Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/57316
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

Abstract

משפחת קספאז של פרוטאזות ממלאים תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות. בין אלה, קבוצת משנה המכונה יוזם caspases הם הראשונים להיות מופעל בתוך המסלולים הללו. קבוצה זו כוללת קספאז-2-8, ו-9, וכן את caspases דלקתיות, קספאז-1, ארבע, ו-5. Caspases המאתחל כולם מופעלים על ידי dimerization בעקבות גיוס קומפלקסים multiprotein ספציפי שנקרא הפעלת פלטפורמות. קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) היא גישה מבוססת הדמיה איפה לפצל חלבונים פלורסנט דבוקה יוזם caspases משמשים כדי להמחיש את גיוס יוזם caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, וכתוצאה מכך הקרבה המושרה. קרינה פלואורסצנטית הזה מספק את הבדיקה של אחד השלבים המוקדמים הנדרשים להפעלת קספאז יוזם. שימוש במספר גישות שונות מבוסס מיקרוסקופיה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים כמותיים על היעילות של קספאז הפעלה ברמת האוכלוסייה, כמו גם את קינטיקה של קספאז ההפעלה ואת גודל מספר קספאז מפעיל מתחמי על בסיס לכל תא.

Introduction

משפחת פרוטאז קספאז ידועים שלהם תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות 1. בשל חשיבותם, קביעה מתי, היכן, באיזו מידת יעילות caspases ספציפי מופעלים יכול לספק תובנות מנגנוני קספאז מכריע הפעלה מסלולים. פרוטוקול מבוסס הדמיה המתוארים כאן מאפשר את החזיית בשלבים המוקדמים קספאז הפעלת המפל. טכניקה זו לוקח את היתרונות של אינטראקציות חלבון דינמי: הפעלת קספאז באותו כונן.

Caspases ניתן לחלק לשתי קבוצות: caspases המאתחל (קספאז-1,-2,-4,-5, -8,-9,-10 ו-12), את caspases התליין (קספאז-3,-6 ו-7). Caspases התליין נמצאים בתא כמו הדימרים preformed, מופעלים על-ידי פצילות בין יחידת משנה קטנים וגדולים 2. כשהוא מופעל, הם קליב חלבונים מבניים ותקינה רבים וכתוצאה מכך אפופטוזיס 3. Caspases המאתחל הן caspases הראשונה תופעל ב מסלול, בדרך כלל להפעיל את ההפעלה של caspases התליין. בניגוד caspases התליין, יוזם caspases מופעלים על ידי 4,dimerization5. Dimerization הזה הוא הקל על ידי גיוס של מונומרים לא פעיל כדי מתחמי משקל מולקולרי גדול ספציפי ידוע as פלטפורמות הפעלה. הרכבה של פלטפורמות הפעלה נשלטת על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון: חלבון ספציפי. אלה מתווכת על ידי מוטיבים אינטראקציית חלבון שנשמרת נוכח proform של קספאז המאתחל, כוללים את תחום המוות (DD), תחום אפקטור מוות (DED) קספאז גיוס לתחום (כרטיס) 6 (איור 1 א'). פלטפורמות הפעלה כוללים בדרך כלל חלבון קולטן וחלבון של מתאם. הקולטן מופעל בדרך כלל בעת איגוד של ליגנד, וגורם לשינוי הסתגלותי המאפשר oligomerization של מולקולות רבות. הקולטן ואז גם מגייס את קספאז ישירות או מולקולות מתאם בתורו להביא את קספאז המתחם. לפיכך, מולקולות קספאז רבים להיכנס בסמיכות המתיר dimerization. זה נקרא את המודל של קרבה המושרה 7. ברגע dimerized, קספאז עובר עיבוד אוטומטי, אשר משמש כדי לייצב את האנזים פעיל 4,8. לדוגמה, הרכבה של apoptosome Apaf1 המופעלת על-ידי ציטוכרום c בעקבות השקתו של המיטוכונדריה בתהליך הקרוי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי permeabilization (MOMP). Apaf1 מגייס בתורו קספאז-9 על-ידי אינטראקציה זה מתווך על ידי כרטיס נוכחות שני חלבונים 9. אינטראקציות חלבון דומה לגרום ההרכבה של CD95 המוות גרימת איתות מורכבים (דיסק) שמוביל הפעלה קספאז-8; PIDDosome, אשר ניתן להפעיל קספאז-2; מתחמי inflammasome שונים כי ליזום הפעלה קספאז-1 10,11,12. לפיכך, יוזם caspases מגויסים כדי פלטפורמות הפעלה ספציפית ע י מנגנון משותף וכתוצאה מכך מושרה הקרבה, dimerization, אשר בלעדיו לא יתרחש הפעלה.

קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) הוא assay מבוססת הדמיה שפותחה כדי למדוד את זה הצעד הראשון בהפעלת caspases היוזם, ומאפשר פריט חזותי ישיר של הגיינה קספאז הנגרמת בעקבות הפעלת פלטפורמה הרכבה. שיטה זו מנצלת המאפיינים של החלבון הניאון פיצול ונוס. ונוס היא של יותר ויותר בהיר יותר photostable גירסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי ניתן להפריד לשני מקטעים שאינם-פלורסנט, מעט חופפים: N-הסופית של נוגה (ונוס N או VN) ו- C-הסופית של נוגה (ונוס C או VC). קטעים אלה שומרים על היכולת לקפל ולהפוך פלורסנט כאשר אתה נמצא בסמיכות 13. כל שבר ונוס היא דבוקה prodomain של קספאז, המהווה החלק מינימלי של קספאז המאגד פלטפורמת הפעלה. פעולה זו מבטיחה כי caspases אינם שומרים על פעילות אנזימטיות, לכן ניתוח בו-זמניות של הזרם באירועים המשויכים אירועים אנדוגני הוא אפשרי. . ונוס קטעים לקפל כאשר prodomains קספאז גייסו פלטפורמת הפעלה ומבצעת קרבה המושרה. (איור 1B). קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך ונוס ניתן לעקוב במדויק, במיוחד ההתאמה subcellular, קינטיקה של, ואת היעילות של הרכבה של יוזם קספאז פלטפורמות הפעלה של תאים בודדים. הדמיה נתונים ניתן לרכוש על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ, ניתן להתאים מספר גישות מיקרוסקופיה שונים כולל: הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר קספאז הפעלה בזמן אמת; הדמיה ברזולוציה גבוהה עבור מדויק ועיונם לוקליזציה subcellular; נקודת הקצה כימות של היעילות של ההפעלה.

שיטה זו פותחה לראשונה כדי לחקור את ההפעלה של קספאז-214. בעוד הפלטפורמה הפעלה קספאז-2 נחשב להיות PIDDosome, המורכב של הקולטן PIDD (חלבון p53-induced עם תחום המוות), את מתאם RAIDD (RIP-הקשורים ICH-1/CAD-3 הומולוגי חלבון עם תחום המוות), דווח PIDDosome תלויית הפעלה קספאז-2. הדבר מצביע על כי פלטפורמות הפעלה נוספים קספאז-2 קיימים 15,16. למרות הידיעה הרכיבים המלאה של פלטפורמת הפעלה קספאז-2, אפשרה קספאז טכניקה BiFC לחקירה מוצלחת של המסלולים איתות קספאז-2 של ה ברמה המולקולרית 14,17. אנחנו גם בהצלחה הסתגלו פרוטוקול זה עבור caspases דלקתיות (קספאז-1, ארבע,-5 ו-12) 18 , בעקרון, אותה גישה צריך להספיק באופן דומה לנתח את כל caspases יוזם הנותרים. פרוטוקול זה דומה יכול להיות מותאם כדי לחקור את המסלולים אחרות היו dimerization הוא אות הפעלת מרכזי. לדוגמה, חלבונים STAT מופעלים על ידי dimerization בעקבות זרחון יאנוס קינאז (JAK) 19. לפיכך, מערכת BiFC יכול לשמש כדי להמחיש הפעלת STAT, כמו גם משעולים רבים אחרים מוסדר על ידי אינטראקציות חלבון דינמי. פרוטוקול הבאים מספק הוראות מפורטות על כניסתה של הכתבים לתוך תאים, כמו גם שיטות עבור ייבוא תמונות וניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת התאים ומנות תרבות

הערה: בצע את שלבים 1-3 בשכונה זרימה שכבתית תרביות רקמה. ללבוש כפפות.

  1. אם באמצעות כלי הזכוכית התחתונה, מעיל הזכוכית עם fibronectin. לדלג על שלב 1.2 אם משתמש מנות פלסטיק.
    1. להפוך את פתרון 0.1 מ"ג/מ"ל של fibronectin: למהול 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל fibronectin פתרון 9 מ ל 1 X PBS.
    2. מכסים קרקעית זכוכית בכל טוב עם 0.5-1 מ ל fibronectin דגירה למשך 1-5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. באמצעות פיפטה של, לאסוף את הפתרון fibronectin ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: הפתרון fibronectin חוזר מספר פעמים.
    4. לשטוף את הכוס פעם אחת עם 1-2 מ ל 1 X PBS, וארוקן את PBS.
  2. צלחת עונה 1 פרק 105 תאים לכל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של התא המתאים תרבות המדיה (ראה טבלה 1 עבור מספרי הטלפון הנייד לשימוש עבור בארות בגדלים שונים). אם משתמש קו תא stably שיבטא את הרכיבים BiFC קספאז (ראה דיון), צלחת 2 x 105 תאים והמשך לשלב טיפול (שלב 3).
  3. אפשר לדבוק המנה בין לילה ב 37 ° C בחממה תרביות רקמה תאים.

2. תקנים של תאים כדי להציג את הרכיבים BiFC קספאז

  1. Transfect תאים עם תרביות תאים המתאימים הכימית.
    הערה: פרוטוקול זה מתווה את ההוראות עבור Lipofectamine 2000, אשר הותאם מבחינת רעילות מינימלית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה הלה תאים, התאים MCF7, תאים LN18. אם משתמשים נוספים תרביות תאים ריאגנטים בצע הוראות היצרן ולמטב כנדרש.
    1. להוסיף µL 12 מהתרכובת תרביות תאים µL 750 של התקשורת מופחת סרום צינור סטרילי.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. להוסיף 10 ng של פלסמיד כתב (פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי, למשל אדום חלבון פלואורסצנטי [RFP], זה יהיה תווית התאים transfected) לרכבת התחתית mL 1.5 סטרילי עבור כל טוב להיות transfected.
    4. הוסף 20 ng של כל פלסמיד BiFC קספאז (למשל, 20 ng של קספאז-2 prodomain [C2 Pro]-VC ו- 20 ng של C2 Pro-VN) כדי כל שפופרת (טבלה 2).
    5. להביא כל שפופרת עד הנפח הכולל של 100 µL על-ידי הוספת מדיה מופחת סרום.
    6. בעזרת פיפטה p200, להוסיף 100 µL של תרביות תאים ריאגנט פתרון משלב 2.1.2 לתערובת פלסמיד באופן dropwise.
    7. דגירה המיקס ריאגנט פלסמיד-תקנים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה p1000, פיפטה 800 µL מדיה פנויה סרום בעדינות במורד הצד של הבאר.
    9. באמצעות פיפטה p200, להוסיף 200 µL של המתחם הדי-השומנים dropwise כל טוב.
    10. דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    11. מטפל לא לשבש את טפט, להסיר את התקשורת החופשית סרום המכיל את מתחמי ה-DNA-השומנים על ידי השאיפה באמצעות שאיבה או עם פיפטה.
    12. פיפטה 2 מיליליטר ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) מדיה צמיחה מלאה בעדינות במורד הצד של כל טוב.
  2. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה במשך 24-48 שעות עבור ביטוי חלבון אופטימלי.

3. אינדוקציה של קספאז הפעלת

  1. לטפל עם תרופות או גירוי שגורם קספאז הפעלה כ 24 פוסט-תקנים h.
    1. הוסף הריכוז הרצויה של הסם מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) הדמיה מדיה (מדיה צמיחה מלאה בתוספת Hepes [20 מ מ, pH 7.2-7.5] ומרקפטואתנול [מיקרומטר 55]), לערבב בעדינות (טבלה 3).
    2. תשאף התקשורת מן התאים באמצעות פיפטה או עם יניקה, לאחר מכן, באמצעות פיפטה של, פיפטה 2 מ"ל של הפתרון של 3.1.1 בעדינות במורד הצד של הבאר.
    3. הוסף מדיה הדמיה ללא התרופה באר אחת כפקד של לא מטופל.
  2. דגירה התאים חממה תרביות רקמה ב 37 ° C או להמשיך 4.3 שלב עבור ניסוי זמן לשגות.

4. BiFC קספאז קירור והקפאה

  1. BiFC קספאז עבור רכישת נקודת זמן יחיד
    1. הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור אור פלורסנט ההוראות של היצרן.
    2. למצוא את התאים תחת מסנן RFP ו להתמקד פלורסצנטיות ג'ין הכתב.
    3. באמצעות מונה יד-טלי, לספור את כל התאים RFP-חיוביות בשדה הראייה. להקליט את המספר.
    4. תוך שמירה על visual באותו השדה, להחליף מסנן GFP (או מסנן YFP אם הוא זמין), באמצעות מונה יד-טלי, לספור את מספר כדוריות אדומות שהם גם ירוק (ונוס-חיוביים). מעבר הלוך ושוב בין שני מסננים כדי לוודא כי רק כדוריות אדומות מחושבת עבור ונוס-חיוביות. להקליט את המספר (איור 3).
    5. ספירת לפחות 100 תאים RFP-חיוביות מכל שלושה תחומים נפרדים של הצלחת.
    6. בכל אזור, לחשב את אחוז ונוס-חיוביות transfected תאים (קרי אדום תאים שהם גם ירוק). ממוצע האחוזים המתקבלת כדי לקבל את סטיית התקן.
  2. הדמיה תלת-ממדית של קספאז BiFC
    1. הפעל המיקרוסקופ ההוראות של היצרן ולאחר ההשקה רכישת התוכנה.
    2. בחר את x 60 או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה
    3. המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.
    4. באמצעות מקור אור epifluorescence ואת היצירה עין המיקרוסקופ או לייזרים קונאפוקלית או מסך המחשב, נווט אל שדה עניין.
    5. מתמקדים קרינה פלואורסצנטית הכתב באמצעות לייזר RFP או המסנן.
    6. אם epifluorescence שימש עד לנקודה זו, מקור האור לעבור לייזרים קונאפוקלית והמחש תמונה חיה של התאים שנרכשו על ידי המצלמה, המוצג על ידי רכישת תוכנת על מסך המחשב.
    7. באמצעות הפקד ג'ויסטיק ואת הגלגל המוקד, לכוונן את המוקד והמיקום התאים כך התאים נמצאים במרכז התצוגה מהבורר. בחר תאים מופרדים אחד מהשני, לא חופפות.
    8. קלט את עוצמת הלייזר אחוז כדי 50% וזמן החשיפה ב-100 מילישניות עבור ונוס ו- RFP כנקודת התחלה כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות לשימוש עבור הניסוי.
    9. להפעיל את לכידת חיות ולבדוק את התמונה המתקבלת, היסטוגרמות התצוגה המלווה את שני הערוצים.
    10. אם האות הוא נמוך, התמונה היא קשה להתמזמז להגדיל אחוזי לייזר הזמן כוח ו/או חשיפה בתוספות עד האות בתמונה נראה טוב.
    11. ודא כי האות לא מגיעים לרוויה. לבדוק את ההיסטוגרמה התצוגה כדי לוודא לשיא ברורים לעין כל עבור חיל הים. אם הפסגה מקיפה את הצגת היסטוגרמה כולו, קלט נמוך לייזר כוח החשיפה והגדרות (איור 2).
    12. דמיינו תאים שליטה (ללא טיפול או שאינם transfected) תחת באותם תנאים כדי להבטיח האות ספציפיים.
      הערה: transfectants צבע אחד יכול לשמש גם כדי לשלוט מוצלב, אך אם הסימנים במרחב נפרדות (למשל מיטוכונדריאלי לעומת cytosolic) זה לא נחוץ.
    13. בחר או לפתוח את המודול מחסנית Z בתוכנה מיקרוסקופ.
    14. באמצעות הידית המוקד, להעריך את מיקום מוקד התואם למרכז של התא.
    15. התאם את המוקד בכיוון אחד עד התא אינה גלויה, בחר באפשרות זו כמו המיקום העליון.
    16. התאם את המוקד בכיוון ההפוך עד התא הוא שוב אינו גלוי, בחר באפשרות זו גם מיקום התחתון.
    17. לבחור את גודל הצעד אופטימלית (בדרך כלל כ- 20 מיקרומטר) ולהתחיל הרכישה על מנת להנחות את המצלמה לקחת באופן אוטומטי תמונה אחת בכל אחד מהערוצים בכל אחד מהשלבים מיקרומטר 20 בין המיקומים העליונים והתחתונים.
    18. השתמש בתוכנת עיבוד תלת-ממד כדי לשחזר את התמונה תלת-ממד (איור 4סרט 1).
  3. הדמיה בצילום מואץ של קספאז BiFC
    1. לפחות שעה לפני הניסוי, הפעלת המיקרוסקופ והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס.
    2. בחר 40 x, 60 x או המטרה שמן x 63 ומניחים טיפת שמן על המטרה.
    3. המקום המנה תרבות על הבמה מיקרוסקופ באמצעות בעל לוחית הנכון.
    4. אם מקור2 CO זמין, למקם התקן משלוח של2 CO (בדרך כלל פלקסיגלס מכסה מחובר הצינור המעביר את CO2) על גבי לוחית. הגדר CO2 רמת 5% והפעל את בקר2 CO מ בתוך התוכנה. אם מקור2 CO אינה זמינה, לכלול 20 מ מ Hepes להעברה למאגר המדיה.
    5. נווט אל שדה של תאים transfected והמחש תמונה חיה של התאים על ידי המצלמה, המוצג על-ידי רכישת התוכנה על גבי מסך המחשב באמצעות הלייזר RFP.
    6. בעקבות צעדים 4.2.8-4.2.12, קלט את ההגדרות עבור אחוז לייזר זמן כוח וחשיפה הלייזר RFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך עדיין היכולת לזהות את האות פלורסנט.
    7. באמצעות פקד חיובי לטעום (ראו טבלה 3 לקבלת דוגמאות), עקוב אחר השלבים 4.2.8-4.2.12 קלט את ההגדרות בפעם אחוז לייזר כוח וחשיפה אור הלייזר YFP. לשמור ערכים אלה נמוך ככל האפשר תוך שהם עדיין יוכלו לזהות אות ונוס.
    8. כל טוב של הצלחת, בחר במספר תפקידים שונים המכילים תא אחד או יותר לבטא את הכתב.
    9. קלט את מרווח הזמן בין כל מסגרת של זמן לשגות, הכולל מספר מסגרות שיש לנקוט. ודא זמן לרכוש כל המיקומים שנבחרו לפני המסגרת הבאה היא שיש לנקוט.
    10. ביקור חוזר לכל תפקיד, לתקן ולעדכן את המוקד לפי הצורך.
    11. לתיקון להיסחף מוקד יכול לנבוע שינויי טמפרטורה או ויברציות חיצוני, להפעיל את המוקד להיסחף תיקון מערכת (אם זמין).
    12. להתחיל מואץ ולשמור את הנתונים.
    13. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות הדמיה זמינים (איור 52 סרט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמה של קספאז-2 BiFC הנגרם על ידי נזק לדנ א מוצג באיור3. Camptothecin, טופואיזומראז אני מעכב, שימש לזירוז ההפעלה נזק וקספאז-2 ה-DNA. MCherry חלבון פלואורסצנטי אדום שימש ככתב להראות כי התאים להביע את המכשיר BiFC שיעזרו להמחיש את המספר הכולל של תאים. קרינה פלואורסצנטית וונוס מוצג בצבע ירוק ולייצג puncta גדול קספאז-2 המושרה קרבה. ניתן לספור תאים אלה כדי לקבוע את אחוז תאים ונוס-חיוביות. מסקנות לגבי לוקליזציה subcellular יכולים להתבצע גם מתמונות כאלה. בדוגמה המוצגת, קרבה המושרה קספאז-2 זוהה גם גרעינון. כמו הציטופלסמה 17. כדי לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה subcellular של הפעלת קספאז מורכבים, תאים בודדים יכולים לדימות בשלושה ממדים. איור 4 מציג שתי דרכים לייצג את תמונות תלת-ממד כזה. הראשון הוא ליצור שחזור תלת-ממד של התא. הדוגמה מראה camptothecin-induced קספאז-2 BiFC גרעין באדום וירוק. שחזור תלת-ממד מראה לוקליזציה היחסי של שני fluorophores לאורך כל התאים. תוצאות תצוגה מסוג זה יעיל במיוחד כאשר מוצג בתור סרט, סיבוב התא סביב ציר יחיד (1 סרטים). הפאנל השני הוא הנוף אורתוגונלית באותו התא. פעולה זו מספקת את הפריט החזותי xy, xz yz ימאהה של התא בנקודה מסוימת בתא. תיאור של תוצאות באופן זה יכול להיות מתאים יותר על מצגת נייר כגון במאמר כמו זה קל יותר לפרש 3D הנתונים המוצגים בתבנית דו-ממדית. איור 5 מראה דוגמה של הדמיה בצילום מואץ של קספאז-2 BiFC בקו תא גליובלסטומה שטופלו של bortezomib מעכבי פרוטאוזום (ראה גם סרט 2). הגרף מראה את העלייה בעוצמת ונוס הממוצע בכל תא בממוצע על פני מספר תאים (הותאם מ -20). ניתן גם להציג סוג נתונים זה כמו מספר של תא בודד עקבות על גרף אחד. בדוגמה המוצגת, תחילתה של קספאז המושרה הקרבה הוא בערך 2 h לאחר הטיפול.

Figure 1
איור 1: סכימטי של קספאז מבנה ומתודולוגיה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC). (א) מבנה כללי של קספאז היוזם. את subunits prodomain, גדולים וקטנים, מוטיב QACRG שנשמרת המכיל את אתר פעיל ציסטאין מתוארים. (B) BiFC משתמש פיצול פלורסנט חלבונים לבד אינם פלורסנט אך ניתן לשייך לבצע רפורמה המולקולה פלורסנט כאשר התמזגו חלבונים אינטראקציה. עבור קספאז BiFC, prodomain (Pro) או באורך מלא קספאז מותך לטרמינל-N חצי (ונוס-N), C-לתחנה המרכזית חצי (ונוס-C) של ונוס. כאשר הן מופיעות במצבן monomeric החלבונים פיוז'ן קספאז אינם פלורסנט. על הגיוס פלטפורמת הפעלה, כגון PIDDosome, כפי שמוצג להלן, איגוד של שני החצאים של ונוס נאכף המייצג קרבה קספאז המושרה הנמדדים כמו עלייה בזריחה נוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונת הנציגה עבור זיהוי רוויה באמצעות הצגת היסטוגרמה. יוצגו דוגמאות של האופטימלית (החלונית העליונה) אותות רוויים (החלונית התחתונה). ונוס (שיא צהוב) ואת אותות RFP (שיא אדום) מוצגים. ציר ה-x מציינת בעוצמה, ציר ה-y היא מספר הפיקסלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קומפלמנטציה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 (BiFC) בעקבות נזק לדנ א. הלה התאים לבטא את הרכיבים BiFC קספאז-2 היו עזבה ללא טיפול (א) או מטופלים עם camptothecin (100 מיקרומטר) (B) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). mCherry היה שותף ביטוי ככתב פלורסנט. להחליפן בתמונות יציג תאים (אדום) עם BiFC קספאז-2 (ירוק) בתאים שטופלו camptothecin 16 שעות לאחר הטיפול. סולם העמודות מייצגות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: לוקליזציה של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). הלה תאים המבטאים את הרכיבים BiFC קספאז-2, כתבת גרעיני פלורסנט טופלו על-camptothecin (20 מיקרומטר) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). שחזורים תלת-ממדי מורכב מתמונות 0.1 μm טורי קונאפוקלית עד z-המטוס של התא נעשו לאחר 24 שעות ולהציג את הגרעין ב BiFC ואדום קספאז-2 בצבע ירוק. החלונית השמאלית מציגה את שחזור עיבוד הקרנה תלת-ממדי העוצמה המקסימלית (ראה גם סרט 1). הלוח נכון מציג את התצוגה אורתוגונלית פרוסות באותו התא. התיבה האמצעית (כחול) מישור xy , התיבה הימנית (צהוב) זה המטוס yz ימאהה , התיבה העליונה (לבן) זה המטוס xz . המטוסים yz ימאהה , xz מצטלבות על פי העדשה. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: בצילום מואץ של קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC) (א) LN18 גליובלסטומה תאים transfected עם הרכיבים BiFC קספאז-2, פלורסנט מיטוכונדריאלי סמן אדום (DsRed-mito, אדום) טופלו bortezomib (15 ננומטר) בנוכחות qVD-OPH (20 מיקרומטר). התאים הונחו על מיקרוסקופ קונפוקלי ב 37 מעלות צלזיוס, התמונות צולמו כל 2 דקות בשביל ה 8 תמונות של תאים נציג מהתוכנית זמן לשגות שתוצאתם המושרה הקרבה של שני הרכיבים BiFC קספאז-2 בגידול ונוס קרינה פלואורסצנטית ( ירוק) לאורך זמן. (ב') העוצמה הממוצעת של ונוס בכל תא בכל נקודה בזמן נמדדה. זריחה נוגה מוגברת לאורך זמן לאחר הטיפול bortezomib. חטיבת בפקד שאינו מטופל ציינו כי התנאים רעילות נמוכה או זניח של אור לייזר (איור משנת 20). גודל ברים מייצגים 20 מיקרומטר. קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) 8 (בקרה) 14 (bortezomib) תאים בודדים (ראה גם סרט 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בגודל של צלחת מספר תאים נפח של המדיה
6. ובכן לוחית רישוי עונה 1 פרק 105 תאים / טוב 2 מ
12. ובכן לוחית רישוי 5 x 104 תאים / טוב 1 מ"ל
24. ובכן לוחית רישוי 2.5 x 104 תאים / טוב 0.5 mL
4 הקאמרית המנה 2.5 x 104 תאים / קאמרית 1 מ"ל
צלחת הקאמרית 8 1.25 x 104 תאים / קאמרית 0.5 mL

טבלה 1: הנחיות מספר של תאים לצלחת. אם משתמש תאים stably לבטא את הרכיבים קומפלמנטציה (BiFC) של קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית, צלחת כפול הסכומים המוצגים כאן.

בגודל של צלחת ריאגנט תרביות תאים מדיה מופחת סרום כתב פלסמיד פלסמיד VC קספאז-pro פלסמיד VN קספאז-pro מופחת סרום מדיה שיתווספו פלסמיד מיקס תרביות תאים ריאגנט פתרון נוסף מיקס פלסמיד סרום מדיה פנויה נוספת לתאים
6. ובכן לוחית רישוי פלטה/µL 12 750 ΜL 10 ng 20 ng 20 ng לסך 100 µL 100 ΜL 800 ΜL
12. ובכן לוחית רישוי פלטה/µL 12 750 ΜL 5 ng 10 ng 10 ng לסך 50 µL 50 ΜL 400 ΜL
24. ובכן לוחית רישוי פלטה/µL 12 750 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng לסך 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
4 הקאמרית המנה פלטה/µL 4 250 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng לסך 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
צלחת הקאמרית 8 פלטה/µL 4 250 ΜL 1.25 ng 2.5 ng 2.5 ng לסך 12.5 µL 12.5 ΜL 100 ΜL

בטבלה 2: מומלץ כרכים של ריאגנטים המשמש עבור תקנים ארעית. הערה: כמות פלסמיד הציע היא רק נקודת התחלה. אם אין אות זוהה, מומלץ titrate את פלסמיד מ 20-200 ng לכל טוב של צלחת 6-. טוב.

קספאז טיפול ריכוז זמן התוצאות הצפויות
קספאז-1 עולה ביטוי יתר על המידה 250 ng/טוב של צלחת טוב 6 48 שעות 50% BiFC חיובית
קספאז-2 ביטוי יתר RAIDD 500 ng/טוב של צלחת טוב 6 h 24 שעות ביממה 90% BiFC חיובית
Camptothecin 100 מיקרומטר 16 h 30-60% BiFC חיובית
הלם חום h 1 ב 45 מעלות צלזיוס 16 h 80% BiFC חיובית
קספאז-4 Overexpressed NALP1 250 ng/טוב של צלחת טוב 6 48 שעות 30% BiFC חיובית
קספאז-5 Overexpressed IPAF 250 ng/טוב של צלחת טוב 6 48 שעות 15% BiFC חיובית

טבלה 3: דוגמאות לפקדי חיובי עבור קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC). התנאים ואת התוצאות הצפויות מבוססים על נתונים שפורסמו באמצעות ה-Pro בונה 14,17,18. פלסמידים ביטוי משותף צריך להיות transfected לצד פלסמידים BiFC (שלב 2.1.4)

Movie 1
סרט 1: לוקליזציה תלת-ממד של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). שחזור תלת-ממד, לסובב y-ציר של תמונות קונאפוקלית עד z-מטוס של הלה תאים המבטאים את הרכיבים קספאז-2-BiFC, כתב גרעיני פלורסנט טופלו עם camptothecin (20 מיקרומטר) במשך 16 h. הסרט מראה קספאז-2 (ירוק) BiFC את הגרעין (אדום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
סרט 2: בצילום מואץ של זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קספאז-2 קומפלמנטציה (BiFC). LN18 גליובלסטומה תאים transfected עם הרכיבים BiFC קספאז-2 ו שטופלו bortezomib (15 ננומטר) היו עם תמונה כל 2 דקות במשך 8 שעות. הסרט מראה BiFC קספאז-2 (ירוק), המיטוכונדריה (אדום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה דן השימוש של חלבונים פלורסנט מפוצל כדי למדוד את קספאז המושרה קרבה. פיצול ונוס נבחרה עבור טכניקה זו כי הוא בהיר מאוד, מאוד photostable, את refolding הוא מהיר 13. לפיכך, הניתוח של ונוס refolding על קרבה קספאז המושרה יכול לספק קרוב אומדנים בזמן אמת של קספאז חלבון אינטראקציה דינמיקה. ונוס מפוצל לשני מקטעים חופפים מעט, הסופית N של נוגה (ונוס-N או VN) הכולל חומצות אמינו 1-173, הטרמינל C קטע (ונוס-C או VC) הכולל שאריות 155-239. לחלבונים אחרים פיצול פלורסנט קיים אך כמה כמו פיצול mCherry, לדרוש הדגירה ב 4 ° C עד 2 שעות עבור refolding 21. פיצול נוסף חלבונים פלורסנט כולל פיצול Cerulean (גרסה של חלבון פלואורסצנטי ציאן) ועדיין לא mLumin פיצול אדומה להיבדק בהקשר הזה, 13,22. בסופו של דבר, אם אלה חלבונים פלורסנט להוכיח מתאים למדידת הקרבה קספאז המושרה, הדבר עלול לאפשר עבור הערכת caspases מרובים בו זמנית.

בדרך כלל, האזור (Pro) prodomain קספאז היא דבוקה השברים פלורסנט פיצול. אזור זה מכיל חלק קספאז הנדרש כדי לאגד פלטפורמת הפעלה מינימלית ומקיפה את מוטיב אינטראקציה כרטיס או DED. היתרון של שימוש של prodomain הוא כי זה אינו מציג כל פעילות אנזימטי לתאים. דבר זה מאפשר לפיקוח הסימולטניות של אירועים במורד הזרם בשל קספאז אנדוגני. מחקר לתאריך הראו הבדל קטן קינטיקה, לוקליזציה של קספאז BiFC בין prodomain את קספאז באורך מלא 14. עם זאת, המבנה באורך מלא נוטים להביע עם יעילות נמוכה יותר, המחייב את תקנים של כמות מוגברת של פלסמיד ה-DNA. בנוסף, מומלץ להפוך למוטציות של ציסטאין קטליטי סרין כדי למנוע אפופטוזיס קספאז-induced על הביטוי. למרות החסרונות האלה, חקירות מסוימים עשויים לדרוש ניתוח בו-זמניות של זוגות BiFC באורך מלא כדי לקבוע אם ישנם הבדלים תלויי-ההקשר בסמיכות קספאז המושרה ב נוכחות או היעדרות של התחומים קטליטי.

פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד עבור תאים הלה. באותו הפרוטוקול עובד היטב עבור שורות תאים חסיד נוספים לרבות הקו תא קרצינומה של החלב, MCF-7, שורת התאים גליובלסטומה, LN18, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEF). מומלץ כי המשתמש מייעל תנאים ציפוי וגם תקנים בעת התאמת פרוטוקול זה לסוג תאים חדשים. הפרוטוקול מתאר שתי גישות מיקרוסקופ הראשי יכול לשמש כדי להעריך את התאים: epifluorescence ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בעת שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית, תאים חייב להיות מצופה על coverslips זכוכית דקה כי הרוב המכריע של מטרות מפתח נומרי גבוהה אשר משמשים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית לא יחדרו את העובי של מנות פלסטיק או זכוכית שקופיות. לכן, מומלץ להשתמש מנות עם coverslips זכוכית דקה מוטבע מס 1.5, בעלי עובי אופטימלי coverslip 0.17 מ מ. מספר סוגים שונים של הכלים האלה זמינים שנעים בטווח שבין 3 ס מ בודדים מנות, בשקופיות קאמרית, ללוחות רב טוב בגודל סטנדרטי. טבלאות 1 ו- 2 מתאר כיצד להתאים את ההוראות ציפוי, תרביות תאים עבור גודל טוב שונים. עבור epifluorescence הדמיה זה שמתואר כאן (4.1), תקן תרביות רקמה פלסטיק צלחות מספיקים כל עוד המיקרוסקופ מצויד עם יעדי מסירה ארוכה.

כי גישה זו היא למעשה שיטה "אורות" מדידת קספאז הפעלה, ההכללה של עיתונאי פלורסנט חיוני כדי לאפשר ויזואליזציה של התאים לפני או בהיעדרו של הפעלה של הכתב קספאז והן כדי לזהות התאים transfected, כאשר נעשה שימוש ארעי תרביות תאים. ניתן להשתמש מספר כתבים שונים, הקריטריונים היחיד בבחירת אחד: 1) fluorophore מואר דיו כך שניתן יהיה לזהותו בקלות על-ידי הפרוטוקול הדמיה; ו- 2) ספקטרום פלורסנט שלה אינו חופף עם זה של YFP. למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אמור לא לשמש בתור כתבת כי זה יזוהו על ידי YFP מסנן או לייזר המשמשים לזיהוי ונוס. זאת בשל החפיפה ספקטרלי של שני fluorophores. בחירת fluorophore זה רגישה כדי אברון ספציפיים יכול לספק מידע איכותי נוסף. לדוגמה, השתמש של חלבון כי מטרות המיטוכונדריה, כגון חלבון פלואורסצנטי אדום DsRed-mito, יכול לספק פרטים נוספים על הכדאיות הכוללת של התא. המיטוכונדריה נוטים לעבור פיצול (ביקוע) שבשלבים הראשונים של מוות תא 23 ואת זה ניתן לאבחן עם עיתונאי כמו DsRed-mito. השימוש סמן אברון ככתב באפשרותך גם לאפשר מסקנות לגבי subcellular לוקליזציה של קספאז BiFC צריכה להיעשות.

ישנן מספר דרכים כי קספאז BiFC נתונים יכול להיות נרכש, ניתח. להחליט באיזו שיטה להשתמש ייקבעו על ידי הפרמטרים להיחקר (נקודת קצה אוכלוסיה ניתוח לעומת מידע לפי מיקום או קינטי תא בודד) ואת הזמינות של תוכנה ומכשור והדמיה. פרוטוקול זה מתווה גישות מבוססות-מיקרוסקופ כמה איסוף תוצאות קספאז BiFC ניסוי לרכישת פעם נקודות והן נתוני זמן לשגות. עם זאת, יצוין כי מספר וריאציות, שילובים של גישות אלה כדי לשמש לחקור באופן יצירתי קספאז הפעלה מסלולים.

פעם נקודת נתונים רכישה (4.1) משמש כדי לקבוע את אחוז תאים עם קספאז המושרה קרבה בנקודת זמן אחת. עבור פרוטוקול זה, אחד פשוט סופר את מספר תאים transfected שהם ונוס-חיוביות. לפיכך, ציוד מאוד מיוחדים אינה נדרשת, רק במיקרוסקופ epifluorescence הבסיסיים ביותר עם GFP (או YFP) ו- RFP מסנן ודלפק טלי יד יש צורך. כמה מערכות הדמיה יכול להיות אוטומטי לקחת מספר מוגדר של תמונות באופן אוטומטי לכל טוב של צלחת. אם מכשור כזה זמין, התאים של תמונות נרכשות ניתן לספור באופן דומה על ידי בדיקה חזותית, או quantitated באמצעות תוכנת הדמיה. הדמיה תלת-ממדית (4.2) מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של קספאז BiFC לאורך כל המטוסים מוקד של התא. מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזרים אשר מעוררים ונוס ו RFP (או הכתב שבחרת תרביות תאים) ו- Z-מחסנית יכולות נדרש. מספר של מודולי תוכנה 3עיבוד זמינים אשר מספקים דרכים שונות כדי להמחיש את הנתונים. לשני הסוגים האלה של ניתוח זה ניתן לתקן את התאים ואת התמונה או להעריך אותם בשלב מאוחר יותר. עם זאת, התהליך של קיבעון לצמצם את האות ונוס, אשר יכול להוסיף חפצים לניתוח, ולכן גישה זו אינה מומלצת. הדמיה בצילום מואץ (4.3) יכול לשמש כדי לספק קינטי סימולטני וניתוח לפי מיקום של קספאז BiFC. ניתן להגדיר מיקרוסקופ מצויד שלב ממונע תמונות של תפקידים מרובים ולהשוות אפילו קבוצות טיפול שונה אותו ניסוי.

עבור זמן לשגות, מספר שיקולים נוספים שכדאי לקחת בחשבון. אור הלייזר יכול לגרום חפצים עקב phototoxicity או photobleaching, שניהם צריכים להיות תחת פיקוח עבור. באופן כללי, שניהם יכולים להימנע באמצעות הנמוך ביותר האפשרי כמות האור (קלט אחוז נמוך לייזר חשיפה חשמל וקצרים פעמים ב צעדים 4.3.6-4.3.7). Phototoxicity תוצאות כאשר אור הלייזר גורם מוות התאים ולא ניתן לשלוט על ידי הדמיה התאים לא מטופלת תחת באותם התנאים ולאשר שאת חלוקת התא ממשיך כרגיל. Photobleaching מתרחשת כאשר מספר תמונות שצולמה באותו התא מקטין את קרינה פלואורסצנטית. החלבון הניאון ונוס הוא די photostable, אז זה רק לעתים נדירות בעיה בפועל. ההשפעות של photobleaching יכול להיקבע על ידי לקיחת תמונות רבות רציפים של תא ונוס-חיוביות ולהבטיח קרינה פלואורסצנטית נשאר יציב. זה רק שצריך לעשות פעם אחת, כל עוד לייזר כוח וחשיפה הקביעות משמשים בכל ניסוי. אפשרות לפתור תופעות עקב phototoxicity או photobleaching גם על-ידי הפחתת מספר תמונות שנלכדו הכולל. זו יכולה להיות מושגת על ידי הארכה או לינוק את מרווח הזמן בין לכידות (שלב 4.3.9). ? משתמשים 5-10 דקות מרווחי זמן לשגות ה 16 הוא מקום טוב להתחיל. אם photoxicity לא נצפית או ניסויים של משך קצר יותר נדרשים, ניתן להפחית את מרווח הזמן בין מסגרות. אם קספאז הפעלה מהירה, ניתן להשתמש קצר בין ניסויים במרווחי זמן קצרים יותר. לדוגמה, עבור ניסוי 16 h עם מרווחי 10 דקות, סך של תמונות 192 תועבר (96 עבור כל fluorophore). ניסוי 2 h עם מרווחי 1.5 m תניב 160 תמונות. לכן, הניסויים קצרים וארוכים אחד יחשוף לתאים דומה סכומים כוללים של אור לייזר. לניסויים משך קצר ניתן להוסיף את קספאז הפעלת הגירוי ישירות למדיה מייד לפני טקס החניכה של לכידת בצילום מואץ (אחרי צעד 4.3.11 במקום בכל שלב 3). כדי לעשות זאת, להסיר את המכסה הצלחת ושחרר בעדינות בתמיסה המכילה את הגירוי באמצעות פיפטה. הקפידו לא נתקלים ומכשילים את הצלחת, במהירות לבדוק כי התאים נמצאים עדיין בפוקוס לפני שתמשיך.

בעת ביצוע ניסויים זמן לשגות, חשוב גם לוודא כי סביבתו הקרובה של התאים הדומה לזה של חממה תרביות רקמה. מספר של בקרת האקלים זמינים על ערכת מיקרוסקופ שונות קופצים. אלה כוללים חממות העליון שלב קטן יותר, כמו גם בדיקות גניקולוגיות הכומסים המיקרוסקופ כולו. שני התקנים אלה בדרך כלל מספקים חום, CO2, לחות אל התא באופן ניתן לשלוט במדויק. שליטה מדויקת של CO2 וטמפרטורה חיוני להצלחת הניסוי, כי לא צפויה הטמפרטורה תנודות יכול להוביל מוקד להיסחף והעדר CO2 גורם ה-pH של המדיה לעלות יכול להיות רעיל לתאים. אם מקור2 CO אינה זמינה, שניתן לאגור כלי התקשורת על ידי התוספת של Hepes (ראה שלב 3.1.1). גם אם מקור2 CO זמין, מומלץ לכלול Hepes המדיום הדמיה כאמצעי נוסף לשמור התאים בריאים. עם זאת, אפילו בנוכחות Hepes, העדר CO2 לתקופות ממושכות של זמן יכול לגרום מוות של תאים. לכן, חשוב לבדוק תאים ללא טיפול, עם תמונה תחת באותם התנאים, ואת הצבע של התקשורת בתום הניסוי כדי להבטיח כי ה-pH נשאר יציב. הערה שפנול אדום אינו צריך להיות מושמט מכל המדיה בשימוש פרוטוקול זה מאז התרומה של autofluorescence לאות ונוס הוא מינימלי.

ישנן מספר שיטות זמינות כדי לנתח את הנתונים הדמיה הנובע ניסוי זמן לשגות. מדידת עוצמת אכזרי של ונוס פיקסלים בכל תא transfected היא הדרך הברור ביותר כדי לנתח את התזמון של קספאז המושרה קרבה. כפי שמוצג באיור 3, איור 4, איור 5, BiFC קספאז-2 מופיע לעיתים קרובות puncta אחד או יותר הממוקמים בתאים subcellular שונים. הדמיה ניתוח ניגש למדוד מספר מוקדים, גודל האובייקט או גורמים דומים נוספים המסוגלים להניב נתונים כמותיים אינפורמטיבי על מבנים אלה. לא כל קספאז BiFC מופיע puncta. לדוגמה, caspases דלקתית הראו המתבנת BiFC שונים לרבות קרינה פלואורסצנטית ' מאטום לשקוף ', מבנים filamentous puncta יחיד או מספר לכל תא 18. הדפוסים הללו היו תלויים קספאז מופעל כמו גם האותות הפעלת במעלה הזרם. לכן, הסוג של ניתוח המתאימה ביותר עבור תוצאות זמן לשגות שיכתיבו במידה רבה לפי סוג פלורסנט המתבנת זה הוא ציין.

רבים של הגירויים טיפול זה הם העריכו בעת שימוש בפרוטוקול זה. יגרום אפופטוזיס או ישירות דרך את קספאז ניתח או בעקיפין על ידי העוסקים מסלול מוות תאים שונים. זה גורם לתאים לכווץ והתנתקו מן הצלחת, מה שהופך את זה קשה מאוד תמונה התאים, כמעט בלתי אפשרי לקבוע שום לוקליזציה ספציפי של קספאז-BiFC. הכללת מעכב פאן-קספאז תמנע זה מוות של תאים. הגיוס של caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, את קספאז המשויך BiFC אינה תלויה פעילות קטליטית קספאז. לכן, עיכוב קספאז לא תשפיע על שלב זה, אך לעכב את המאפיינים הפיזיים במורד הזרם של אפופטוזיס כולל blebbing, ניתוק, ואובדן בסופו של דבר שלמות קרום פלזמה. לפיכך, אם ביצוע ניתוח נקודת הקצה (שלב 4.1) או ערימות Z (4.2 שלב), ההכללה של מעכב קספאז הוא חיוני. עבור זמן לשגות ניסויים, לעומת זאת, אם אירועים הקשורים לאפופטוזיס כגון MOMP, איגוד annexin V (כדי לזהות חשיפה סרין phosphatidyl) או propidium יודיד ספיגת (כדי לזהות קרום פלזמה permeabilization) כדי להיות מנותח לצד קספאז BiFC, צריך להיות מושמט קספאז מעכב כדי למנוע עיכוב של אירועים אלה. כדאי להוסיף מעכב קספאז כגון qVD-OPh (10-20 מיקרומטר) בתקשורת המכיל את הגירוי בתדר אפופטוזיס (שלב 3.1.1). אם שותף המבטאת חלבון פרו-אפופטוטיים להיפגע עם הרכיבים BiFC קספאז המדכא קספאז להוסיף בשלב 2.1.12.

בעוד קספאז BiFC היא אחת השיטות זמין כמה זה יכול לשמש כדי להמחיש את האירועים במשעולים הפעלה קספאז בתאים חיים, מספר שיקולים חייב להילקח בחשבון בעת תכנון ניסויים אלה. כי גישה זו מבוסס על ביטוי, בקרת ירידה לפרטים חשובים. זה יכול להתבצע באחת משתי דרכים. ראשית, הקדמה של מוטציות נקודה אחת לתוך כרטיס או DED של קספאז prodomain כך הם לשבש את האיגוד בין קספאז את פלטפורמת הפעלה שלה אמורה להפחית את עוצמת קספאז BiFC והן את האחוז של ונוס-חיובית תאים. לדוגמה, מוטציה של השאריות D59 לאי ב- prodomain של קספאז-1 משבש מחייב החלבון מתאם ASC (אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר חלבון המכיל כרטיס) ומפריע באותה מידה ASC-induced קספאז-1 BiFC 18,24 . שנית, השימוש תאים שנמצאים חסר בחלבונים מתאם זה לגייס את קספאז פלטפורמת הפעלה יקטן אותות BiFC מסוימים. זו יכולה להיות מושגת באמצעות תאים נוקאאוט, אם הם זמינים, או באמצעות siRNA או מבוססת על CRISPR/Cas9 גישות לרוקן את התאים של מתאם. בהתאם לכך, דלדול של החלבון קספאז-2 מתאם RAIDD לגמרי חסום קספאז-2 BiFC המושרה על ידי הלם חום או DNA נזק 14,17 לניסויים אלה, נוקאאוט או את התאים תמונות ציפורים יש להשוות עם שליטה מתאימים תאים (כלומר מתאימים-המלטה פראי סוג MEF או פקד תמונות ציפורים תאים), אם קו תא חדש, וצריך להעריך תנאים אופטימליים תרביות תאים כדי להבטיח שוויון ביטוי של הכתב BiFC מעבר לגבולות התא.

מגבלה נוספת של גישה זו הוא כי, בעת שימוש ארעי תרביות תאים, קשה להבטיח כי כל תא מביע כמויות שוות של כל חלבון. אם הביטוי אינו שוויוני, פרגמנט ונוס אחד יכול להתגייס פלטפורמת בתדרים גבוהים יותר. זה יכול להסתיר את האות מלא פלורסנט, להוביל לתוצאות שליליות כוזבות. כדי להתגבר על בעיה זו, הייתה גרסה חדשה של הכתב BiFC קספאז לדור קו תא יציבה דיווחו לאחרונה 17. גרסה חדשה זו כללה מבנה שביטא את הרכיבים C2 Pro-BiFC על מסגרת קריאה פתוחה יחיד המופרדות על-ידי 2A ויראלי פפטיד עצמית שהפריד 25. לכן, הרכיבים BiFC עיבד כמו mRNA אחת מן האמרגן אותו אבל מתורגם לייצר כמויות החלבונים פיוז'ן VC, VN שווה stoichiometrically. הקווים התא שנוצר לבטא stably את המבנה הזה, הפגינו מגמות דומות של הפעלת בפני הכתבים transiently ביטוי אבל היו גם רגישים יותר וגם המוצג להוריד רקע זריחה. כך, הפרוטוקול הנ ל יכול להיות לפשוט מאוד אם נעשה שימוש בשיתוף עם שורות תאים כתב stably לבטא את הרכיבים BiFC קספאז.

נתונים לתאריך מציע להתערבות מזערית בין הרכיבים BiFC קספאז החלבונים אנדוגני. לדוגמה, קספאז-2 ידוע להיות מופעל במעלה הזרם של MOMP אבל קספאז-2 BiFC אינם חוסמים את ההתקדמות של MOMP 14. לפיכך, העיתונאים האלה אינם מופיעים להתנהג בצורה שלילית דומיננטי. עם זאת, אם בו זמנית הערכת אירועים במורד הזרם, זה צריך להיחקר בתוך כל קבוצה של ניסויים. כולל פקד ללא transfected היטב הניסוי היא הדרך הטובה ביותר לטפל בזה. אם קינטיקה של מוות של תאים אינן משתנות עם או בלי ביטוי של החיישן קספאז, יציין כי הרכיבים קספאז-BiFC אינם מפריעים פונקציה אנדוגני. לעומת זאת, קספאז אנדוגני אולי ישפיע מדידה BiFC, יעילות או גודל או צורה של המבנים. הבעת הכתב בתאים לקוי עבור קספאז ישלוט על זה.

למרות מגבלות אלו, קספאז טכניקה BiFC היא שיטה שימושית לחקור מסלולים הפעלה קספאז להשלים, לשפר אפילו על גישות קיימות כדי למדוד יוזם קספאז הפעלה. על ידי הקרבה המושרה מדידה, בשלב הראשון של ההפעלה, טכניקה זו גוברת על בעיות הקשורות מדידה מאוחר יותר צעדים כגון קספאז אוטומטי עיבוד המשויך הפעלה. לדוגמה, בעת שימוש תספיג כדי לנטר את המחשוף של caspases התליין, קספאז-3 קספאז-7, מספק מדד מדויק של הפעלת 2, באמצעות אותה גישה עבור היוזם caspases יכול להיות פגום. זה בגלל המחשוף של יוזם caspases, אינה מספקת עבור הפעלת 4,26,27. למעשה, רבים caspases יוזם הם ביקע במהלך אפופטוזיס מאת קספאז-3 בלי לייצר אנזימים פעילים 28. באופן דומה, טכניקות ומתבסס על שימוש פפטיד דיאלקטריים תוכנן מטרות ספציפיות caspases צריך לקחת בחשבון את specificities חופפים של רצפי אלה עבור caspases 29. אין זה אומר כי גישות כאלה לא ניתן להשתמש כדי למדוד את קספאז ההפעלה, אבל החסרונות כדאי שיכירו כאשר לפרש את התוצאות. BiFC קספאז מספק גישה חלופיות שיכולות לסייע לאשר את תוצאות בשיטות הקונבנציונלית יותר. בנוסף, היכולת לעקוב אחר ההרכבה של מתחמי הפעלה קספאז בזמן אמת, כדי לקבוע בבירור צורה וגודל, לוקליזציה של מתחמי היא יתרון משמעותי של טכניקה זו, זה בלתי אפשרי לאמוד באמצעים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות כל הקודם חברי המעבדה Bouchier-הייז שתרמו להתפתחות של טכניקה זו. עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרס טייס בילדים בבית החולים לילדים טקסס אנא צרו קשר. אנו מודים צ'אנדרה Joya (MD אנדרסון, יוסטון, טקסס) על הרשאה לכלול נתונים לאור בשיתוף עם הצוות שלה. התפתחות ריאגנטים תיאר נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 ו NCRR S10RR024574), הסיוע של ג'ואל מ Sederstrom

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes Mattek P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore FC010-10MG
DPBS Sigma D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668019
OPTI MEM I Invitrogen 31985088
C2-Pro VC plasmid Addgene 49261
C2-Pro VN plasmid Addgene 49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components available by request from LBH
DsRed mito plasmid Clontech 632421 similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES Invitrogen 15630106
2 Mercaptoethanol 1000X Invitrogen 21985023
q-VD-OPH Apex Bio A1901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
  2. Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
  3. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
  4. Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
  5. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  6. Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
  7. Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
  8. Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
  9. Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
  10. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  11. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  12. Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
  13. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  14. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  15. Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
  16. Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
  17. Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
  18. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
  19. Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
  20. Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
  21. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  22. Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
  23. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
  24. Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
  25. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  26. Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
  27. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  28. Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
  29. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).

Tags

ביוכימיה גיליון 133 קספאז אפופטוזיס קומפלמנטציה פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית מיקרוסקופ ונוס בצילום מואץ
מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes,… More

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation. J. Vis. Exp. (133), e57316, doi:10.3791/57316 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter