Summary
ويصف هذا البروتوكول caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك)؛ أسلوب المستندة إلى التصوير التي يمكن استخدامها لتصور قرب المستحث للبادئ caspases، وهو الخطوة الأولى في تفعيل تلك.
Abstract
الأسرة caspase من البروتياز أدواراً أساسية في المبرمج والحصانة الفطرية. ومن بين هذه هي فرعي المعروفة باسم caspases البادئ الأولى لتفعيلها في هذه المسارات. وتشمل هذه المجموعة caspase-2،-8، و-9، فضلا عن caspases التحريضية، كاسباسي-1،-4، و-5. يتم تنشيط جميع caspases البادئ من ثنائي بعد التعيين إلى مجمعات مولتيبروتين محددة يسمى منصات التنشيط. Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو نهج القائم على التصوير فيها تقسيم البروتينات الفلورية تنصهر للبادئ وتستخدم كاسباسيس لتصور توظيف caspases البادئ لبرامجهم التنشيط وما يترتب على ذلك قرب المستحث. وتوفر هذه الأسفار قراءات لواحدة من أولى الخطوات المطلوبة لتفعيل caspase البادئ. باستخدام عدد من مختلف النهج القائم على الفحص المجهري، هذا الأسلوب يمكن أن توفر البيانات الكمية على كفاءة تفعيل caspase على مستوى سكان، فضلا عن حركية تفعيل caspase وحجم وعدد من تفعيل caspase المجمعات على أساس كل خلية.
Introduction
الأسرة حوزتي caspase معروفة بأدوارها الحاسمة في المبرمج والحصانة الفطرية 1. نظراً لما لها من الأهمية تحديد متى، أين، ومدى كفاءة يتم تنشيط caspases محددة يمكن أن توفر رؤى حاسمة في آليات caspase مسارات التنشيط. البروتوكول على أساس التصوير الموصوفة هنا يمكن تصور الخطوات الأولى في تتالي التنشيط كاسباسي. ويستفيد هذا الأسلوب التفاعلات الدينامية البروتين: البروتين أن تفعيل caspase محرك الأقراص.
Caspases يمكن تقسيمها إلى مجموعتين: caspases البادئ (caspase-1،-2،-4،-5،-8،-9،-10 و-12) و caspases الجلاد (caspase-3،-6، و-7). موجودة في الخلية ك dimers بريفورميد caspases الجلاد ويتم تنشيطها بالانقسام بين وحدة فرعية كبيرة وصغيرة 2. عند تنشيط، أنها تنشق العديد من البروتينات الهيكلية والتنظيمية أدى إلى المبرمج 3. Caspases البادئ هي كاسباسيس الأولى تفعيلها في طريق، وعموما يؤدي تنشيط caspases الجلاد. وعلى النقيض من الجلاد caspases، يتم تنشيط caspases البادئ من ثنائي 4،5. هذا ثنائي يسهل تجنيد مونومرات الخاملة إلى مجمعات محددة الوزن الجزيئي الكبير المعروف بتفعيل الأنظمة الأساسية. الجمعية العامة لتنشيط منصات محكوم بسلسلة من التفاعلات المحددة البروتين: البروتين. هذه هي وساطة من البروتين المصانة التفاعل زخارف موجودة في بروفورم من caspase البادئ وتشمل المجال الموت (دد) والموت المستجيب المجال (الدائرة) و caspase تعيين المجال (بطاقة) 6 (الشكل 1A). عموما تشمل منصات تنشيط مستقبلات بروتين وبروتين محول. عادة ما يتم تنشيط المستقبلات عليه ملزم ليجند، حفز تغيير كونفورماشونال الذي يسمح أوليجوميريزيشن جزيئات عديدة. ثم المجندين المستقبلات أما caspase مباشرة أو محول الجزيئات التي تجلب بدورها في كاسباسي إلى المجمع. وهكذا، تأتي العديد من الجزيئات caspase إلى مقربة من السماح لثنائي. هذا هو المعروف بنموذج قرب المستحث 7. بمجرد ديميريزيد، يخضع كاسباسي حدث، مما يؤدي إلى استقرار في نشاط إنزيم 4،8. على سبيل المثال، يتم تشغيل جمعية أبوبتوسومي Apaf1 بواسطة ج الفسفرة عقب الإفراج عنها من الميتوكوندريا في عملية تسمى الميتوكوندريا الغشاء الخارجي permeabilization (الموقع). Apaf1 المجندين بدوره caspase-9 عن طريق تفاعل الذي هو توسط بطاقة موجودة في كلا البروتينات 9. نتيجة تفاعلات البروتين مماثلة في الجمعية CD95 وفاة حمل إشارات معقدة (القرص) الذي يؤدي إلى تفعيل caspase-8؛ بيدوسومي، التي يمكن تفعيل caspase-2؛ ومختلف مجمعات إينفلاماسومي أن الشروع في تفعيل caspase-1 10،،من1112. وهكذا، يجند caspases البادئ إلى منصات التنشيط محددة بإنشاء إليه مشتركة مما أدى إلى قرب المستحث وثنائي، التي بدونها لن يحدث التنشيط.
Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو تحليل القائم على التصوير التي وضعت لقياس هذه الخطوة الأولى في تفعيل caspases البادئ، والسماح للتصور مباشرة قرب كاسباسي التي يسببها اتباع منهاج التنشيط الجمعية. يأخذ هذا الأسلوب تستفيد خصائص البروتين انقسام نيون فينوس. كوكب الزهرة هو أكثر إشراقا وأكثر فوتوستابل نسخة من البروتين نيون أصفر (يفب) التي يمكن فصلها في الأجزاء غير الفلورية وتداخل طفيف اثنين: N-المحطة الزهرة (فينوس N أو VN) وج-المحطة فينوس (الزهرة ج أو الرأسمالي). هذه الشظايا الاحتفاظ بالقدرة على ريفولد وتصبح الفلورسنت عند في مقربة من 13. هو تنصهر فيها كل جزء الزهرة إلى برودومين من كاسباسي، وهو الجزء الأدنى من كاسباسي الذي يربط إلى منصة التنشيط. وهذا ما يضمن أن لا تحتفظ caspases النشاط الأنزيمي وذلك التحليل المتزامن لإحداث المتلقين للمعلومات المرتبطة بالأحداث الذاتية من الممكن. وشظايا فينوس ريفولد عند برودومينس caspase يعينون لمنصة التنشيط والخضوع لقربها المستحث. (الشكل 1B). الأسفار فينوس الناتجة يمكن أن ترصد بدقة وعلى وجه التحديد التعريب سوبسيلولار وحركية كفاءة جمعية منصات تفعيل caspase البادئ في الخلايا المفردة. تصوير البيانات يمكن الحصول عليها بالفحص المجهري [كنفوكل] أو بواسطة الفحص المجهري fluorescence القياسية ويمكن تكييفها مع عدد من النهج مجهرية مختلفة بما في ذلك: الوقت الفاصل بين التصوير لتتبع تفعيل caspase في الوقت الحقيقي؛ التصوير عالية الدقة لتحديدات دقيقة للتعريب سوبسيلولار؛ ونقطة النهاية الكمي للكفاءة للتنشيط.
ووضع هذا الأسلوب أولاً للتحقيق في تفعيل caspase-214. بينما برنامج تفعيل caspase-2 يعتقد أن بيدوسومي، تتألف من مستقبلات بيد (بروتين p53 المستحثة مع مجال موت) ومحول ريد (المرتبطة بالتمزق معنوي-1/CAD-3 بروتين مثلى مع مجال موت)، وأبلغ تفعيل caspase-2 بيدوسومي--المستقلة. وهذا يوحي بوجود مناهج إضافية تفعيل caspase-2 15،16. على الرغم من عدم معرفة كامل مكونات النظام الأساسي تفعيل caspase-2، سمح caspase بيفك تقنية للاستجواب ناجحة من مسارات الإشارات caspase-2 في المستوى الجزيئي 14،17. لقد تكيفت أيضا بنجاح هذا البروتوكول بالنسبة caspases التحريضية (caspase-1،-4،-5 و-12) 18 ، وعلى نفس النهج من حيث المبدأ، ينبغي أن تكون كافية لتحليل كل من caspases البادئ المتبقية وبالمثل. هذا البروتوكول يمكن تكييفها على نحو مماثل للتحقيق في مسارات أخرى كانت ثنائي إشارة تفعيل رئيسية. على سبيل المثال، يتم تنشيط البروتينات ستات من ثنائي بعد الفسفرة يانوس كيناز (جاك) 19. وهكذا، يمكن استخدام نظام بيفك وضع تصور لتفعيل القانون الأساسي، فضلا عن العديد من مسارات أخرى تخضع لتفاعلات البروتين الحيوي. ويوفر البروتوكول التالية إرشادات خطوة بخطوة للأخذ بالصحفيين في الخلايا وكذلك منهجيات للحصول على الصور، وتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلايا وأطباق الثقافة
ملاحظة: إجراء الخطوات من 1 إلى 3 في غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة. ارتداء القفازات.
- في حالة استخدام الزجاج أسفل الأطباق، معطف الزجاج مع فيبرونيكتين. تخطي إلى "الخطوة 1، 2" إذا كان استخدام أطباق البلاستيك.
- جعل حلاً 0.1 مغ/مل من فيبرونيكتين: تمييع 1 مل 1 ملغ/مل فيبرونيكتين الحل في 9 مل من 1 X PBS.
- تغطية الجزء السفلي من الزجاج لكل بئر مع 0.5-1 مل فيبرونيكتين واحتضان لمدة 1-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ماصة، جمع الحل فيبرونيكتين وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الحل فيبرونيكتين يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. - يغسل الزجاج مرة واحدة مع 1-2 مل 1 X برنامج تلفزيوني، ونضح إيقاف برنامج تلفزيوني.
- بلايت 1 × 105 خلايا كل من لوحة 6-جيدا في 2 مل الخلية المناسبة جيدا ثقافة وسائل الإعلام (انظر الجدول 1 لأرقام الخلية لاستخدامها لآبار مختلفة الحجم). في حالة استخدام خط خلية ثابت يعبر عن مكونات بيفك caspase (انظر المناقشة)، لوحة 2 × 105 خلايا والمضي قدما إلى الخطوة العلاج (الخطوة 3).
- السماح بالانضمام إلى الطبق بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة الخلايا.
2-تعداء الخلايا إدخال مكونات بيفك caspase
- ترانسفيكت الخلايا مع الكاشف تعداء المناسبة.
ملاحظة: هذا البروتوكول يحدد التعليمات الخاصة بعام 2000 ليبوفيكتاميني، التي تم الأمثل للحد الأدنى من السمية. هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح في خلايا هيلا، MCF7 الخلايا والخلايا LN18. إذا كان استخدام إضافية اتبع تعليمات الشركة المصنعة من الكواشف تعداء والأمثل حسب الحاجة.- إضافة 12 ميليلتر من الكاشف تعداء ميليلتر 750 وسائط المصل انخفاض في أنبوب عقيم.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 نانوغرام من بلازميد مراسل (بلازميد ترميز بروتين فلوري، مثل الأحمر نيون البروتين [العروض]، التي سيتم تسمية الخلايا ترانسفيكتيد) إلى أنبوب معقم 1.5 مل لكل بئر يكون ترانسفيكتيد.
- إضافة 20 نانوغرام لكل بلازميد بيفك caspase (مثلاً، 20 نانوغرام caspase-2 برودومين [برو C2]-الرأسمالي و 20 نانوغرام من C2 برو-VN) لكل أنبوبة (الجدول 2).
- إحضار كل أنبوبة تصل إلى إجمالي حجم 100 ميليلتر بإضافة المصل انخفاض وسائل الإعلام.
- استخدام ماصة p200، إضافة 100 ميليلتر من تعداء كاشف الحل من الخطوة 2.1.2 إلى بلازميد الخليط بطريقة دروبويسي.
- احتضان هذا المزيج كاشف بلازميد-تعداء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح وسائط الإعلام من الخلايا باستخدام ماصة أو بالشفط وثم، باستخدام ماصة p1000، "الماصة؛" 800 ميليلتر من المصل وسائل الإعلام الحرة برفق أسفل الجانب من البئر.
- استخدام ماصة p200، إضافة 200 ميليلتر من الحمض الدهني مجمع دروبويسي لكل بئر.
- احتضان الخلايا في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية ح 3.
- مع الحرص على عدم الإخلال أحادي الطبقة، قم بإزالة الوسائط الحرة المصل الذي يحتوي على مجمعات الحمض الدهني بالشفط باستخدام الشفط أو مع ماصة.
- "الماصة؛" 2 مل وسائط النمو الكامل المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) برفق أسفل الجانب من كل بئر.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة ح 24-48 للتعبير الأمثل من البروتين.
3-تنظيم دورات تعريفية لتفعيل caspase
- تعامل مع المخدرات أو الحافز الذي يدفع caspase التنشيط حوالي 24 ح تعداء بعد.
- إضافة التركيز المطلوب من المخدرات لاستعد قبل (37 درجة مئوية) تصوير الوسائط (وسائط النمو الكامل وتستكمل مع حبيس [20 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5] و [55 ميكرومتر] 2-mercaptoethanol) والمزيج بلطف (الجدول 3).
- نضح وسائط الإعلام من الخلايا باستخدام ماصة أو بالشفط وثم، باستخدام ماصة، "الماصة؛" 2 مل الحل من 3.1.1 برفق أسفل الجانب من البئر.
- إضافة وسائط التصوير بدون المخدرات إلى بئر واحدة كعنصر تحكم غير معالجة.
- احتضان الخلايا في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة 4.3 لتجربة الزمن الفاصل.
4. الحصول على البيانات بيفك Caspase
-
بيفك Caspase لاكتساب نقطة مرة واحدة
- قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء الفلورسنت اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- العثور على الخلايا في إطار تصفية طلبات تقديم العروض والتركيز على الأسفار الجينات مراسل.
- استخدام عداد حصيلة يد، حساب كافة الخلايا الحاملات لطلب تقديم العروض في مجال visual. سجل العدد.
- مع المحافظة على نفس الحقل البصرية، قم بالتبديل إلى تصفية التجارة والنقل (أو تصفية يفب إذا كانت متوفرة)، واستخدام عداد حصيلة يد، حساب عدد الخلايا الحمراء التي أيضا الخضراء (فينوس-إيجابية). قم بالتبديل ذهابا وإيابا بين اثنين من المرشحات لضمان أن يتم تقييم الخلايا الحمراء فقط لكوكب الزهرة الإيجابية. تسجيل العدد (الشكل 3).
- عد الخلايا الحاملات لطلب تقديم العروض 100 على الأقل من كل مجموعة من ثلاثة مجالات فردية اللوحة.
- في كل منطقة، بحساب النسبة المئوية للمصابات فينوس transfected الخلايا (أي الخلايا الحمراء التي أيضا الخضراء). متوسط النسب المئوية الناتجة للحصول على الانحراف المعياري.
-
تصوير ثلاثي الأبعاد ل caspase بيفك
- قم بتشغيل المجهر اتباع إرشادات الشركة المصنعة وإطلاق برامج اكتساب.
- حدد 60 x أو 63 x النفط الهدف ووضع قطره نفط على الهدف
- ضع الطبق الثقافة في مرحلة مجهر استخدام حامل اللوحة الصحيحة.
- باستخدام أما من مصدر ضوء ابيفلوريسسينسي وقطعة العين مجهر أو الليزر [كنفوكل] وشاشة الكمبيوتر، انتقل إلى حقل للفائدة.
- وتركز على الأسفار المراسل باستخدام الليزر طلب تقديم العروض أو تصفية.
- إذا تم استخدام ابيفلوريسسينسي حتى هذه النقطة، التبديل مصدر الضوء بالليزر [كنفوكل] وتصور الصورة الحية من الخلايا المكتسبة بواسطة الكاميرا وعرضها بالبرنامج الحصول على شاشة الكمبيوتر.
- باستخدام عصا التحكم وعجلة التركيز، تهذيب، التركيز وموقف من الخلايا حيث تكون الخلايا في مركز عرض الباحث. اختر الخلايا التي تكون مفصولة عن بعضها البعض وليست متداخلة.
- إدخال سلطة الليزر نسبة 50% وزمن التعرض في 100 مللي ثانية لكوكب الزهرة وطلب تقديم العروض كنقطة انطلاق لتحديد الإعدادات المثلى لاستخدام للتجربة.
- تشغيل التقاط حية وتفقد الصورة الناتجة وهو العرض المصاحب لكل القنوات.
- إذا كانت الإشارة منخفضة والصورة من الصعب أن تجعل من أصل، زيادة النسبة المئوية الليزر الوقت السلطة و/أو التعرض بزيادات حتى الإشارة في الصورة تبدو جيدة.
- تأكد من أن الإشارة لا تصل إلى الإشباع. فحص عرض الرسم البياني للتأكد من ذروة متميزة مرئياً لكل فلور. إذا كانت الذروة يشمل عرض الرسم البياني الكامل، إدخال خفض إعدادات الطاقة والتعرض لليزر (الشكل 2).
- تصور الخلايا التحكم (غير المعالجة أو غير ترانسفيكتيد) بنفس الشروط التأكد من أن الإشارة محددة.
ملاحظة: ترانسفيكتانتس لون واحد يمكن استخدامها أيضا لعنصر التحكم للانتقال، ولكن إذا كانت الإشارات مكانياً مميزة (مثل الميتوكوندريا مقابل سيتوسوليك) هذا ليس ضروريا. - حدد أو قم بفتح الوحدة النمطية المكدس Z في برنامج المجهر.
- استخدام مقبض التركيز، أرقام تقريبية لتنسيق موقف المقابلة لمركز الخلية.
- ضبط التركيز في اتجاه واحد حتى لم يعد مرئياً الخلية، حدد هذا الموضع العلوي.
- ضبط التركيز في الاتجاه المعاكس حتى الخلية لم يعد مرئياً مرة أخرى وحدد هذا الموضع السفلي.
- اختر حجم الخطوة المثلى (عادة حوالي 20 ميكرومتر) والبدء في الحصول على إصدار تعليمات للكاميرا لالتقاط صورة واحدة تلقائياً في كل قناة في كل خطوة من خطوات ميكرومتر 20 بين المناصب العليا والسفلي.
- استخدام برامج تقديم ثلاثي الأبعاد لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد (الشكل 4، 1 الفيلم).
-
الوقت الفاصل بين التصوير من caspase بيفك
- قم بتشغيل المجهر على الأقل 1 ساعة قبل التجربة، وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- حدد 40 x أو 60 x 63 x النفط الهدف ووضع قطره نفط على الهدف.
- ضع الطبق الثقافة في مرحلة مجهر استخدام حامل اللوحة الصحيحة.
- في حالة توفر مصدر2 CO، وضع الجهاز التسليم2 CO (عادة شبكي غطاء المرفقة إلى الأنبوب الذي يسلم CO2) على رأس صاحب اللوحة. تعيين أول أكسيد الكربون مستوى2 إلى 5%، وقم بتشغيل وحدة تحكم2 CO من داخل البرنامج. إذا لم يتوفر مصدر2 CO، تشمل 20 مم حبيس المخزن المؤقت وسائط الإعلام.
- انتقل إلى حقل transfected الخلايا وتصور الصورة الحية من الخلايا المكتسبة بواسطة الكاميرا وعرضها بالبرنامج الحصول على شاشة الكمبيوتر باستخدام الليزر طلب تقديم العروض.
- وفي أعقاب الخطوات 4.2.8-4.2.12، في الإعدادات الإدخال النسبة المئوية الليزر مرة السلطة والتعرض لليزر طلب تقديم العروض. تبقى هذه القيم منخفضة قدر الإمكان في حين لا تزال قادرة على الكشف عن إشارة الفلورسنت.
- استخدام عنصر تحكم إيجابية العينة (انظر الجدول 3 للحصول على أمثلة)، اتبع الخطوات 4.2.8-4.2.12 لإدخال الإعدادات للنسبة المئوية الليزر وقت السلطة والتعرض لضوء الليزر يفب. تبقى هذه القيم منخفضة قدر الإمكان في حين لا تزال قادرة على الكشف عن إشارة الزهرة.
- لكل بئر من اللوحة، اختر عدد من المواقف المختلفة التي تحتوي على واحد أو أكثر من خلايا معربا عن المراسل.
- إدخال الفاصل الزمني بين كل إطار من الوقت الفاصل بين ومجموع عدد الإطارات التي تم اتخاذها. ضمان وجود الوقت للحصول على جميع المواقع المحددة قبل الإطار التالي أن تؤخذ.
- إعادة زيارة كل موقف وتصحيح وتحديث التركيز حسب الحاجة.
- لتصحيح الانحراف المحورية التي يمكن أن تنجم عن التغيرات في درجة الحرارة أو الاهتزازات الخارجية، قم بتشغيل نظام تصحيح الانحراف التركيز (إذا كان متوفراً).
- تبدأ مرور الزمن وحفظ البيانات.
- تحليل البيانات باستخدام برنامج التصوير المتاحة (الشكل 5، 2 الفيلم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مثال على بيفك caspase-2 الناجم عن تلف الحمض النووي في الشكل 3. كامبتوثيسين، توبويسوميراسي أنا استخدمت المانع، للحث على تفعيل الحمض النووي الضرر وكاسباسي-2. مشري البروتين الفلورسنت الأحمر كمراسل لإظهار أن الخلايا من التعبير عن التحقيق بيفك والمساعدة في تصور العدد الإجمالي للخلايا. الأسفار فينوس يظهر باللون الأخضر وبونكتا كبيرة تمثل caspase-2 الناجم عن قرب. يمكن عد هذه الخلايا لتحديد النسبة المئوية للخلايا فينوس الإيجابية. يمكن أيضا إجراء الاستنتاجات حول التعريب سوبسيلولار من مثل هذه الصور. في المثال الموضح، اكتشفت قرب المستحث caspase-2 في نوية كذلك كما هو الحال في السيتوبلازم 17. تقديم التصور عالية الدقة للتعريب سوبسيلولار لتفعيل caspase معقدة، يمكن تصويرها الخلايا المفردة في ثلاثة أبعاد. ويبين الشكل 4 طريقتين لتمثيل هذه الصور الثلاثية الأبعاد. الأول لتوليد إعمار الخلية بشكل ثلاثي الأبعاد. يوضح المثال المستحثة camptothecin بيفك caspase-2 في نواة باللون الأحمر والأخضر. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد يظهر التعريب النسبية لكلا فلوروفوريس في جميع أنحاء الخلايا. يعتبر هذا النوع لعرض نتائج فعالة بشكل خاص عندما قدمت كفيلم، تناوب الخلية حول محور واحد (فيلم 1). الفريق الثاني هو رأي المتعامدة للخلية نفسها. ويوفر هذا التصور xyو xz yz من الخلية عند نقطة معينة في الخلية. تصوير للنتائج بهذه الطريقة يمكن أن تكون أكثر ملاءمة لعرض ورقة كما هو الحال في مقال مجلة أنه من الأسهل لتفسير البيانات 3D المقدمة في شكل ثنائي الأبعاد. يبين الشكل 5 مثال على تصوير مرور الزمن من بيفك caspase-2 في خط خلية جليوبلاستوما تعامل مع bortezomib مثبط بروتوزوم (انظر أيضا 2 الفيلم). ويبين الرسم البياني الزيادة في متوسط كثافة فينوس كل خلية في المتوسط عبر عدد من الخلايا (مقتبس من 20). يمكن أيضا عرض هذا النوع من البيانات كعدد من آثار خلية واحدة فقط في رسم بياني واحد. في المثال الموضح، بداية قرب caspase الناجمين عن حوالي 2 ساعة بعد العلاج.
رقم 1: التخطيطي هيكل caspase ومنهجية التكامل (بيفك) الأسفار بيموليكولار. (أ) الهيكل العام caspase البادئ. ويرد مفارز برودومين، كبيرة وصغيرة، وحفظت عزر قاكرج يحتوي على سيستين الموقع النشط. (ب) يستخدم بيفك تقسيم البروتينات الفلورية التي وحدها ليست الفلورسنت ولكن يمكنك إقران لإصلاح جزيء فلوري عندما تنصهر للبروتينات المتفاعلة. ل caspase بيفك، برودومين (برو) أو كامل طول caspase هو تنصهر فيها إلى N--المحطة الطرفية نصف (فينوس-N) وإلى ج-المحطة نصف (فينوس-ج) من كوكب الزهرة. في دولته أحادي لا تكون البروتينات الانصهار caspase الفلورسنت. عند التعيين إلى منصة تنشيط، مثل بيدوسومي، كما هو موضح هنا، ينفذ اتحاد نصفي الزهرة تمثل caspase الناجمين عن قرب التي يتم قياسها كزيادة في الأسفار فينوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: صورة تمثيلية للاعتراف بتشبع باستخدام الرسم البياني عرض. وترد أمثلة للأمثل (اللوحة العلوية) وإشارات المشبعة (لوحة أقل). يتم إظهار فينوس (ذروة الأصفر) وإشارات طلب تقديم العروض (ذروة أحمر). المحور يشير إلى كثافة والمحور الصادي عدد وحدات البكسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Caspase-2 bimolecular fluorescence التكامل (بيفك) عقب تلف الحمض النووي- خلايا هيلا معربا عن مكونات بيفك caspase-2 قد تركت دون علاج (A) أو تعامل مع camptothecin (100 ميكرومتر) (ب) حضور قفد-أف (20 ميكرومتر). وكان مشري أعرب المشترك كمراسل فلورسنت. صور الممثل تظهر الخلايا (حمراء) مع بيفك caspase-2 (الأخضر) في الخلايا تعامل camptothecin 16 ح بعد العلاج. تمثل أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التعريب من الأسفار bimolecular caspase-2 التكامل (بيفك)- وعولج خلايا هيلا معربا عن مكونات بيفك caspase-2 ومراسل نووية فلورسنت مع camptothecin (20 ميكرومتر) حضور قفد-أف (20 ميكرومتر). عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يتألف من 0.1 ميكرو المسلسل الصور [كنفوكل] إلى z-طائرة الخلية بعد 24 ساعة وتظهر النواة في بيفك الأحمر و caspase-2 باللون الأخضر. ترك الفريق يظهر تعمير تقديم إسقاط 3D أقصى شدتها (انظر أيضا 1 الفيلم). اللوحة اليسرى يظهر عرض الشرائح المتعامدة للخلية نفسها. المربع الأوسط (الأزرق) هو أن الطائرة س وص والمربع إلى اليمين (أصفر) هو أن الطائرة yz أعلى مربع (أبيض) هي الطائرة xz . طائرات yz و xz تتقاطع وفقا التنشين. تمثل أشرطة مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الوقت الفاصل بين من التكامل bimolecular fluorescence caspase (بيفك) (أ) خلايا جليوبلاستوما LN18 transfected مع مكونات بيفك caspase-2 وعلامة المتقدرية فلورسنت أحمر (دسريد-ميتو، أحمر) تعامل مع بورتيزوميب (15 نانومتر) حضور قفد-أوف (20 ميكرومتر). وضعت الخلايا في مجهر [كنفوكل] عند 37 درجة مئوية وتم أخذ صور كل 2 دقيقة ل h. 8 صور من الخلايا الممثل من إظهار الوقت الفاصل بين أن قرب المستحث للعنصرين بيفك caspase-2 أدى إلى زيادة في الأسفار فينوس ( أخضر) مع مرور الوقت. (ب) وتم قياس متوسط كثافة كوكب الزهرة في كل خلية في كل نقطة في الوقت. فينوس fluorescence ازدادت بمرور الزمن بعد العلاج بورتيزوميب. شعبة في عنصر التحكم غير المعالجة إلى ظروف سمية منخفضة أو لا تذكر من ضوء الليزر (الشكل مقتبس من 20). تمثل حجم أشرطة تمثل 20 ميكرومتر. أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط (SEM) 8 (المراقبة) وخلايا فردية (بورتيزوميب) 14 (انظر أيضا 2 الفيلم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| حجم اللوحة | عدد الخلايا | حجم الوسائط |
| 6 لوحة جيدا | 1 × 105 خلايا/جيد | 2 مل |
| 12 لوحة جيدا | 5 × 104 خلايا/جيد | 1 مل |
| 24 لوحة جيدا | 2.5 × 104 خلايا/جيد | 0.5 مل |
| طبق الدائرة 4 | 2.5 × 104 خلايا/الدائرة | 1 مل |
| طبق الدائرة 8 | 1.25 × 104 خلايا/الدائرة | 0.5 مل |
الجدول 1: مبادئ توجيهية لإعداد من الخلايا إلى اللوحة- في حالة استخدام الخلايا ستابلي معربا عن مكونات التكامل (بيفك) مضان bimolecular caspase، لوحة ضعف المبالغ المبينة هنا.
| حجم اللوحة | كاشف تعداء | انخفاض مصل وسائل الإعلام | مراسل بلازميد | بلازميد VC Caspase-برو | بلازميد VN Caspase-برو | انخفاض مصل وسائل الإعلام إضافة إلى مزيج بلازميد | الحل كاشف تعداء إضافة إلى مزيج بلازميد | وسائل الإعلام الحرة مصل إضافة إلى الخلايا |
| 6 لوحة جيدا | 12 ميليلتر/لوحة | 750 ميليلتر | 10 نانوغرام | 20 نانوغرام | 20 نانوغرام | بإجمالي 100 ميليلتر | 100 ميليلتر | 800 ميليلتر |
| 12 لوحة جيدا | 12 ميليلتر/لوحة | 750 ميليلتر | 5 نانوغرام | 10 نانوغرام | 10 نانوغرام | لعدد 50 ميليلتر | 50 ميليلتر | 400 ميليلتر |
| 24 لوحة جيدا | 12 ميليلتر/لوحة | 750 ميليلتر | 2.5 نانوغرام | 5 نانوغرام | 5 نانوغرام | لحساب إجمالي 25 ميليلتر | 25 ميليلتر | 200 ميليلتر |
| طبق الدائرة 4 | 4 ميليلتر/لوحة | 250 ميليلتر | 2.5 نانوغرام | 5 نانوغرام | 5 نانوغرام | لحساب إجمالي 25 ميليلتر | 25 ميليلتر | 200 ميليلتر |
| طبق الدائرة 8 | 4 ميليلتر/لوحة | 250 ميليلتر | 1.25 نغ | 2.5 نانوغرام | 2.5 نانوغرام | لحساب إجمالي 12.5 ميليلتر | ميليلتر 12.5 | 100 ميليلتر |
الجدول 2: أوصى بكميات من الكواشف المستخدمة لعابر تعداء. ملاحظة: مقدار بلازميد اقترح نقطة بداية فقط. إذا تم الكشف عن أي إشارة، من المستحسن أن تيتراتي بلازميد من 20-200 نانوغرام كل من لوحة 6-جيدا جيدا.
| كاسباسي | العلاج | تركيز | الوقت | النتائج المتوقعة |
| كاسباسي-1 | الرابطة المعلنة المفرط | 250 نانوغرام/جيدا من صفيحة جيدا 6 | ح 48 | 50% بيفك إيجابي |
| كاسباسي-2 | ريد المعلنة المفرط | من صفيحة جيدا 6 500 نانوغرام/جيدا | ح 24 | 90% بيفك إيجابي |
| كامبتوثيسين | 100 ميكرومتر | ح 16 | 30-60% بيفك إيجابي | |
| صدمة الحرارة | ح 1 في 45 درجة مئوية | ح 16 | 80% بيفك إيجابي | |
| كاسباسي-4 | NALP1 أوفيريكسبريسيد | 250 نانوغرام/جيدا من صفيحة جيدا 6 | ح 48 | الإيجابية بيفك 30% |
| كاسباسي-5 | إيباف أوفيريكسبريسيد | 250 نانوغرام/جيدا من صفيحة جيدا 6 | ح 48 | 15% بيفك إيجابي |
الجدول 3: أمثلة على عناصر إيجابية للتكامل bimolecular fluorescence caspase (بيفك)- الظروف والنتائج المتوقعة وتستند على البيانات المنشورة باستخدام برو نيات 14،،من1718. ينبغي أن يكون transfected والبلازميدات المشترك أعرب جنبا إلى جنب مع البلازميدات بيفك (الخطوة 2.1.4)
الفيلم 1: 3D التعريب من الأسفار bimolecular caspase-2 التكامل (بيفك)- 3D التعمير، تدور حول y-محور الصور [كنفوكل] إلى z-طائرة هيلا الخلايا معربا عن مكونات caspase-2-بيفك ومراسل نووية فلورسنت تم علاج مع camptothecin (20 ميكرومتر) ح 16. ويبين الفيلم بيفك caspase-2 (الأخضر)، والنواة (أحمر). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيلم 2: الوقت الفاصل بين من الأسفار bimolecular caspase-2 التكامل (بيفك)- الخلايا جليوبلاستوما LN18 transfected مع مكونات بيفك caspase-2 وتعامل مع بورتيزوميب (15 نانومتر) تم تصويرها كل 2 دقيقة ح 8. ويبين الفيلم بيفك caspase-2 (الأخضر)، وفي الميتوكوندريا (أحمر). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويناقش هذا البروتوكول استخدام تقسيم البروتينات الفلورية لقياس caspase الناجمين عن قرب. واختير "فينوس تقسيم" لهذه التقنية لأنها مشرقة جداً، عالية فوتوستابل وريفولدينج هو سرعة 13. وهكذا، يمكن أن توفر تحليل فينوس ريفولدينج عند caspase الناجمين عن قرب قريبة من تقديرات caspase البروتين ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي. فينوس مقسمة إلى أجزاء متداخلة قليلاً اثنين، المحطة N من الأحماض الأمينية تتألف الزهرة (فينوس-N أو VN) 1-173، وتفتيت المحطة ج (فينوس-C أو الرأسمالي) تضم بقايا 155-239. البروتينات الفلورية الأخرى تقسيم موجودة ولكن بعضها، مثل تقسيم مشري، تتطلب الحضانة عند 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 حاء ريفولدينج 21. البروتينات الفلورية انقسام إضافية بما في ذلك تقسيم أزرق (نسخة بروتين الفلورسنت السماوي) وملومين الأحمر الآن انقسام لم يتم اختبارها في هذا السياق 13،22. في نهاية المطاف، إذا ثبت أن هذه البروتينات الفلورية مناسبة لقياس caspase الناجمين عن قرب، وهذا قد تسمح لتقييم caspases متعددة متزامنة.
عموما، هو تنصهر المنطقة (للمحترفين) برودومين كاسباسي إلى شظايا الانقسام الفلورسنت. هذه المنطقة تحتوي على الجزء الأدنى من كاسباسي المطلوبة لربط برنامج التنشيط ويشمل فكرة التفاعل بطاقة أو الدائرة. الفائدة من استخدام برودومين أنه لا يدخل أي النشاط الأنزيمي للخلايا. وهذا يسمح للرصد المتزامن لإحداث المصب بسبب كاسباسي الذاتية. وقد أظهرت الأبحاث حتى الآن فرق طفيف في حركية وتوطين caspase بيفك بين برودومين وال caspase كامل طول 14. ومع ذلك، بنيات كامل طول تميل إلى التعبير عن بكفاءة أقل، مما استلزم تعداء مبالغ متزايدة من بلازميد الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن التحور سيستين الحفاز لسيرين لمنع المستحثة caspase المبرمج عند التعبير. وعلى الرغم من هذه العيوب، قد تتطلب بعض التحقيقات التحليل المتزامن لأزواج بيفك طول كامل تحديد ما إذا كانت هناك اختلافات تعتمد على السياق في caspase الناجمين عن قرب في وجود أو عدم وجود مجالات الحفاز.
هذا البروتوكول تكييفها خصيصا لخلايا هيلا. البروتوكول نفسه يعمل بشكل جيد خطوط الخلايا ملتصقة إضافية بما في ذلك خط خلية سرطان ثديي MCF-7، خط الخلية جليوبلاستوما، LN18، والخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF). من المستحسن أن المستخدم يحسن ظروف الطلاء وتعداء عند تكييف هذا البروتوكول إلى نوع خلية جديدة. البروتوكول وصف هذين النهجين مجهرية الرئيسية التي يمكن استخدامها لتقييم الخلايا: ابيفلوريسسينسي والفحص المجهري [كنفوكل]. عند استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، يجب مطلي الخلايا على الزجاج كوفيرسليبس لأن غالبية الأهداف الفتحة العددية العالية التي يتم استخدامها بالاقتران مع الفحص المجهري [كنفوكل] سوف تخترق سمك الأطباق البلاستيكية أو الشرائح الزجاجية. ومن ثم، يوصي باستخدام الأطباق مع المضمنة رقم 1.5 الزجاج كوفيرسليبس أن يكون سمك ساترة الأمثل 0.17 ملم. تتوفر عدة أنواع مختلفة من هذه الأطباق التي تتراوح من الأطباق الفردية 3 سم، إلى شرائح الدائرة، إلى لوحات متعددة جيدا الحجم القياسي. الجداول 1 و 2 بيان كيفية التكيف مع الإرشادات والطلاء وتعداء لأحجام مختلفة تماما. ابيفلوريسسينسي والتصوير هو وصف هنا (4-1)، ألواح البلاستيك القياسية في مجال زراعة الأنسجة تكفي طالما المجهر مجهز بأهداف مسار طويل.
لأن فعالية هذا النهج "أضواء على" طريقة لقياس تفعيل caspase، إدراج مراسل الفلورسنت ضروري للسماح لتصور الخلايا قبل أو في غياب تفعيل caspase المراسل ولتحديد transfected الخلايا، عند استخدام تعداء عابرة. يمكن استخدام عدد من الصحفيين مختلفة والمعايير الوحيدة عند اختيار واحد: 1) فلوروفوري مشرق بما فيه الكفاية بحيث أنه يمكن كشفها بسهولة بالتصوير البروتوكول؛ و 2) في الطيف الفلورسنت لا تتداخل مع يفب. على سبيل المثال، لا يكون استخدام البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) كمراسل نظراً لأنه سيتم الكشف عن تصفية يفب أو الليزر المستخدمة للكشف عن كوكب الزهرة. هذا سبب التداخل الطيفي من فلوروفوريس اثنين. اختيار فلوروفوري التي يموضع إلى عضية محددة يمكن أن توفر معلومات نوعية إضافية. على سبيل المثال، استخدم بروتين أن أهداف الميتوكوندريا، مثل البروتين الأحمر نيون دسريد-ميتو، يمكن أن توفر معلومات إضافية عن السلامة العامة للخلية. الميتوكوندريا تميل إلى الخضوع لتجزئة (الأنشطار) خلال المراحل المبكرة من الخلية وفاة 23 وهذا يمكن تصور مع مراسل مثل دسريد-ميتو. يمكن أن تسمح باستخدام علامة عضية كمراسل أيضا استنتاجات حول التعريب سوبسيلولار من caspase بيفك بذل.
وهناك عدد من الطرق التي يمكن اكتسبت caspase بيفك البيانات وتحليلها. تحديد الطريقة التي يجب استخدامها سوف تحدده المعلمات إلى استكشاف (نقطة النهاية التحليل السكاني مقابل المعلومات الموضعية أو الحركية خلية مفردة) وتوافر الأجهزة وبرامج التصوير. ويحدد هذا البروتوكول بعض النهج المستندة إلى مجهر لجمع نتائج caspase بيفك التجربة لاكتساب النقاط مرة واحدة والوقت الفاصل بين البيانات. بيد أنه ينبغي ملاحظة أن عددا من الاختلافات ومزيج من هذه الطرق لاستخدامها بشكل خلاق استجواب سبل تفعيل caspase.
نقطة مرة واحدة الحصول على البيانات (4.1) يتم استخدامه لتحديد النسبة المئوية للخلايا مع caspase الناجمين عن قرب في نقطة مرة واحدة. لهذا البروتوكول، واحدة ببساطة بحساب عدد transfected الخلايا التي هي الزهرة الإيجابية. وهكذا، ليس مطلوباً معدات متخصصة للغاية وإلا أبسط مجهر ابيفلوريسسينسي بالتجارة والنقل (أو يفب) وهناك حاجة إلى تصفية طلبات تقديم العروض وعداد حصيلة يد. يمكن بعض نظم التصوير الآلي باتخاذ عدد من الصور تلقائياً كل من صفيحة جيدا. في حالة توفر مثل هذه الأجهزة، الخلايا الموجودة في الصور المكتسبة يمكن أن تحسب المثل بالفحص البصري، أو كوانتيتاتيد باستخدام برامج التصوير. تصوير ثلاثي الأبعاد (4.2) يوفر صوراً عالية الدقة ل caspase بيفك في جميع أنحاء الطائرات التنسيق من الخلية. مجهر [كنفوكل] مع أشعة الليزر التي تثير فينوس وطلب تقديم العروض (أو المراسل تعداء المختارة) وقدرات Z-المكدس المطلوب. يتوفر عدد من وحدات البرامج عرض ثلاثي الأبعاد التي توفر طرقاً مختلفة لتصور البيانات. لكل هذه الأنواع من التحليل، فمن الممكن لإصلاح الخلايا والصورة أو تقييمها في مرحلة لاحقة. ومع ذلك، عملية التثبيت يقلل إشارة فينوس، التي يمكن أن تضيف النتائج الملموسة للتحليل ولذلك لا يوصي بهذا النهج. الوقت الفاصل بين التصوير (4.3) يمكن استخدامها لتقديم تحليل الحركية والموضعية المتزامنة ل caspase بيفك. يمكن إعداد مجهر مجهزة بمرحلة يجهز لالتقاط صور لمواقع متعددة وحتى مقارنة مجموعات معاملة مختلفة في نفس التجربة.
لمرور الزمن، على عدد من الاعتبارات الإضافية يجب أن تؤخذ في الاعتبار. يمكن أن يسبب ضوء الليزر التحف بسبب الضيائية أو فوتوبليتشينج وكلاهما بحاجة إلى أن تسيطر على. وبصفة عامة، على حد سواء يمكن تجنبها باستخدام أقل قدر ممكن من الضوء (مرات التعرض القصير وقوة الليزر إدخال النسبة المئوية المنخفضة في خطوات 4.3.6-4.3.7). نتائج لالضيائيه عند ضوء الليزر يؤدي إلى موت في الخلايا ويمكن التحكم للتصوير الخلايا غير المعالجة بنفس الشروط ويؤكد أن انقسام الخلية العائدات كالمعتاد. فوتوبليتشينج يحدث عندما ينخفض الصور المتعددة التي اتخذت من نفس الخلية الأسفار. بروتين فلوري فينوس فوتوستابل تماما، حتى هذا نادراً ما يمثل مشكلة في الممارسة العملية. يمكن تحديد آثار فوتوبليتشينج بأخذ عدة صور متسلسلة خلية فينوس الإيجابية، وضمان أن الأسفار لا تزال مستقرة. وهذا يحتاج فقط إلى أن يتم مرة واحدة، طالما يتم استخدام نفس إعدادات الطاقة والتعرض لليزر لكل تجربة. يمكن أيضا تخفيف الآثار الناجمة عن الضيائية أو فوتوبليتشينج بتخفيض العدد الإجمالي للصور التي تم التقاطها. وهذا يمكن أن يتحقق بإطالة أو تقصير مدة الفاصل الزمني بين يلتقط (الخطوة 4.3.9). استخدام الفواصل 5-10 دقيقة على مر الوقت الفاصل بين 16 ح مكان جيد للبدء. إذا كان يتم ملاحظة لا فوتوكسيسيتي أو مطلوبة من التجارب لمدة أقصر، يمكن تقليل الفاصل الزمني بين الإطارات. إذا كان تفعيل caspase السريع، يمكن استخدام التجارب أقصر مع فترات زمنية أقصر. على سبيل المثال، لتجربة ح 16 مع فترات 10 دقيقة، ستتخذ مجموعة صور 192 (96 لكل fluorophore). سوف تسفر عن تجربة ح 2 مع فواصل 1.5 م الصور 160. ولذلك، التجارب الطويلة والقصيرة كل سوف تعرض الخلايا للمبالغ الإجمالية مماثلة لضوء الليزر. لتجارب قصيرة المدة يمكن إضافة caspase تنشيط الحافز مباشرة إلى وسائل الإعلام فورا قبل البدء بالاستيلاء على مرور الزمن (بعد الخطوة 4.3.11 بدلاً من الخطوة 3). للقيام بذلك، إزالة الغطاء من اللوحة وإسقاط بلطف في محلول يحتوي على التحفيز باستخدام ماصة. الحرص على عدم تصدم اللوحة والتحقق بسرعة أن الخلايا لا تزال في التركيز قبل المتابعة.
عند القيام بتجارب الزمن الفاصل، من المهم أيضا للتأكد من البيئة المباشرة للخلايا يشبه من حاضنة زراعة الأنسجة. تتوفر عدد من الضوابط البيئية على مجموعة مختلفة من المجهر ups. وتشمل هذه المرحلة أصغر حاضنات أعلى، فضلا عن الدوائر البيئية التي تغلف المجهر كامل. كل من هذه الأجهزة عادة توفير الحرارة وأول أكسيد الكربون2، والرطوبة إلى الدائرة بطريقة يمكن التحكم بدقة. مراقبة دقيقة CO2 ودرجة الحرارة أمر ضروري لنجاح التجربة لأن درجة الحرارة غير متوقعة يمكن أن تؤدي التقلبات إلى الانجراف التنسيق وغياب CO2 يؤدي الرقم الهيدروجيني لوسائط الإعلام في الارتفاع التي يمكن أن تكون سامة للخلايا. إذا لم يتوفر مصدر2 CO، يمكن مخزنة وسائط الإعلام بإضافة حبيس (راجع الخطوة 3.1.1). حتى إذا كان مصدر2 CO متوفراً، من المستحسن أن تدرج حبيس في الأجلين المتوسط والتصوير كتدبير إضافي للحفاظ على صحة الخلايا. ومع ذلك، حتى بحضور حبيس، نظراً لغياب CO2 لفترات طويلة من الزمن يمكن أن يسبب موت الخلايا. ولذلك، من المهم فحص الخلايا غير المعالجة، وتصويرها تحت نفس الظروف، واللون من وسائل الإعلام في ختام هذه التجربة التأكد من أن درجة الحموضة ظلت مستقرة. ملاحظة أن الفينول الحمراء لا تحتاج إلى حذف أي من الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول نظراً لمساهمة أوتوفلوريسسينسي إلى إشارة الزهرة الحد الأدنى.
وهناك عدد من الأساليب المتاحة لتحليل البيانات التصوير الناتجة عن تجربة انقضاء وقت. قياس متوسط كثافة البكسل فينوس في الخلية transfected هو الطريقة الأكثر مباشرة لتحليل توقيت caspase الناجمين عن قرب. كما هو موضح في الشكل 3، الشكل 4، الرقم 5، غالباً ما يظهر بيفك caspase-2 كواحد أو أكثر من بونكتا الموجودة في الأقسام المختلفة سوبسيلولار. التصوير تحليل النهج أن أرقام قياس البؤر أو حجم الكائن، أو عوامل مماثلة إضافية يمكن أن تسفر عن بيانات كمية غنية بالمعلومات عن هذه الهياكل. ليس كل كاسباسي بيفك يظهر بونكتا. على سبيل المثال، أظهرت caspases التحريضية الزخرفة بيفك مختلفة بما في ذلك الأسفار منتشر وهياكل الخيطية بونكتا مفرد أو متعدد في الخلية 18. هذه الأنماط كانت تعتمد على caspase المنشط فضلا عن إشارات تفعيل المنبع. ولذلك، إلى حد كبير تملي نوع التحليل الذي الأكثر ملاءمة للحصول على النتائج الوقت الفاصل بين حسب نوع الزخرفة الفلورسنت التي تم ملاحظتها.
وكثير من المحفزات المعاملة التي يتم تقييمها عند استخدام هذا البروتوكول سوف يحفز المبرمج أما مباشرة عن طريق caspase تحليلها أو غير مباشر بإشراك طريقا الإعدام مختلفة خلية. وهذا يتسبب في الخلايا إلى تقليص وفصل من اللوحة، مما يجعل من الصعب جداً صورة الخلايا ويكاد يكون من المستحيل تحديد أي التعريب محددة من caspase-بيفك. سيتم منع إدراج مثبط caspase عموم هذا موت الخلية. توظيف كاسباسيس لبرامجهم التنشيط و caspase المرتبطة بيفك لا يتوقف على نشاط الحفاز كاسباسي. ولذلك، تثبيط كاسباسي لن يكون له تأثير على هذه الخطوة، ولكن سوف تمنع المصب الخصائص الفيزيائية للمبرمج بما في ذلك بلبينغ، ومفرزة، والخسارة في نهاية المطاف في سلامة غشاء البلازما. وهكذا، إذا كان القيام بتحليل نقطة النهاية (الخطوة 4.1) أو مداخن Z (الخطوة 4.2)، إدراج مثبط caspase أمر أساسي. لأن الوقت الفاصل بين إجراء تجارب على النقيض من ذلك، إذا كانت الأحداث المتصلة بالمبرمج مثل الموقع أو أنيكسين الخامس ملزمة (للكشف عن الفوسفاتيديل سيرين التعرض) أو امتصاص يوديد propidium (للكشف عن غشاء البلازما permeabilization) يتم تحليلها إلى جانب caspase بيفك، يجب حذف caspase مثبط للحيلولة دون إعاقة من هذه الأحداث. مثبط كاسباسي مثل قفد-أف (10-20 ميكرومتر) تضاف إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على الحافز الذي يحفز المبرمج (الخطوة 3.1.1). إذا كان المشترك معربا عن بروتين برو-أبوبتوتيك مع مكونات بيفك caspase، يضاف مثبط caspase في خطوة 2-1-12.
بينما caspase بيفك هو واحد من الأساليب المتاحة القليلة التي يمكن استخدامها لتصور الأحداث في سبل تفعيل caspase في الخلايا الحية، عددا من الاعتبارات يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم هذه التجارب. نظراً لأن هذا النهج يستند إلى أوفيريكسبريشن، تكون عناصر تحكم لخصوصية هامة. يمكن إنجاز ذلك بإحدى طريقتين. أولاً، يجب تقليل إدخال الطفرات في بطاقة أو الدائرة من كاسباسي برودوماين بأنها تعطل الربط بين كاسباسي ونظامها الأساسي لتفعيل كثافة caspase بيفك والنسبة المئوية للايجابية فينوس الخلايا. على سبيل المثال، طفرة بقايا D59 إلى ه في برودومين caspase-1 يعطل ملزمة للبروتين محول ASC (المرتبطة بالمبرمج بقعة تشبه البروتين الذي يحتوي على بطاقة) وعلى قدم المساواة يعطل المستحثة ASC caspase-1 بيفك 18،24 . وثانيا، ستنخفض استخدام الخلايا التي تعاني من نقص في البروتينات محول التي تجند caspase إلى منصة التنشيط محددة بيفك إشارات. وهذا يمكن أن يتحقق باستخدام خلايا خروج المغلوب، إذا كانت متوفرة، أو باستخدام siRNA أو كريسبر/Cas9-تعتمد النهج إلى استنزاف خلايا المحول. وبناء على ذلك، نضوب البروتين محول caspase-2 ريد سدت تماما بيفك caspase-2 الناجمة عن صدمة الحرارة أو الحمض النووي الضرر 14،17. لهذه التجارب، وخروج المغلوب أو خلايا ضربة قاضية وينبغي مقارنة مع الخلايا المتطابقة التحكم (أي نوع البرية المطابقة القمامة MEF أو مراقبة ضربة قاضية الخلايا)، وإذا تم استخدام خط خلية جديدة، ينبغي تقييم ظروف تعداء الأمثل لضمان المساواة التعبير عن مراسل بيفك عبر خطوط الخلايا.
القيد ثاني من هذا النهج هو أنه عند استخدام تعداء عابرة، من الصعب للتأكد من أن كل خلية يتم التعبير عن كميات متساوية من كل من البروتين. إذا كان التعبير غير المتكافئة، ويمكن تعيين واحد فينوس يفتت إلى المنصة في ترددات أعلى. هذا يمكن أن تحجب إشارة الفلورية الكاملة وتؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. للتغلب على هذه المشكلة، هو إصدار جديد من مراسل بيفك caspase لتوليد خط الخلية مستقرة المبلغ عنها مؤخرا 17. هذا الإصدار الجديد تتكون من تركيبة أعرب عن مكونات C2 برو-بيفك في إطار قراءة مفتوحة واحدة مفصولة بواسطة الببتيد كليفينج الذاتي 2A الفيروسية 25. ولذلك، نسخها مرناً واحد من المروج نفس المكونات بيفك لكن ترجمتها إلى إنتاج كميات متساوية ستويتشيوميتريكالي من البروتينات الانصهار الرأسمالي و VN. خطوط الخلايا المتولدة على ستابلي التعبير عن هذا البناء أظهرت اتجاهات مماثلة للتنشيط للصحفيين أعرب عابر لكن كانت أكثر حساسية والمعروض أقل الأسفار الخلفية. وهكذا، يمكن تبسيط البروتوكول أعلاه إلى حد كبير إذا كان استخدامها بالاقتران مع خطوط الخلايا مراسل ستابلي تعبر عن مكونات بيفك caspase.
وتوحي البيانات حتى الآن الحد الأدنى من التدخل بين مكونات بيفك caspase والبروتينات الذاتية. على سبيل المثال، من المعروف أن caspase-2 بيفك المنشط المنبع للموقع ولكن caspase-2 لم يعرقل التقدم للموقع 14. وهكذا، لا تظهر هذه الصحفيين التصرف بطريقة سلبية مهيمنة. ومع ذلك، إذا كان في نفس الوقت تقييم الأحداث المصب، هذا ينبغي التحقيق داخل كل مجموعة من التجارب. بما في ذلك عنصر تحكم غير transfected جيدا في هذه التجربة هو أفضل طريقة لهذا النهج. إذا لم تتغير مع أو بدون التعبير عن استشعار caspase الحركية موت الخلية، سوف يشير هذا إلى أن المكونات caspase-بيفك لا تتداخل مع وظيفة الذاتية. على العكس من ذلك، كاسباسي الذاتية يمكن ربما تؤثر على قراءات بيفك، في كفاءتها أو في حجم أو شكل الهياكل. سوف تحكم الإعراب عن المراسل في الخلايا ناقصة كاسباسي لهذا.
وعلى الرغم من هذه القيود، هو caspase بيفك الأسلوب أسلوباً مفيداً استجواب caspase تنشيط المسارات التي يمكن أن تكمل وتحسن حتى في النهج القائمة قياس تفعيل caspase البادئ. بقياس قرب المستحث، الخطوة الأولى في عملية التنشيط، وهذا الأسلوب يتغلب على المشاكل المرتبطة بقياس خطوات لاحقة مثل تجهيز السيارات caspase المرتبطة بالتنشيط. على سبيل المثال، أثناء استخدام لطخة غربية لرصد انقسام كاسباسيس الجلاد، caspase-3 و caspase-7، يوفر مقياس دقيق لتفعيل 2، باستخدام نفس النهج للبادئ كاسباسيس يمكن أن تكون معيبة. هذا سبب الانقسام من البادئ caspases، ليست كافية لتفعيل 4،،من2627. وفي الواقع، هي المشقوق العديد من البادئ caspases أثناء [ابوبتوسس] طريق caspase-3 دون إنتاج الإنزيمات النشطة 28. وبالمثل، تقنيات استناداً إلى استخدام الببتيد ركائز مصممة كأهداف ل caspases محددة تحتاج إلى تأخذ في الاعتبار خصوصيات هذه التسلسلات caspases 29المتداخلة. وهذا لا يعني أن مثل هذا النهج لا يمكن استخدامه لقياس تفعيل caspase، ولكن ينبغي الاعتراف العيوب عند تفسير النتائج. بيفك Caspase يوفر نهج بديلة التي يمكن أن تساعد في التأكد من النتائج باستخدام الأساليب التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، هو القدرة على تتبع الجمعية العامة المجمعات تفعيل caspase في الوقت الحقيقي ووضوح تحديد حجم وشكل والتعريب من المجمعات ميزة كبيرة لهذا الأسلوب لا يمكن تقييم بواسطة وسائل أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونود أن نعترف بجميع الأعضاء السابقة المختبر بوشير-هايز الذين ساهموا في تطوير هذه التقنية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة الطيار طب الأطفال مستشفى تكساس للأطفال إلى LBH. ونحن نشكر شاندرا جويا (MD أندرسون، هيوستن، تكساس) للحصول على إذن تشمل البيانات التي نشرت بالتعاون مع فريق لها. تطوير الكواشف ووصف أيده الخلوي والخلية الأساسية الفرز في "كلية بايلور للطب" بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (نييد P30AI036211، NCI P30CA125123، ونكرر S10RR024574) ومساعدة جويل م. سيديرستروم
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J.
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S.
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M.
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
