Summary
Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.
Abstract
Proteaz caspase ailesinin Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık önemli rol oynarlar. Başlatıcı caspases bilinen bir alt Bunlar arasında ilk bu yollar var olmak harekete geçirmek. Grup caspase-2, içerir -8 ve -9 gibi inflamatuar caspases, caspase-1, -4 ve -5. Başlatıcı caspases tüm işe alım harekete geçirmek platformlar olarak adlandırılan belirli multiprotein kompleksleri için takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) nerede floresan proteinler caspases başlatıcı caspases onların harekete geçirmek platformları ve sonucu olan alımı görselleştirmek için kullanılan başlatıcı için erimiş bölünmüş bir görüntü tabanlı yaklaşımdır indüklenen yakınlık. Bu floresan bir okuma bir başlatıcı caspase harekete geçirmek için gerekli ilk adımları sağlar. Farklı mikroskobu tabanlı yaklaşımlar bir dizi kullanarak, bu teknik Nicel veri caspase harekete geçirmek bir nüfus düzeyde verimliliğini yanı sıra caspase harekete geçirmek ve caspase etkinleştirme sayısı ve boyutu Kinetik sağlayabilirsiniz Hücre başına temelinde kompleksleri.
Introduction
Caspase proteaz aile kritik rollerine Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık 1bilinmektedir. Onların önemi nedeniyle, ne zaman, nerede ve nasıl verimli bir şekilde belirlenmesi belirli caspases aktif çok önemli caspase mekanizmaları harekete geçirmek yolları kazandırabileceğini. Burada açıklanan görüntüleme tabanlı iletişim kuralı caspase harekete geçirmek cascade ilk adımda görselleştirme sağlar. Bu teknik, bu sürücü caspase etkinleştirme dinamik protein: protein etkileşimleri yararlanır.
Caspases iki gruba ayrılabilir: Başlatıcı caspases (caspase-1, -2, -4, -5 -8 -9, -10 ve -12) ve Cellat caspases (caspase-3, -6 ve -7). Cellat caspases ön şekillendirilmesi dimer hücrede mevcut ve büyük ve küçük alt birim 2arasında bir bölünme tarafından aktif hale gelir. Etkinleştirildiğinde, onlar apoptosis 3' te sonuçlanan çok sayıda yapısal ve düzenleyici proteinler ayırmak. Başlatıcı caspases bir yolu var olmak harekete geçirmek ve genellikle Cellat caspases aktivasyonu tetiklemek için ilk caspases vardır. Cellat caspases aksine, başlatıcı caspases dimerization 4,5tarafından etkinleştirilir. Bu dimerization harekete geçirmek platformlar bilinen belirli büyük molekül ağırlığı kompleksleri için etkin olmayan monomerleri alımı tarafından yönetilir. Derleme etkinleştirme platformlarının bir dizi belirli protein: protein etkileşimler tarafından yönetilir. Bunlar tarafından korunmuş protein etkileşim motifleri mevcut başlatıcı caspase proform aracılı ve ölüm etki alanı (DD), ölüm efektör etki alanı (DED) ve caspase işe alım etki alanı (kart) 6 (şekil 1A) içerir. Harekete geçirmek platformlar genellikle bir reseptör protein ve bir adaptör protein içerir. Reseptör genellikle çok sayıda molekülleri Oligomerizasyonda için sağlar bir konformasyonal değişim inducing bir ligand bağlanması üzerine devreye girer. Reseptör sonra da caspase doğrudan veya sırayla getirmek caspase kompleksi için adaptör molekül acemi. Böylece, çok sayıda caspase molekülleri yakın dimerization izin gelmek. Bu indüklenen yakınlık modeli 7olarak bilinir. Dimerized sonra caspase aktif enzim 4,8stabilize etmek için hizmet vermektedir işlenirken uğrar. Örneğin, Apaf1 apoptosome Meclisi yayınlandıktan sonra mitokondri mitokondrial dış membran permeabilization (MOMP) denen bir süreç üzerinden sitokrom c tarafından tetiklenir. Apaf1 caspase-9 her iki proteinler 9' mevcut bir kartıyla aracılık ettiği bir etkileşimi aracılığıyla sırayla acemi. Caspase-8 harekete geçirmek yol açan karmaşık sinyal inducing CD95 ölüm (disk) Meclisi benzer protein etkileşimleri sonucunda; caspase-2-ebilmek harekete geçirmek PIDDosome; ve caspase-1 harekete geçirmek 10,11,12başlatmak çeşitli inflammasome kompleksleri. Böylece, başlatıcı caspases belirli harekete geçirmek platformları için indüklenen yakınlık ve dimerization, hangi olmadan harekete geçirmek gerçekleşmez sonuçlanan bir ortak mekanizma ve suikastler falan.
Harekete geçirmek platformu takip caspase indüklenen yakınlık doğrudan görselleştirme izin başlatıcı caspases, harekete geçirmek bu ilk adımda ölçmek için geliştirilmiş bir görüntüleme tabanlı tahlil Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) olduğunu derleme. Bu yöntem, split floresan protein Venüs özelliklerini yararlanır. Venüs olduğunu bir daha parlak ve daha photostable sürümü iki sigara floresan ve biraz örtüşen parçalara ayrılmış sarı floresan protein (YFP): N-terminus Venüs (Venüs N veya VN) ve C-terminus, Venüs (Venüs C veya VC). Bu parçaları yeteneği refold ve yakın 13zaman floresan haline korur. Her Venüs parça harekete geçirmek platforma bağlar caspase çok az bölümü olan caspase, prodomain için erimiş. Bu caspases enzimatik aktivite korur ve bu nedenle eşzamanlı akış aşağı olaylar endojen olaylar ile ilişkili olası analizidir sağlar. Ne zaman caspase prodomains harekete geçirmek platforma işe ve indüklenen yakınlık tabi Venüs e saldırı indirgenmesi parçaları. (Şekil 1B). Elde edilen Venüs Floresans doğru ve özellikle hücre altı yerelleştirme, kinetik ve başlatıcı caspase harekete geçirmek platformlar Tek Kişilik hücrelerde Meclisi etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Veri görüntüleme confocal mikroskopi veya standart floresan mikroskopi elde edilebilir ve dahil olmak üzere farklı mikroskobu yaklaşımlar bir dizi için adapte edilebilir: hızlandırılmış caspase harekete geçirmek gerçek zamanlı; izlemek için görüntüleme yüksek kararlılık düşsel hücre altı yerelleştirme kesin tayini için; ve bitiş noktası miktar verimlilik etkinleştirme.
Bu teknik ilk caspase-214aktivasyonu araştırmak için geliştirilmiştir. Caspase-2 için harekete geçirmek platform PIDDosome olduğu düşünülen iken, reseptör PIDD (protein p53 kaynaklı bir ölüm etki ile) oluşan ve adaptör RAIDD (RIP ilişkili Ich-1/CAD-3 homolog protein ölüm etki alanı ile), PIDDosome bağımsız caspase-2 aktivasyon bildirilmiştir. Bu ek harekete geçirmek platformlar için caspase-2 15,16var olduğunu göstermektedir. Caspase-2 aktivasyon platformun tam bileşenleri bilmeden rağmen caspase BiFC tekniği başarılı sorgulama moleküler düzeyde 14,17caspase-2 sinyal yollar için izin verdi. Biz de başarıyla bu protokol inflamatuar caspases (caspase-1, -4, -5 ve -12) için adapte olması 18 ve prensip olarak, aynı yaklaşımı benzer şekilde her kalan başlatıcı caspases analiz için yeterli olmalıdır. Bu iletişim kuralı benzer şekilde adapte olabilir diğer yolları araştırmak için dimerization büyük aktive sinyal edilmistir. Örneğin, STAT protein fosforilasyon Janus kinaz (JAK) 19tarafından takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Böylece, BiFC sistemi için STAT harekete geçirmek hem de dinamik protein etkileşimler tarafından düzenlenmiş birçok yollar görselleştirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki iletişim kuralı resim alma ve çözümleme için gazetecilere hücreye giriş için adım adım yönergeler yanı sıra yöntemleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre ve kültür yemeklerin hazırlanması
Not: Bir doku kültürü laminar akış mahallede 1-3 adımları gerçekleştirin. Eldiven giymek.
- Cam alt yemekleri kullanıyorsanız, fibronektin ile cam ceket. Adım 1.2 için plastik yemekleri kullanıyorsanız atlayın.
- Fibronektin bir 0.1 mg/mL solüsyon olun: 1 mL 1 mg/mL fibronektin çözeltisi 1 X PBS 9 ml seyreltik.
- Kapak cam kuyunun her 0.5-1 mL fibronektin ve oda sıcaklığında 1-5 min için kuluçkaya.
- Bir pipet kullanarak, fibronektin çözüm toplamanız ve 4 ° C'de
Not: Fibronektin çözüm birden çok kez yeniden kullanılabilir. - Bir kez 1-2 mL 1 X PBS ile cam yıkama ve PBS Aspire edin.
- 6-şey plaka 2 ml (bkz. Tablo 1 için farklı büyüklükte kuyular için kullanılacak cep numaralarını) uygun hücre kültür ortamının kuyu başına 1 x 105 hücre plaka. Stabil (konuya bakın) caspase BiFC bileşenleri ifade eder bir hücre kültürünü kullanıyorsanız, 2 x 105 hücreleri plaka ve tedavi tutamaçlarından (Adım 3).
- Gecede 37 ° C'de bir doku kültürü kuluçka çanak uygun hücrelere izin.
2. caspase BiFC bileşenleri tanıtmak transfection hücre
- Uygun transfection reaktif hücrelerle transfect.
Not: Bu protokol Lipofectamine 2000, en az toksisite için optimize edilmiş talimatı özetliyor. Bu iletişim kuralı başarıyla Hela hücreleri, MCF7 hücreleri ve LN18 hücreleri kullanılmaktadır. Ek kullanarak transfection reaktifler üreticinin yönergeleri izleyin ve gerektiği şekilde en iyi duruma getirme.- Transfection reaktif 12 µL düşük serum medya steril tüp içinde 750 µL ekleyin.
- 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 10 eklemek bir muhabir plazmid (floresan bir protein transfected hücreleri etiketlenir örneğin kırmızı floresan protein [RFP], kodlama bir plazmid) ng steril 1,5 mL tüp transfected her şey için.
- 20 eklemek her caspase BiFC plazmid ng (örneğin, 20 ng caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC ve 20 ng C2 Pro-VN) her Tube (Tablo 2).
- Her tüp 100 µL toplam hacmi kadar düşük serum medya ekleyerek getir.
- P200 pipet kullanarak, transfection reaktif çözeltinin 100 µL 2.1.2 adımından plazmid karışıma dropwise bir şekilde ekleyin.
- Plazmid-transfection reaktif karıştırmak için oda sıcaklığında 20 dk kuluçkaya.
- Ve sonra kullanarak p1000 pipet pipet 800 µL serum Ücretsiz medya yavaşça aşağı kuyunun medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.
- P200 pipet kullanarak dropwise DNA-lipid kompleks 200 µL her şey için ekleyin.
- 3 h için bir doku kültürü kuluçka makinesi-37 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
- Değil monolayer bozabilir, aspirasyon emme kullanarak veya bir pipet ile DNA-lipit kompleksi içeren serum boş ortam kaldırmak için dikkat çekici.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C) tam büyüme medya yavaşça aşağı her şey tarafında 2 mL pipet.
- Doku kültürü kuluçka için en uygun protein ifade için 24-48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
3. indüksiyon caspase harekete geçirmek
- Bir uyuşturucu veya uyarıcı caspase harekete geçirmek yaklaşık 24 s sonrası transfection ikna ile tedavi.
- Uyuşturucu için istenen konsantrasyonu önceden sıcak (37 ° C) görüntüleme medya (Hepes [20 mM, pH 7.2-7,5] ve 2-mercaptoethanol [55 µM] ile desteklenmiş tam büyüme medya) ve karışımı yavaşça ekleyin (Tablo 3).
- Ve sonra bir pipet kullanarak, yavaşça aşağı kuyunun 3.1.1 çözümden 2 mL pipet medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.
- Uyuşturucu olmadan görüntüleme medya için bir şey tedavi edilmemiş bir denetim ekleyin.
- Doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya veya adım 4.3 için hızlandırılmış bir deneme için devam edin.
4. Caspase BiFC veri toplama
-
Caspase BiFC tek zaman nokta toplama
- Mikroskop ve üreticinin yönergeleri izleyerek Floresan ışık kaynağı açın.
- RFP filtre ve muhabir gen Floresans odaklanmak altındaki hücreleri bulmak.
- Bir el-taksitli karşı kullanarak, görme alanı içinde RFP pozitif hücrelerin tümünü say. Kaydedin.
- Aynı görme alanı korurken, geçiş GFP filtre (veya YFP filtre varsa) ve el-taksitli sayaç kullanarak, aynı zamanda yeşil kırmızı hücreleri saymak (Venüs-pozitif). Sadece kırmızı hücreleri Venüs-pozitif için değerlendirilmesini sağlamak için bu iki filtrenin arasında ileri geri geçiş. (Şekil 3) kaydedin.
- Her plaka üç bireysel alanların en az 100 RFP pozitif hücreleri saymak.
- Her alanda Venüs-pozitif transfected hücreleri (Yani aynı zamanda yeşil olan alyuvar) yüzdesini hesaplamak. Standart sapma almak için elde edilen yüzde ortalama.
-
Caspase BiFC, üç boyutlu görüntüleme
- Üreticinin yönergelerini izleyerek mikroskobunun açmak ve satın alma yazılımı başlatmak.
- 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yer
- Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.
- Ya bir epifluorescence ışık kaynağı ve mikroskop göz parça veya confocal lazerler ve bilgisayar ekranı kullanarak, ilgi bir alana gidin.
- RFP lazer veya filtre kullanarak muhabir Floresans odaklan.
- Epifluorescence bu noktaya kadar kullanılan varsa, ışık kaynağı confocal lazerler geçer ve kamera tarafından alınan ve bilgisayar ekranında edinme yazılımı tarafından görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.
- Böylece hücreleri vizör ortasına joystick kontrolü ve odak tekerleğin kullanımı, ince odak ve hücrelerin konumunu ayarını yapın. Birbirinden ayrılır ve olmayan üst üste gelen hücreleri seçin.
- Yüzde lazer gücü % 50 ve 100 ms, pozlama süresi için deneme için kullanmak için en iyi ayarları belirlemek için bir başlangıç noktası olarak Venüs ve RFP için giriş.
- Canlı yakalama açmak ve ortaya çıkan görüntü ve eşlik eden görüntü çubuk her iki kanal için incelemek.
- Görüntü sinyali iyi görünüyor kadar sinyali düşük ise ve görüntü yapmak zordur, artışlarla yüzde lazer güç ve/veya pozlama süresini artırın.
- Sinyal doygunluk ulaşmak değil emin olun. Farklı bir zirve için her fluor görünür olduğundan emin olmak için ekran histogram bakarak kontrol edin. Tüm histogram ekran zirve kapsar, giriş alt lazer güç ve pozlama ayarlarını (Şekil 2).
- Kontrol (tedavi edilmemiş veya sigara transfected) hücreleri sinyal belirli olduğundan emin olmak için aynı koşullar altında görselleştirin.
Not: Tek renkli transfectants de denetimine crossover için kullanılabilir, ancak sinyalleri dağınık şekilde farklı (örneğin karşı sitozolik mitokondrial) ise bu gerekli değildir. - Z yığın modülü içinde belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı açın veya seçin.
- Odak topuzu, yaklaşık hücrenin merkezine karşılık gelen odak konumunu kullanarak.
- Hücre görünene kadar bir yönde odak ayarlamak, bu olarak üst konumunu seçin.
- Hücreyi yeniden artık görünür duruma gelene kadar ters yönde odak ayarlamak ve bu alt pozisyon seçin.
- En uygun adım boyu (genellikle yaklaşık 20 µm) seçin ve otomatik olarak üst ve alt pozisyonlar arasında 20 µm adımların her biri, her kanaldaki tek bir görüntü çekmek için kamera istemek için satın başlar.
- 3D görüntü (şekil 4film 1) yeniden oluşturmak için 3B oluşturma yazılımını kullanın.
-
Caspase BiFC zaman hata görüntüleme
- Deneme önce en az 1 h mikroskobunun açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın
- 40 x 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yerleştirin.
- Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.
- CO2 kaynak kullanılabilir durumdaysa, CO2 teslimatı (CO2sunar tüp bağlı genellikle bir pleksiglas kapak) plaka sahibi üstüne yerleştirin. CO2 düzey 5 %'ye ayarlarsanız ve yazılım içinde CO2 denetleyicisinden açmak. CO2 kaynak yoksa, 20 mM Hepes tampon medya dahil.
- Transfected hücrelerinin bir alana gidin ve kamera tarafından alınan ve edinme yazılımlar RFP lazer kullanarak bilgisayar ekranında görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.
- Adımları 4.2.8-4.2.12, giriş ayarları için yüzde lazer güç ve pozlama kez RFP lazer. Bu değerler hala floresan sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.
- Olumlu bir denetimi kullanarak örnek (bakınız Tablo 3 örnekler için), takip için yüzde lazer güç ve pozlama kez YFP lazer ışık ayarları giriş için adımları 4.2.8-4.2.12. Bu değerler hala Venüs sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.
- Plaka her şey için bir veya daha fazla hücre muhabir ifade içeriyor farklı pozisyonların sayısını seçin.
- Her kare kare alınması hızlandırılmış ve toplam sayısı arasındaki zaman aralığını girin. Sonraki kare alınması için önce tüm seçilen pozisyonlar elde etmek için zaman olduğundan emin olun.
- Her bir pozisyon yeniden ziyaret edin ve düzeltin ve odak gerektiği gibi güncelleştirin.
- Değişiklikleri sıcaklık veya dış titreşimler neden olabilir odak drift için düzeltmek için odak kayması düzeltme sistemi üzerinde (varsa) açın.
- Hızlandırılmış başlar ve verileri kaydetmek.
- Kullanılabilir görüntüleme yazılımı (şekil 5Film 2) kullanarak verileri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caspase-2 BiFC DNA hasar tarafından indüklenen örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Camptothecin, bir topoizomeraz ı inhibitörü, DNA hasarı ve caspase-2 aktivasyon ikna etmek için kullanıldı. Kırmızı floresan protein mCherry bir muhabir olarak hücreleri BiFC sonda hızlı göstermek için ve hücre toplam sayısı görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılmıştır. Venüs Floresans yeşille gösterilmiş ve büyük puncta temsil eden caspase-2 yakınlık indüklenen. Bu hücreler Venüs-pozitif hücreler yüzdesini belirlemek için sayılabilir. Hücre altı yerelleştirme hakkında sonuçlar da böyle görüntülerden yapılabilir. Gösterilen örnekte de olduğu gibi sitoplazma 17çekirdekçik caspase-2 indüklenen yakınlık tespit edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü görsel olarak caspase harekete geçirmek karmaşık hücre altı lokalizasyonu sağlamak için tek hücreleri üç boyutlu olarak yansıması. Şekil 4 tür 3D görüntüleri göstermek için iki yol gösterir. İlk hücrenin 3D bir yeniden yapılanma oluşturmaktır. Camptothecin kaynaklı caspase-2 BiFC yeşil ve kırmızı çekirdeği görülmektedir. 3D imar her iki fluorophores göreli lokalizasyonu hücreleri gösterir. Bu tür bir sonuçları görüntüleme hücre (film 1) tek bir eksen etrafında dönen bir film olarak görüntülendiğinde özellikle etkilidir. İkinci panelin aynı hücreyi ortogonal görünümüdür. Bu hücre hücrenin belirli bir noktasında, xy, xzve yz görselleştirme sağlar. 2D bir biçimde sunulan 3D verileri yorumlamak kolay olan sonuçları bu şekilde tasvir gibi kağıt sunuyu bir dergi makalesi için daha uygun olabilir. Şekil 5 proteasome inhibitörü bortezomib ile tedavi glioblastoma hücre kültürünü caspase-2 BiFC zaman hata görüntüleme örneği gösterir (Ayrıca bkz: Movie 2). Grafik ( 20' den uyarlanmıştır) hücre sayısı arasında ortalama hücre başına ortalama Venüs yoğunluk artışı gösterir. Bu tür veri tek hücre izleri bir grafik üzerinde bir numara olarak da görüntülenebilir. Gösterilen örnekte yaklaşık 2 h tedavi aşağıdaki indüklenen caspase yakınlık başlangıcı var.
Şekil 1: caspase yapısı ve bimolecular floresan uluslara (BiFC) metodolojisi şematik. (A) bir başlatıcı caspase genel yapısı. Prodomain, büyük ve küçük alt birimleri ve aktif sistein içerir korunmuş QACRG motifi tasvir edilmektedir. (B) BiFC yalnız floresan olmayan ancak floresan molekül etkileşen proteinler için erimiş reform ilişkilendirebilirsiniz split floresan proteinler kullanır. Caspase BiFC, prodomain (Pro) için ya da tam uzunlukta caspase N-terminal için yarı erimiş (Venüs-N) ve C-Terminal yarısı Venüs'ün (Venüs-C). Monomeric durumlarında caspase füzyon protein flüoresan değildir. İşe Alım için PIDDosome gibi bir harekete geçirmek platformu üzerine burada gösterildiği gibi iki yarıyı da Venüs'ün Derneği artış Venüs Floresans ölçülür indüklenen caspase yakınlık gösteren uygulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ekran histogram kullanarak doygunluk tanımak için temsili resim. En iyi (üst paneli) ve doymuş sinyalleri (alt paneli) örnekleri gösterilir. Venüs (sarı tepe) ve RFP (kırmızı tepe) sinyalleri gösterilir. X ekseni yoğunluğu gösterir ve y ekseni sayı piksel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: DNA hasar takip Caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC). Caspase-2 BiFC bileşenleri ifade Hela hücreleri tedavi edilmemiş (A) yaptı veya camptothecin (100 µM) ile tedavi (B) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. mCherry co floresan muhabir olarak ifade edilir. Temsili resim caspase-2 BiFC (Yeşil) hücrelerdeki 16 h tedavi aşağıdaki camptothecin tedavi ile hücreleri (kırmızı) gösterir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) lokalizasyonu. Caspase-2 BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir ifade Hela hücreleri qVD-OPH varlığında (20 µM) camptothecin (20 µM) ile tedavi edildi. 3D rekonstrüksiyonlar oluşan görüntülerden 0,1 mikron seri confocal- z-hücre boyutunda 24 h sonra yapılmış ve çekirdek yeşil kırmızı ve caspase-2 BiFC gösterir. Sol panelinde 3D maksimum yoğunluk projeksiyon işleme yeniden gösterir (Ayrıca bkz: film 1). Doğru kapı aynası aynı hücreyi dikey dilimleri görünümünü gösterir. Orta (mavi) xy düzlemi kutusudur, sağdaki kutu (sarı) yz uçak ise üstteki kutuda (beyaz) xz uçak. Yz ve xz uçaklar göre çapraz çizgileri kesiştiği. Ölçek çubukları temsil 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: hızlandırılmış caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC), (A) caspase-2 BiFC bileşenleri ile LN18 glioblastoma hücreleri transfected ve bir kırmızı floresan mitokondrial marker (DsRed-mito, kırmızı) bortezomib ile tedavi (15 nM) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. Hücreleri üzerinde 37 ° C'de confocal mikroskop yerleştirildi ve görüntüleri 8 h. görüntüleri için her 2 dk temsilcisi hücre iki caspase-2 BiFC bileşenleri indüklenen yakınlığı artış Venüs floresan ( sonuçlanan hızlandırılmış show dan alındı Yeşil) Zaman içinde. (B) Venüs, her zaman bir noktada her hücrede ortalama yoğunluğu ölçüldü. Venüs Floresans bortezomib tedaviden sonra zamanla arttı. Tedavi edilmemiş kontrol bölümü lazer ışık (şekil 20' den uyarlanmıştır) şartlarından düşük veya ihmal edilebilir toksisite belirtti. Ölçek çubukları temsil 20 µm. hata çubukları temsil standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) 8 (kontrol) ve 14 (bortezomib) tek tek hücreleri (Ayrıca bkz: Movie 2). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Plaka boyutu | Hücre sayısı | Medya hacmi |
| 6 iyi plaka | 1 x 105 hücreleri / iyi | 2 mL |
| 12 iyi plaka | 5 x 104 hücreleri / iyi | 1 mL |
| 24 iyi plaka | 2. 5 x 104 hücreleri / de | 0.5 mL |
| 4 odası çanak | 2. 5 x 104 hücreleri / Oda | 1 mL |
| 8 odası çanak | 1,25 x 104 hücreleri / Oda | 0.5 mL |
Tablo 1: hücre plaka numaraları için yönergeleri. Stabil caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) bileşenleri ifade hücreleri kullanıyorsanız, burada gösterilen tutarlar çift plaka.
| Plaka boyutu | Transfection reaktif | İndirimli serum medya | Muhabir plazmid | Caspase-pro VC plazmid | Caspase-pro VN plazmid | İndirimli serum medya plazmid karışımı eklenir | Transfection reaktif çözüm plazmid karışımı eklenir | Serum boş ortam hücrelere eklendi |
| 6 iyi plaka | 12 µL/plaka | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | Toplam 100 µL | 100 ΜL | 800 ΜL |
| 12 iyi plaka | 12 µL/plaka | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | Toplam 50 µL | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24 iyi plaka | 12 µL/plaka | 750 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | Toplam 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 4 odası çanak | 4 µL/plaka | 250 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | Toplam 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 8 odası çanak | 4 µL/plaka | 250 ΜL | 1,25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | Toplam 12.5 µL | 12.5 ΜL | 100 ΜL |
Tablo 2: geçici transfection için kullanılan reaktifler hacimleri önerilir. Not: plazmid önerilen miktarı yalnızca bir başlangıç noktasıdır. Sinyal tespit edilirse, bu 20-200 ng 6-şey plaka kuyu başına gelen plazmid titre tavsiye edilir.
| Caspase | Tedavi | Konsantrasyon | Zaman | Beklenen sonuçları |
| Caspase-1 | Aşırı ifade ASC | 250 ng/iyi 6 iyi plaka | 48 h | % 50 BiFC pozitif |
| Caspase-2 | Aşırı ifade RAIDD | 500 ng/iyi 6 iyi plaka | 24 h | % 90 BiFC pozitif |
| Camptothecin | 100 ΜM | 16 h | % 30-60 BiFC pozitif | |
| Isı şok | 1s 45 ° c | 16 h | % 80 BiFC pozitif | |
| Caspase-4 | Overexpressed NALP1 | 250 ng/iyi 6 iyi plaka | 48 h | % 30 BiFC pozitif |
| Caspase-5 | Overexpressed IPAF | 250 ng/iyi 6 iyi plaka | 48 h | % 15 BiFC pozitif |
Tablo 3: caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) için olumlu denetim örnekleri. Beklenen sonuçlar ve koşulları temel alan üzerinde yayımlanan veri Pro kullanarak 14,17,18oluşturur. Ortak ifade plazmid BiFC plazmid (Adım 2.1.4) transfected
Film 1: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) 3D yerelleştirme. 3D yeniden yapılanma, döndürülmüş y-eksen- zconfocal görüntülerin-boyutunda bir Hela hücreleri ifade caspase-2-BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir için 16 h camptothecin (20 µM) ile tedavi. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve çekirdek (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Movie 2: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC), hızlandırılmış. LN18 glioblastoma hücreleri caspase-2 BiFC bileşenleri ile transfected ve bortezomib ile tedavi (15 nm) her 2 dk 8 h için görüntüsü. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve mitokondri (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı split floresan proteinler indüklenen caspase yakınlık ölçmek için kullanmayı açıklar. Çünkü çok zeki, çok photostable ve refolding hızlı 13olduğunu Split Venüs bu teknik için seçildi. Böylece, indüklenen caspase yakınlık refolding Venüs analizini caspase protein etkileşim dynamics gerçek zamanlı tahminler yakın sağlayabilir. Venüs iki biraz örtüşen parçalara, Venüs (Venüs-N veya VN) oluşan amino asitler 1-173 N terminus ayrılır ve C terminali parçası (Venüs-C veya VC) oluşan kalıntılar 155-239. Diğer bölme floresan proteinler vardır ancak bölünmüş mCherry gibi bazı en fazla 2 saat 21refolding için kuluçka 4 ° C'de iste. Ek bölünmüş floresan proteinler de dahil olmak üzere bölünmüş Cerulean (camgöbeği floresan protein bir versiyonu) ve çok kırmızı bölünmüş mLumin henüz bu bağlam 13,22yılında test edilecek. Sonuçta, bu floresan bu proteinler indüklenen caspase yakınlık ölçmek için uygun kanıtlamak durumunda, birden fazla caspases aynı anda değerlendirme için izin verebilir.
Genel olarak, caspase prodomain (Pro) bölgenin split floresan parçaları eritilmiş olan. Bu bölge caspase harekete geçirmek platforma bağlamak için gereken en az kısmı içerir ve kart veya DED etkileşim motifi kapsar. Prodomain kullanmanın avantajı herhangi bir enzimatik aktivite hücrelere tanıtmak değil mi. Bu eşzamanlı endojen caspase nedeniyle aşağı akım olayların izlenmesi için izin verir. Araştırmalar bugüne kinetik ve yerelleştirme caspase BiFC prodomain ve tam uzunlukta caspase 14arasındaki farkı az göstermiştir. Ancak, tam uzunlukta yapıları transfection plazmid DNA artan miktarda gerektiren daha düşük verimlilik ile hızlı eğilimindedir. Buna ek olarak, bu ifade üzerine apoptosis caspase kaynaklı önlemek için bir serin için katalitik sistein değişmek için tavsiye edilir. Bu sakıncaları rağmen bazı araştırmalar tam uzunlukta BiFC çift caspase indüklenen yakınlık varlığı ya da yokluğu katalitik etki alanları içinde farklılıkları içerik bağımlı olup olmadığını belirlemek için eş zamanlı analiz gerektirir.
Bu HeLa hücreleri için özel olarak adapte iletişim kuralıdır. Aynı iletişim kuralını de meme Karsinomu hücre kültürünü, MCF-7, glioblastoma hücre kültürünü, LN18 ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF) de dahil olmak üzere ek yapisan hücre satırları için çalışır. Bu kullanıcı transfection ve kaplama koşullar ne zaman yeni bir hücre türü için bu protokolü adapte optimize eder tavsiye edilir. Hücreleri değerlendirmek için kullanılan iki ana mikroskobu yaklaşım protokolünü açıklar: epifluorescence ve confocal mikroskobu. Confocal mikroskobu ile birlikte kullanılan yüksek sayısal diyafram hedefleri çoğunluğu plastik tabak veya cam slaytlara kalınlığı nüfuz değil çünkü hücreleri confocal mikroskobu kullanırken, cam coverslips üzerinde kaplama gerekir. Böylece, bu yemekler 0,17 mm en iyi coverslip kalınlığı olan katıştırılmış No 1.5 cam coverslips ile kullanmak için tavsiye edilir. Bu yemekler farklı türde bir dizi kullanılabilir odası slaytlara standart ölçü çok iyi plakaları ile bireysel 3 cm yemekleri, o arasındadır. Tablo 1 ve 2 farklı iyi boyutlarda kaplama ve transfection talimatı uyum için izlenecek verilmiştir. Epifluorescence için burada açıklanan Yani Imaging (4.1), standart plastik doku kültürü tabaklara yeterli mikroskop uzun pası hedefleri ile donatılmıştır sürece.
Çünkü bu yaklaşım etkili caspase harekete geçirmek ölçüm için bir "ışık" yöntemi, floresan muhabir eklenmesi görselleştirme hücre önce veya yokluğunda caspase muhabir aktivasyonu, izin ve belirlemek için önemlidir transfected hücreleri, geçici transfection kullanıldığında. Farklı gazetecilere bir dizi kullanılabilir ve bir seçerken sadece kriterleri vardır: 1) böylece kolayca görüntüleme iletişim kuralı tarafından; tespit edilebilir fluorophore yeterince parlak ve 2) Floresan, spektrum, YFP ile örtüşmüyor. Örneğin, YFP filtre veya Venüs algılamak için kullanılan lazer tarafından tespit edilebilir çünkü yeşil flüoresan protein (GFP) muhabir olarak kullanılmamalıdır. İki fluorophores spektral çakışma nedeniyle bu. Belirli bir organel yerelleştirir bir fluorophore seçerek ek nitel bilgi sağlayabilir. Örneğin, bir protein hedefleri gibi kırmızı floresan protein DsRed-mito, mitokondri hücrenin genel canlılığı üzerinde ek bilgi sağlayabilir kullanın. Mitokondri parçalanma (füzyon) erken aşamalarında hücre ölümü 23 geçmesi eğilimindedir ve bu DsRed-mito gibi bir gazeteci ile görüntülenmeyecektir. Bir muhabir olarak bir organel işaretleyici kullanımı da caspase yapılması BiFC hücre altı yerelleştirme hakkında sonuçlar izin verebilirsiniz.
Caspase BiFC veri elde ve analiz yolları vardır. Kullanılacak yöntem parametreleri tarafından keşfedilmeyi karar verilecek karar (bitiş noktası nüfus analizi tek hücre pozisyonel veya Kinetik bilgi karşı) ve araçları ve düşsel bilgisayar yazılımı. Bu iletişim kuralı bir caspase tek zaman puan ve hızlandırılmış veri edinme için BiFC deney sonuçlarını toplamak için birkaç mikroskop tabanlı yaklaşım özetlenmektedir. Ancak, unutulmamalıdır ki varyasyonları ve yaratıcı caspase etkinleştirme yolları sorguya çekmek için kullanılmak üzere bu yaklaşımlar kombinasyonları bir dizi.
Veri toplama (4.1) caspase hücrelerle yüzdesini belirlemek için kullanılan tek zaman noktası yakınlık bir seferinde noktada indüklenen. Bu iletişim kuralı için bir sadece Venüs-pozitif olan transfected hücreleri sayar. Böylece, son derece özel ekipman gerekli değildir ve yalnızca en temel epifluorescence mikroskop GFP (veya YFP) ve RFP filtre ve bir el taksitli sayaç gereklidir. Otomatik olarak görüntüleri bir dizi sayısı bir tabak kuyu almak için bazı görüntüleme sistemleri otomatik hale getirilebilir. Bu tür araçları varsa, alınan görüntüleri hücrelerde görsel denetim tarafından benzer şekilde sayılabilir veya görüntüleme yazılımı kullanarak quantitated. Üç boyutlu görüntüleme (4,2) caspase BiFC Fokal uçaklar hücre boyunca yüksek çözünürlüklü görüntüleri sağlar. Venüs ve RFP (veya seçilen transfection muhabir) heyecanlandırmak lazerler ile confocal mikroskop ve Z-yığın yetenekleri gereklidir. 3D render yazılım modülleri bir dizi kullanılabilir verileri görselleştirmek için çeşitli yollar sağlar. Analiz bu her iki türü için hücreleri ve görüntü düzeltmek veya daha sonraki bir aşamada değerlendirmek mümkündür. Ancak, fiksasyon işlemi eserler için analiz ekleyebilirsiniz Venüs sinyal azaltmak ve bu nedenle bu yaklaşım tavsiye edilmez. Hızlandırılmış görüntüleme (4.3) caspase BiFC aynı anda kinetik ve Konumsal Analiz sağlamak için kullanılabilir. Motorlu bir sahne ile donatılmış bir mikroskop çoklu konumlarını görüntülerini almak ve hatta farklı tedavi gruplarında aynı deneyi karşılaştırmak için ayarlanabilir.
İçin hızlandırılmış, bir dizi dikkat edilecek diğer noktalar dikkate alınmalıdır. Lazer Işık eserler fototoksisite veya photobleaching nedeniyle neden olabilir ve her ikisi için kontrol edilmesi gerekir. Genel olarak, her ikisi de ışık (giriş düşük yüzde lazer güç ve kısa pozlama zamanlarda adımları 4.3.6-4.3.7) olası en düşük miktarda kullanarak önlenebilir. Lazer ışık ölüm hücreleri indükler ve için aynı koşullar altında tedavi edilmezse hücreleri görüntüleme ve o hücre bölünmesi normal olarak devam eder onaylayarak kontrol edilebilir ne zaman fototoksisite sonuçlar. Photobleaching oluşur ne zaman birden fazla görüntüyü aynı hücre alınan Floresans azalır. Venüs floresan protein oldukça photostable, bu nadiren bir sorun uygulamada bu yüzden. Photobleaching etkileri bir Venüs-pozitif hücrenin çok sayıda sıralı fotoğraf çekmek ve floresan kararlı kalmasını sağlamak belirlenebilir. Aynı lazer güç ve Pozlama ayarları her deneme için kullanılan sürece bu yalnızca bir kez yapılması gerekiyor. Etkileri fototoksisite veya photobleaching nedeniyle yakalanan görüntüleri toplam sayısını azaltarak da azaltılabilir. Bu uzatma veya görüntüleri (Adım 4.3.9) arasındaki zaman aralığını kısaltmak tarafından sağlanabilir. 5-10 dk aralıklarla üzerinde bir 16 h hızlandırılmış kullanarak başlamak için iyi bir yer olduğunu. Hiçbir photoxicity gözlenen veya daha kısa süreli deneyler gereksinim duyulduğunda, çerçeveler arasındaki aralığı azaltılabilir. Caspase etkinleştirme hızlı ise, daha kısa zaman aralıkları ile daha kısa deneyler kullanılabilir. Örneğin, 10 dk aralıklarla 16 h deneme için (96 her fluorophore için) Toplam 192 görüntülerin alınacaktır. 1,5 m aralıklarla 2 h deneyi 160 fotoğraf ortaya çıkarır. Bu nedenle, uzun ve kısa deneyler her lazer ışık benzer toplam tutarlar için hücreleri göstermek. Kısa süreli deneyler için uyarıcı aktive caspase zaman hata yakalama inisiyasyon (sonra adım 3 adımda 4.3.11 yerine) hemen önce basına doğrudan eklenebilir. Bunu yapmak için plaka kapağını kaldır ve yavaşça bir pipet kullanarak uyarıcı içeren bir çözüm bırakın. Plaka dürtükleme ve hızlı bir şekilde hücreleri hala içinde odak devam etmeden önce olup olmadığını kontrol için dikkat ediniz.
Zaman zaman hata deneyler yürüten, ayrıca hücre acil çevre doku kültürü kuluçka makinesi olan çok benzeyen emin olmak önemlidir. Çevresel kontroller birkaç farklı mikroskop setinde bulunur ups. Bunlar daha küçük sahne en iyi kuluçka yanı sıra tüm mikroskop kapsülleyen çevre Chambers'ı içerir. Bu cihazların her ikisi de genellikle ısı, CO2ve nem odası tam olarak kontrol edilebilir bir şekilde teslim. Çünkü beklenmedik sıcaklık dalgalanmaları odak kayması ve CO2 yokluğu yol açabilir hücrelere toksik olabilir yükselmeye ortam pH neden CO2 ve sıcaklık hassas kontrol deney başarısı için önemlidir. CO2 kaynak yoksa, medya (bkz. Adım 3.1.1) Hepes eklenmesi tarafından arabelleğe alınabilecek. CO2 kaynağı kullanılabilir olsa bile, Hepes görüntüleme aracı olarak hücreleri sağlıklı tutmak için ekstra bir ölçü birimi eklemek için tavsiye edilir. Ancak, Hepes varlığında bile, CO2 uzun bir süre için yokluğu hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, aynı koşullar ve ortam pH dengeli kalmıştır emin olmak için deney ve sonuç rengini altında görüntüsü tedavi edilmezse hücreleri incelemek önemlidir. O fenol red autofluorescence Venüs sinyal için katkısını çok az olduğu için bu protokol için kullanılan ortamı hiçbirini ihmal edilebilir gerekmez unutmayın.
Bir zaman atlamalı deneme sonucu görüntüleme verileri çözümlemek için kullanılabilir yöntemleri vardır. Venüs piksel transfected hücre başına ortalama yoğunluğu ölçme indüklenen caspase yakınlık zamanlaması analiz etmek için en kolay yoludur. Şekil 3, şekil 4, şekil 5' te gösterildiği gibi caspase-2 BiFC çoğu zaman farklı hücre altı bölmeleri içinde yer alan bir veya daha fazla puncta olarak görünür. Analiz görüntüleme foci, nesne boyutu veya ek benzer etkenler ölçü sayıları bu yapılar hakkında bilgilendirici nicel veriler getirebilecek yaklaşıyor. Tüm caspase BiFC puncta görünür. Örneğin, inflamatuar caspases diffüz Floresan, ipliksi yapılar ve tek veya birden çok puncta hücre 18ücret dahil olmak üzere farklı BiFC desenlendirme göstermiştir. Bu modellerin yanı sıra ters yönde aktive sinyalleri aktif caspase bağımlı. Bu nedenle, hızlandırılmış sonuçları için en uygun analiz türü büyük ölçüde görülmektedir floresan desenlendirme türü tarafından dikte.
Çoğu zaman bu iletişim kuralını kullanan apoptosis analiz caspase doğrudan veya dolaylı olarak farklı hücre ölüm yolu ilgi çekici tarafından teşvik değerlendirilir tedavi uyaranlara. Bu küçültmek ve hücreleri görüntü çok zor ve caspase-BiFC belirli herhangi bir yerelleştirme belirlemek neredeyse imkansız kılan tabaktan ayırmak hücreleri neden olur. Pan-caspase inhibitörü eklenmesi bu hücre ölümüne engel olur. Caspases onların harekete geçirmek platformları ve ilişkili caspase alımı BiFC caspase katalitik faaliyete bağımlı değildir. Bu nedenle, caspase inhibisyon bu adımı üzerinde hiçbir etkisi olmaz, ancak plazma zarı bütünlük içinde blebbing, dekolmanı ve nihai kaybı gibi Apoptozis aşağı akım fiziksel özellikleri yapılmasını engeller. Böylece, bitiş noktası analizi (Adım 4.1) veya Z yığınları (Adım 4.2) taşıyor, bir caspase inhibitörü eklenmesi önemlidir. MOMP, annexin V bağlama (phosphatidyl serin pozlama algılamak için) veya propidium iyot alımı (plazma zarı permeabilization algılamak için) gibi Apoptozis ile ilgili olaylar caspase BiFC, analiz edilecek ise buna ek olarak, hızlandırılmış deneyler için caspase inhibitörü inhibisyon bu olayları önlemek için göz ardı edilmelidir. Caspase inhibitörü qVD-OPh (10-20 µM) gibi Apoptozis indükleyici uyarıcı (Adım 3.1.1) içeren medya eklenmelidir. Eğer bir pro-apoptotik protein caspase BiFC bileşenleri ile birlikte ifade, caspase inhibitörü 2.1.12 adımda eklenmelidir.
Caspase BiFC caspase etkinleştirme yolları canlı hücrelerdeki olaylarda görselleştirmek için kullanılan birkaç mevcut yöntemlerden birini olmakla birlikte, bir dizi dikkat edilmesi gereken noktalar bu deneyler tasarlarken dikkate alınmalıdır. Bu yaklaşım overexpression tabanlı olduğu için denetimleri özgüllük için önemlidir. Bu iki yoldan biriyle gerçekleştirilebilir. İlk olarak, tek nokta mutasyonlar giriş kartı veya DED caspase ile onun harekete geçirmek platformu arasındaki bozabilir öyle ki prodomain caspase caspase BiFC yoğunluğu ve Venüs-pozitif yüzdesi azaltmak gerekir hücreleri. Örneğin, mutasyon içinde prodomain caspase-1 e D59 kalıntı adaptör protein ASC (bir kart içeren Apoptozis ile ilişkili leke gibi protein) bağlama bozan ve eşit ASC kaynaklı caspase-1 BiFC 18,24 bozan . İkinci olarak, caspase harekete geçirmek platformu için recruit adaptör protein eksik olan hücreleri kullanımı belirli BiFC sinyalleri azalacak. Bu elde eleme hücreleri, varsa ya da siRNA kullanarak olabilir veya CRISPR/Cas9-tabanlı yaklaşımlar adaptör hücrelerinin tüketmek. Buna göre caspase-2 adaptör protein RAIDD tükenmesi tamamen caspase-2 BiFC ısı şok ya da DNA hasarı 14,17tarafından indüklenen engelledi. Bu deneyler için eleme veya devirme hücreleri eşleşen kontrol hücreleri (yani vahşi tipi çöp eşlemeli MEF veya denetim devirme hücre) ile karşılaştırılması gereken ve yeni bir hücre satır kullandıysanız, en iyi transfection koşullar eşit emin olmak için tabi BiFC muhabiri hücre hatları üzerinden ifadesidir.
Bu yaklaşımın ikinci bir sınırlama geçici transfection kullanırken, bu her hücre her protein eşit miktarda ifade sağlamak zor olmasıdır. Eşit olmayan ifadesiyse, Venüs parçası, daha yüksek frekanslarda platformu işe. Bu tam floresan sinyal maske ve yanlış olumsuz sonuçlara neden olabilir. Bu sorunu çözmek için caspase BiFC muhabir istikrarlı hücre satırı üretimi için yeni bir sürümünü en son bildirilen 17yaşındaydım. Bu yeni sürüm C2 Pro-BiFC bileşenleri viral 2A kendi kendine sıyırmada peptid 25tarafından ayrılmış bir tek açık okuma çerçevesi üzerinde ifade edilen bir yapı oluşuyordu. Bu nedenle, BiFC bileşenleri aynı organizatörü üzerinden tek bir mRNA olarak transkripsiyonu ama VC ve VN füzyon protein stoichiometrically eşit miktarda üretmek için tercüme. Stabil bu yapıyı ifade etmek için oluşturulan hücre hatları benzer eğilimler etkinleştirme için geçici ifade gazetecilere gösterdi ama hem daha hassas hem görüntülenen alt arka plan floresan. Bu nedenle, yukarıdaki Protokolü büyük ölçüde stabil caspase BiFC bileşenleri hızlı muhabiri hücre hatları ile kullanıldığında basitleştirilebilir.
Güncel verileri caspase BiFC bileşenleri ve endojen proteinler arasında en az girişime göstermektedir. Örneğin, caspase-2 olduğu bilinmektedir harekete geçirmek akıntıya karşı MOMP, ama caspase-2 BiFC MOMP 14ilerlemesini blok değildir. Böylece, bu gazetecilere bir baskın olumsuz biçimde davranmaya görünmez. Ancak, aynı anda karşıdan akış olaylarını değerlendirirken, bu deneyler her küme içinde araştırılmalıdır. Bir denetim de deneyde transfected de dahil olmak üzere bu yaklaşım için en iyi yoldur. Kinetik hücre ölümü ile veya olmadan ifade caspase sensörünün değişmeden iseniz, bu caspase-BiFC bileşenleri endojen işleviyle engel olmamasını gösterecektir. Diğer taraftan, endojen caspase muhtemelen BiFC okuma verimlilik veya boyutunu veya şeklini yapıları etkileyebilir. Muhabir hücrelerdeki caspase için eksik ifade bunun için kontrol edecek.
Bu sınırlamaları rağmen caspase BiFC tekniği tamamlayan ve hatta başlatıcı caspase harekete geçirmek ölçmek için varolan yaklaşımlar geliştirmek caspase etkinleştirme yolları sorguya çekmek için kullanışlı bir yöntemdir. Ölçüm indüklenen yakınlık, harekete geçirmek, ilk adımda tarafından bu teknik caspase auto harekete geçirmek ile ilişkili işleme gibi sonraki adımlarında ölçme ile ilgili sorunları üstesinden gelir. Örneğin, Batı leke Cellat caspases bölünme izlemek için kullanırken, caspase-3 caspase-7, sağlar ve harekete geçirmek 2caspases kusurlu başlatıcı için aynı yaklaşım kullanarak, doğru bir ölçü. Başlatan caspases, bölünme değil harekete geçirmek 4,26,27için yeterli olmasıdır. Aslında, pek çok başlatıcı caspases sırasında apoptosis caspase-3 tarafından etkin enzimler 28üretmeden i ciddi. Benzer şekilde, belirli caspases için hedef olarak tasarlanmış peptid yüzeylerde kullanımına dayalı teknikler bu dizilere caspases 29örtüşen özelliklerine dikkate almak gerekir. Bu tür yaklaşımlar caspase harekete geçirmek ölçmek için kullanılamaz, ama sakıncaları sonuçlarını yorumlarken kabul anlamına gelmez. Caspase BiFC daha geleneksel yöntemleri kullanarak sonuçları onaylamak yardımcı olabilecek alternatif bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, gerçek zamanlı olarak caspase harekete geçirmek kompleksleri Meclisi izlemek ve belirgin boyut, şekil ve kompleksleri yerelleştirilmesini belirlemek için başka yollarla değerlendirmek mümkün değildir bu tekniğin önemli bir avantaj yeteneğidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu tekniğin gelişimine katkıda bulunan tüm önceki üyeleri Bouchier-Hayes laboratuvar kabul etmek istiyoruz. Bu eser kısmen bir Texas Çocuk Hastanesi Pediatrik Pilot Ödülü LBH tarafından finanse edildi. Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Teksas) ekibi ile işbirliği içinde yayımlanan verileri eklemek izin için teşekkür ediyoruz. Açıklanan reaktifler gelişimi NIH (NIAID P30AI036211, ncı P30CA125123 ve NCRR S10RR024574) ve Joel M. Sederstrom yardımıyla fon ile sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J.
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S.
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M.
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
