre quantità stechiometricamente uguali di proteine di fusione VC e VN. Le linee cellulari generate per esprimere stabilmente questo costrutto dimostrato tendenze simili di attivazione ai reporter transitoriamente espressa ma erano più sensibili sia visualizzato abbassare la fluorescenza di fondo. Così, il protocollo di cui sopra può essere notevolmente semplificato se utilizzato in combinazione con linee cellulari di reporter che esprimono stabilmente i componenti BiFC caspasi.
I dati fin qui suggeriscono minima interferenza tra i componenti di BiFC caspasi e le proteine endogene. Ad esempio, caspase-2 è conosciuto per essere attivato a Monte di MOMP ma caspase-2 BiFC non bloccare la progressione di MOMP 14. Così, questi giornalisti non sembrano agire in un modo negativo dominante. Tuttavia, se allo stesso tempo valutare eventi a valle, questo dovrebbe essere studiato all'interno di ogni serie di esperimenti. Inclusione di un controllo non trasfettate bene nell'esperimento è il modo migliore per avvicinarsi a questo. Se la cinetica della morte delle cellule rimangono immutata con o senza espressione del sensore caspasi, questo indicherà che i componenti di caspase-BiFC non interferiscano con la funzione endogena. Al contrario, la caspasi endogeno potrebbero eventualmente influenzare la lettura BiFC, efficienza o nella dimensione o la forma delle strutture. Esprimendo il reporter in cellule carenti per il caspase controllerà per questo.
Nonostante queste limitazioni, la caspasi BiFC tecnica sono un metodo utile per interrogare vie di attivazione di caspase che possono integrare e migliorare anche sugli approcci esistenti per misurare l'attivazione di caspase iniziatore. Dalla misura indotta prossimità, il primo passo nell'attivazione, questa tecnica supera i problemi associati con passaggi successivi come caspase elaborazione automatica associata con l'attivazione di misurazione. Ad esempio, durante l'utilizzo di western blot per monitorare la scissione dei caspases boia, caspase-3 e caspasi-7, fornisce una misura precisa di attivazione 2, utilizzando lo stesso approccio per initiator caspases possono essere imperfetti. Questo è perché la scissione dei caspases iniziatore, non è sufficiente per attivazione 4,26,27. Infatti, molti initiator caspases sono spaccati durante l'apoptosi di caspase-3 senza produrre enzimi attivi 28. Allo stesso modo, tecniche basate sull'utilizzo di substrati del peptide progettati come bersagli per caspasi specifico necessario tener conto delle specificità di sovrapposizione di queste sequenze per i caspases 29. Questo non significa che tali approcci non possono essere utilizzati per misurare l'attivazione delle caspasi, ma gli inconvenienti devono riconoscersi nell'interpretazione dei risultati. Caspase BiFC fornisce un approccio alternativo che può aiutare a confermare i risultati utilizzando i metodi più tradizionali. Inoltre, la capacità di monitorare l'assemblaggio dei complessi di attivazione di caspase in tempo reale e di distintamente determinano la dimensione, la forma e la localizzazione dei complessi è un notevole vantaggio di questa tecnica che non è possibile valutare con altri mezzi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri precedenti del laboratorio Bouchier-Hayes, che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal ospedale pediatrico pilota premio Texas bambini a LBH. Ringraziamo la Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) per il permesso di includere i dati pubblicati in collaborazione con la sua squadra. Lo sviluppo dei reagenti descritto è stato sostenuto dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J.
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S.
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M.
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
