Summary
Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.
Abstract
La famille de caspase des protéases joue un rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée. Parmi ceux-ci, un sous-groupe appelé initiateur caspases sont les premiers à être activées dans ces voies. Ce groupe comprend caspase-2, -8 et -9, ainsi que les caspases inflammatoires, caspase-1, -4 et -5. Les caspases initiateur sont tous activés par dimérisation suivant l’embauche à des complexes multiprotéiques spécifiques appelées plates-formes d’activation. Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une approche axée sur l’imagerie où se sépare des protéines fluorescentes fondues à détonateur caspases sont utilisées pour visualiser le recrutement des caspases initiateur à leurs plates-formes d’activation et de la proximité induite. Cette fluorescence fournit une lecture de l’un des premiers étapes requises pour l’activation des caspases initiateur. À l’aide d’un certain nombre de différentes approches axées sur la microscopie, cette technique peut fournir des données quantitatives sur l’efficacité de l’activation de la caspase sur une échelle de la population ainsi que la cinétique de l’activation de la caspase, la taille et le nombre d’activation des caspases complexes sur une base par cellule.
Introduction
La famille de protéases de caspase est connue pour leur rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée 1. En raison de leur importance, déterminer quand, où et comment efficacement des caspases sont activés peut apporter un éclairage crucial sur les mécanismes de la caspase voies d’activation. Le protocole de base d’imagerie décrit ici permet la visualisation des premières étapes dans la cascade d’activation de la caspase. Cette technique tire parti des interactions dynamiques : la protéine cette activation de caspases en voiture.
Les caspases peuvent être divisés en deux groupes : les caspases initiateur (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12) et les caspases bourreau (caspase-3, -6 et -7). Les caspases bourreau sont présents dans la cellule comme dimères préformés et sont activés par un clivage entre la grande et petite sous-unité 2. Lorsqu’il est activé, ils fendent de nombreuses protéines structurelles et réglementaires, aboutissant à l’apoptose 3. Les caspases initiateur sont les caspases premières pour être activé dans une voie généralement déclencher l’activation des caspases bourreau. Contrairement au bourreau caspases, initiateur caspases sont activés par dimérisation 4,5. Cette dimérisation est facilitée par le recrutement de monomères inactifs pour spécifique grand poids moléculaire complexes appelées plates-formes d’activation. Assemblée des plates-formes d’activation est régie par une série d’interactions de protéine : protéine spécifique. Ceux-ci sont médiés par des motifs d’interaction protéine conservée présents dans le proform de la caspase initiatrice et incluent le domaine mort (DD), le domaine effecteur de mort (DED) et la caspase recrutement domaine (carte) 6 (Figure 1 a). Plates-formes d’activation incluent généralement une protéine réceptrice et une protéine adaptatrice. Habituellement, le récepteur est activé lors de la liaison d’un ligand, induisant un changement conformationnel permettant l’oligomérisation de nombreuses molécules. Le receveur recrute alors soit la caspase directement ou les molécules d’adaptateur qui à son tour apportent la caspase au complexe. Ainsi, les nombreuses molécules de caspase entrent en proximité permettant une dimérisation. Ceci est connu comme le modèle de proximité induite par 7. Une fois que les mélanges, la caspase subit une autoprocessing, qui sert à stabiliser l’enzyme active 4,8. Par exemple, l’Assemblée de l’apoptosome Apaf1 est déclenchée par le cytochrome c, suite à sa sortie de la mitochondrie dans un processus appelé la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP). Apaf1 recrute à son tour caspase-9 grâce à une interaction qui est véhiculée par une carte présente dans les deux protéines 9. Résultat des interactions protéine similaire dans l’Assemblée de la mort CD95 induisant la signalisation complexe (disque) qui mène à l’activation de la caspase-8 ; le PIDDosome, qui peut activer la caspase-2 ; et divers complexes inflammasome qui initie l’activation de la caspase-1 10,11,12. Ainsi, initiateur caspases sont recrutés aux plates-formes d’activation spécifique par un mécanisme commun aboutissant à proximité induite et une dimérisation, sans laquelle activation ne se produira pas.
Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une analyse axée sur l’imagerie qui a été développée pour mesurer cette première étape de l’activation des caspases initiateur, ce qui permet une visualisation directe de la proximité de caspases induite par suite de plateforme d’activation Assemblée. Cette méthode tire parti des propriétés de la protéine fluorescente split Venus. Vénus est un plus brillant et plus version photostable de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui peut être séparé en deux fragments non fluorescent et légèrement superposées : l’extrémité N-terminale de Vénus (Venus N ou VN) et l’extrémité C-terminale de Vénus (Venus C ou VC). Ces fragments conservent la possibilité de replier et devient fluorescent lorsqu’à proximité 13. Chaque fragment de Vénus est fusionnée à la prodomain de la caspase, c'est-a-dire la portion minimale de la caspase qui se lie à la plateforme d’activation. Cela garantit que les caspases ne conservent pas l’activité enzymatique et par conséquent une analyse concomitante des événements en aval associés aux événements endogènes est possible. La Vénus des fragments repli quand les caspase prodomains sont recrutés à la plateforme d’activation et subissent une proximité induite. (Figure 1 b). La fluorescence de Vénus qui en résulte peut être utilisée avec précision et plus particulièrement surveiller la localisation subcellulaire, la cinétique et l’efficacité de l’Assemblée d’initiator caspase activation plates-formes dans des cellules individuelles. Données d’imagerie peuvent être acquises par microscopie confocale ou par microscopie de fluorescence standard et peut être adaptée à un certain nombre d’approches différentes de la microscopie, y compris : imagerie Time-lapse pour suivre l’activation de la caspase en temps réel ; imagerie à haute résolution pour des déterminations précises de localisation sous-cellulaire ; et la quantification de point de terminaison de l’efficacité de l’activation.
Cette technique a été développée afin d’étudier l’activation de la caspase-214. Tandis que la plate-forme d’activation de la caspase-2 est considérée comme le PIDDosome, composé du récepteur PIDD (induite par la p53 protéine avec un domaine de mort) et l’adaptateur RAIDD (protéines homologues RIP-associated ICH-1/CAD-3 avec un domaine de mort), Activation de caspase-2 PIDDosome-indépendant a été signalée. Ceci suggère que les plates-formes d’activation supplémentaire pour caspase-2 existent 15,16. Malgré ne connaissant pas les composants complètes de la plate-forme d’activation de la caspase-2, la caspase BiFC technique a laissé pour interrogatoire réussie des voies de signalisation caspase-2 au niveau moléculaire 14,17. Nous avons également adapté ce protocole pour les caspases inflammatoires (caspase-1, -4, -5 et -12) 18 et, en principe, la même approche devrait être suffisante pour analyser de la même façon chacun des caspases initiateur restants. Ce protocole pourrait de même être adapté pour étudier d’autres voies ont été dimérisation est un important signal activant. Par exemple, les protéines STAT sont activés par dimérisation après phosphorylation par Janus kinase (JAK) 19. Ainsi, le système de BiFC pourrait servir à visualiser pour activation STAT ainsi que plusieurs autres sentiers réglementés par des interactions de protéine dynamique. Le protocole suivant fournit des instructions détaillées pour la mise en place des journalistes dans les cellules, ainsi que des méthodologies d’analyse et d’acquisition d’images.
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Protocol
1. préparation des cellules et Pétri
Remarque : Effectuez les étapes 1 à 3 dans une hotte à flux laminaire vitroplants. Porter des gants.
- Si vous utilisez des plats en verre bas, enduire le verre avec la fibronectine. Passez à l’étape 1.2 Si vous utilisez des plats en plastique.
- Préparer une solution à 0,1 mg/mL de la fibronectine : Diluer 1 mL de 1 mg/mL de solution de la fibronectine dans 9 mL de solution 1 PBS X.
- Tapissez le fond de verre de chaque puits avec 0,5 à 1 mL de la fibronectine et incuber pendant 1 à 5 min à température ambiante.
- À l’aide d’une pipette, recueillir la solution de la fibronectine et conserver à 4 ° C.
Remarque : La solution de la fibronectine peut être réutilisée plusieurs fois. - Laver le verre une fois avec 1 à 2 mL 1 X PBS et aspirer au large de PBS.
- Plaque de 1 x 105 cellules / puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL des milieux de culture de cellule appropriée (voir tableau 1 pour le nombre de cellules à utiliser pour les puits de tailles différentes). Si vous utilisez une ligne de cellules exprimant stablement les composants de BiFC caspase (voir Discussion), plaque 2 x 105 cellules et passez à l’étape de traitement (étape 3).
- Permettre aux cellules d’adhérer au plat du jour au lendemain à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus.
2. la transfection des cellules d’introduire les composants de BiFC caspase
- Transfecter les cellules avec le réactif de transfection approprié.
Remarque : Ce protocole décrit le mode de Lipofectamine 2000, qui a été optimisé pour toxicité minimale. Ce protocole a été utilisé avec succès dans les cellules Hela, les cellules MCF7 et les cellules LN18. Si vous utilisez des réactifs de transfection suivent les instructions du fabricant et optimiser selon les besoins.- Ajouter 12 µL de réactif de la transfection à 750 µL des médias réduit de sérum dans un tube stérile.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 10 ng d’un plasmide de journaliste (un plasmide codant pour une protéine fluorescente, par exemple rouge fluorescent protéine [DP], qui étiquettera les cellules transfectées) dans un tube stérile de 1,5 mL pour chaque puits à transfecter.
- Ajouter 20 ng de chaque plasmide de BiFC caspase (p. ex., 20 ng de caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC et 20 ng de C2 Pro-VN) dans chaque tube (tableau 2).
- Aligner chaque tube atteignant un volume total de 100 µL en ajoutant des médias sérum réduit.
- À l’aide d’une pipette de p200, ajouter 100 µL de solution de réactif de transfection de l’étape 2.1.2 au mélange plasmide d’une manière goutte à goutte.
- Incuber le mélange réactif de plasmide-transfection pendant 20 min à température ambiante.
- Aspirer les médias des cellules à l’aide d’une pipette ou avec aspiration et ensuite, à l’aide d’une pipette p1000, pipette 800 µL de médias libres sériques doucement sur le côté du puits.
- À l’aide d’une pipette de p200, ajouter 200 µL du complexe ADN-lipides goutte à goutte dans chaque puits.
- Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C pendant 3 h.
- Prenant soin de ne pas perturber la monocouche, retirez le support gratuit de sérum contenant des complexes ADN-lipides par aspiration à l’aide de dragues ou avec une pipette.
- Pipette de 2 mL de milieux de culture complet de pré chauffé (37 ° C) doucement sur le côté de chaque puits.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire pendant 24-48 h pour l’expression de protéines optimal.
3. induction d’activation des caspases
- Traiter avec un médicament ou un stimulus qui provoque la caspase activation environ 24 h après la transfection.
- Ajouter la concentration désirée de la drogue à préchauffé (37 ° C) supports d’imagerie (milieux de culture complet additionné de Hepes [20 mM, pH 7,2 à 7,5] et le 2-mercaptoéthanol [55 µM]) et mélanger doucement (tableau 3).
- Aspirer les médias des cellules à l’aide d’une pipette ou avec aspiration et ensuite, à l’aide d’une pipette, pipette de 2 mL de la solution de 3.1.1 doucement sur le côté du puits.
- Ajouter des médias d’imagerie sans la drogue à un puits comme un témoin non traité.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C à culture tissulaire ou passer à l’étape 4.3 pour une expérience de Time-lapse.
4. Acquisition de données de Caspase BiFC
-
Caspase BiFC pour l’acquisition de point seule fois
- Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente, suivant les instructions du fabricant.
- Trouver les cellules sous le filtre de la DP et mettant l’accent sur la fluorescence de gène de journaliste.
- À l’aide d’un compteur de main-tally, compter toutes les cellules DP-positifs dans le champ visuel. Notez le numéro.
- Tout en conservant le même champ visuel, basculez vers le filtre de la GFP (ou le filtre YFP si disponible) et, à l’aide d’un compteur de main-tally, compter le nombre de globules rouges qui sont aussi en vert (Vénus-positif). Basculer entre les deux filtres pour s’assurer que seules les hématies sont évaluées pour Vénus-positivité. Notez le numéro (Figure 3).
- Compter au moins 100 cellules DP positives de chacun des trois domaines individuels de la plaque.
- Dans chaque région, calculer le pourcentage de cellules transfectée Venus positif (c'est-à-dire les globules rouges qui sont aussi en verts). Moyenne des pourcentages qui en résultent pour obtenir l’écart-type.
-
Imagerie en trois dimensions de la caspase BiFC
- Allumez le microscope en suivant les instructions du fabricant et lancer le logiciel d’acquisition.
- Sélectionnez le x 60 ou 63 x, objectif huile et déposez une goutte d’huile sur l’objectif
- Placer le plat de la culture sur la platine du microscope en utilisant le support de plaque correcte.
- Soit une source de lumière épifluorescence et l’oculaire du microscope ou le laser confocal et l’écran de l’ordinateur, accédez à un champ d’intérêt.
- Mettre l’accent sur la fluorescence de journaliste en utilisant le laser de la DP ou le filtre.
- Si épifluorescence a été utilisée jusqu'à ce point, basculer la source lumineuse vers le laser confocal et visualiser l’image en direct des cellules comme acquises par la caméra et affiché par le logiciel d’acquisition sur l’écran de l’ordinateur.
- À l’aide de la commande joystick et la molette de mise au point, affiner la mise au point et la position des cellules pour que les cellules sont au centre du viseur. Choisir les cellules qui sont séparés les uns des autres et ne sont chevauchent pas.
- Entrée de la puissance de laser de pourcentage à 50 % et la durée d’exposition à 100 ms pour Vénus et DP comme point de départ pour déterminer les paramètres optimaux à utiliser pour l’expérience.
- Tourner sur la capture d’animaux vivants et d’inspecter l’image résultante et les histogrammes d’affichage qui l’accompagne pour les deux canaux.
- Si le signal est faible et que l’image est difficile à distinguer, porter le pourcentage laser puissance et/ou d’exposition par incréments jusqu'à ce que le signal dans l’image semble bon.
- S’assurer que le signal n’atteint pas la saturation. Inspecter l’histogramme de l’affichage pour vous assurer qu'un pic distinct est visible pour chaque fluor. Si le pic englobe l’affichage de l’histogramme ensemble, entrée laser puissance et exposition réglages inférieurs (Figure 2).
- Visualiser les cellules témoins (non traités ou non transfectées) dans les mêmes conditions pour que le signal soit spécifique.
NOTE : Unicolores transfectants peut également servir à contrôler pour crossover, mais si les signaux sont spatialement distinct (p. ex. mitochondriale et cytosolique) ce n’est pas nécessaire. - Sélectionnez ou ouvrez le module de pile de Z dans le logiciel de microscope.
- À l’aide de la molette de mise au point, proche de la position focale correspondant au centre de la cellule.
- Ajuster le focus dans une seule direction, jusqu'à ce que la cellule n’est plus visible, sélectionnez cette option dans la position supérieure.
- Ajuster la mise au point dans la direction opposée jusqu'à ce que la cellule ne soit à nouveau n’est plus visible et sélectionnez cette option, comme la position la plus basse.
- Choisissez la taille de palier optimale (habituellement environ 20 µm) et commencer l’acquisition pour demander à la caméra pour prendre automatiquement une image unique dans chaque canal, à chacune des 20 étapes µm entre les positions en haut et en bas.
- Logiciel de rendu 3D permet de reconstruire l’image 3D (Figure 4Movie 1).
-
Time-lapse imagerie de caspase BiFC
- Au moins 1 h avant l’expérience, mettre en marche le microscope et régler la température à 37 ° C.
- Sélectionnez le x 40, x 60 ou 63 x huile objectif et déposez une goutte d’huile sur l’objectif.
- Placer le plat de la culture sur la platine du microscope en utilisant le support de plaque correcte.
- Si une source de CO2 est disponible, placez le dispositif d’administration de CO2 (généralement un couvercle de plexiglas au tube qui délivre le CO2) sur le support de plaque. Régler le CO niveau2 à 5 % et mettre sur le contrôleur de2 CO de dans le logiciel. Si une source de CO2 n’est pas disponible, inclure 20 mM Hepes pour tamponner les médias.
- Accédez à un champ de cellules transfectées et visualiser l’image en direct des cellules comme acquises par la caméra et affiché par le logiciel d’acquisition sur l’écran de l’ordinateur en utilisant le laser de DP.
- Suite d’étapes 4.2.8-4.2.12, entrée les paramètres laser pourcentage puissance et exposition de temps pour le laser de DP. Conserver ces valeurs aussi bas que possible tout en étant capable de détecter le signal fluorescent.
- L’échantillon à l’aide d’un contrôle positif (voir tableau 3 pour des exemples), suivez étapes 4.2.8-4.2.12 pour entrer les paramètres pour le temps de pouvoir et exposition de laser pourcentage de lumière laser YFP. Conserver ces valeurs aussi bas que possible tout en étant capable de détecter le signal de Vénus.
- Pour chaque puits de la plaque, choisir un certain nombre de positions différentes qui contiennent une ou plusieurs cellules exprimant le reporter.
- L’intervalle de temps entre chaque image du Time-lapse et total nombre de trames à prendre de l’entrée. S’assurer qu’il est temps d’acquérir toutes les positions sélectionnées avant que l’image suivante est à prendre.
- Re-visiter chaque position et corriger et mettre à jour la mise au point selon les besoins.
- Pour corriger la dérive focal qui peut résulter de variations de température ou des vibrations extérieures, allumez le système de correction de dérive focus (si disponible).
- Commencer le Time-lapse et enregistrer les données.
- Analyser les données à l’aide de logiciels d’imagerie disponibles (Figure 5le film 2).
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Representative Results
Un exemple de caspase-2 BiFC induite par l’altération de l’ADN est illustré à la Figure 3. Camptothécine, une topoisomérase I inhibiteur, a été utilisé pour induire l’activation de l’ADN des dommages et de la caspase-2. Le mCherry de la protéine fluorescente rouge a été utilisé comme reporter pour montrer que les cellules expriment la sonde BiFC et pour aider à visualiser le nombre total de cellules. Fluorescence de Vénus est affiché en vert et le grand examen représentent caspase-2 induit par la proximité. Ces cellules peuvent être considérées pour déterminer le pourcentage de cellules positives à Vénus. Conclusions au sujet de la localisation sous-cellulaire sont également de telles images. Dans l’exemple illustré, proximité induite de caspase-2 a été détectée dans le nucléole, ainsi que dans le cytoplasme 17. Pour fournir la visualisation haute résolution de la localisation subcellulaire de l’activation de la caspase complexe, les cellules individuelles peuvent être photographiées en trois dimensions. La figure 4 illustre les deux façons de représenter ces images en 3D. La première consiste à générer une reconstruction 3D de la cellule. L’exemple montre induite par la camptothécine caspase-2 BiFC en vert et noyau en rouge. La reconstitution 3D montre la localisation relative des deux fluorophores dans les cellules. Ce type d’affichage des résultats est particulièrement efficace lorsqu’il est présenté comme un film, en faisant tourner la cellule autour d’un axe unique (film 1). Le second panneau est la vue orthogonale de la même cellule. Cela permet la visualisation xy, xzet yz de la cellule à un moment donné dans la cellule. Représentation des résultats de cette manière peut être plus adaptée à une présentation de papier comme dans un article de journal, car il est plus facile à interpréter les données 3D présentées dans un format 2D. Figure 5 illustre un exemple de l’imagerie Time-lapse de caspase-2 BiFC dans une lignée de cellules de glioblastome traitée avec le bortézomib d’inhibiteur du protéasome (voir aussi le film 2). Le graphique montre l’augmentation de l’intensité moyenne de Vénus par cellule moyennée sur un certain nombre de cellules (adapté de 20). Ce type de données peut également être affiché comme un certain nombre de traces de cellule unique sur un graphique. Dans l’exemple illustré, l’apparition de la proximité de caspases induite est environ 2 h après le traitement.
Figure 1 : schématique de caspase structure et méthodologie de complémentation (BiFC) de fluorescence bimoléculaire. (A) structure générale d’un caspase initiatrice. Les sous-unités prodomain, grandes et petites et le motif QACRG conservé qui contient de la cystéine du site actif sont représentés. (B) BiFC utilise split protéines fluorescentes qui seul ne sont pas fluorescentes mais peuvent associer pour réformer la molécule fluorescente lorsque fusionnés aux protéines qui interagissent. Pour caspase BiFC, le prodomain (Pro) ou pleine longueur caspase est fusionnée à la N-borne moitié (Vénus-N) et de la C-borne moitié de Vénus (Venus-C). Dans leur état monomère les protéines de fusion de caspase ne sont pas fluorescentes. Lors de leur recrutement à une plate-forme d’activation, telles que le PIDDosome, comme illustré ici, association des deux moitiés de Vénus est appliquée représentant proximité de caspases induite qui est mesurée comme une augmentation de la fluorescence de Vénus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : image représentative pour reconnaître la saturation à l’aide de l’affichage histogramme. Exemples d’optimale (panneau supérieur) et saturée de signaux (panneau inférieur) sont indiquées. La Vénus (crête jaune) et les signaux de DP (Pointe rouge) sont indiquées. L’axe x indique l’intensité et l’axe des ordonnées sont le nombre de pixels. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : complémentation de fluorescence bimoléculaire Caspase-2 (BiFC) à la suite de dommages à l’ADN. Les cellules HeLa exprimant les composants de BiFC caspase-2 ont été laissés non traitée (A) ou traités avec la camptothécine (100 µM) (B) en présence de qVD-OPH (20 µM). mCherry a été conjointement exprimé comme journaliste fluorescent. Images représentatives montrent des cellules (rouge) avec BiFC caspase-2 (verte) dans les cellules traitées camptothécine 16 h après le traitement. Barres d’échelle représentent 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : localisation de complémentation de fluorescence bimoléculaire caspase-2 (BiFC). Les cellules HeLa exprimant les composants de BiFC caspase-2 et un journaliste nucléaire fluorescent ont été traités avec la camptothécine (20 µM) en présence de qVD-OPH (20 µM). Reconstructions 3D composé de 0,1 μm série images confocales et le z-plane de la cellule ont été faites après 24h et montrer le noyau en rouge et de la caspase-2 BiFC en vert. Le panneau de gauche montre une reconstitution de rendu de projection 3D intensité maximale (voir aussi le film 1). Le panneau de droite montre la vue orthogonale de tranches de la même cellule. La zone médiane (enbleu) est le plan xy , la case de droite (jaune) est le plan yz et boîtier décodeur (blanc) est le plan xz . Les plans yz et xz se croisent selon le réticule. Barres d’échelle représentent 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Time-lapse de complémentation de fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) (A) LN18 glioblastoma cellules transfectées avec les composants de BiFC caspase-2 et un marqueur mitochondrial rouge fluorescent (DsRed-mito, rouge) ont été traités avec le bortézomib (15 nM) en présence de qVD-OPH (20 µM). Les cellules ont été placés sur un microscope confocal à 37 ° C et les images ont été prises toutes les 2 min pendant 8 h. Images de cellules représentant du Time-lapse montrent que la proximité induite par les deux composantes de BiFC caspase-2 a entraîné une augmentation de fluorescence de Vénus ( vert) au fil du temps. (B) l’intensité moyenne de Vénus dans chaque cellule à chaque instant a été mesurée. Fluorescence de Vénus a augmenté au fil du temps après le traitement bortézomib. Division du contrôle non traitée a indiqué conditions de toxicité faible ou négligeable de lumière laser (Figure adaptée de 20). Échelle barres représentent 20 µm. barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM), 8 (contrôle) et 14 (bortézomib) des cellules individuelles (voir aussi le film 2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Taille de plaque | Nombre de cellules | Volume des médias |
| 6 plaque de puits | 1 x 105 cellules / puits | 2 mL |
| 12 plaque de puits | 5 x 104 cellules / puits | 1 mL |
| 24 bien sur plaque | 2. 5 x 104 cellules / bien | 0,5 mL |
| plat 4 chambre | 2. 5 x 104 cellules / chambre | 1 mL |
| plat de chambre 8 | 1,25 x 104 cellules / chambre | 0,5 mL |
Tableau 1 : lignes directrices pour un nombre de cellules à plaque. Si à l’aide de cellules exprimant de manière stable les composants de complémentation (BiFC) de fluorescence bimoléculaire caspase, plaque de doubler les montants indiqués ici.
| Taille de plaque | Réactif de transfection | Médias de sérum réduit | Plasmide de journaliste | Plasmide VC caspase-pro | Plasmide VN caspase-pro | Médias de sérum réduit ajouté au mélange de plasmide | Solution de réactif de transfection ajoutée au mélange de plasmide | Médias libres sériques ajoutés aux cellules |
| 6 plaque de puits | 12 µL/plaque | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | pour un total de 100 µL | 100 ΜL | 800 ΜL |
| 12 plaque de puits | 12 µL/plaque | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | pour un total de 50 µL | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24 bien sur plaque | 12 µL/plaque | 750 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | pour un total de 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| plat 4 chambre | 4 µL/plaque | 250 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | pour un total de 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| plat de chambre 8 | 4 µL/plaque | 250 ΜL | 1,25 ng | 2,5 ng | 2,5 ng | pour un total de 12,5 µL | 12,5 ΜL | 100 ΜL |
Tableau 2 : recommandé volumes de réactifs utilisés pour la transfection transitoire. Remarque : la quantité de plasmide suggéré est seulement un point de départ. Si aucun signal n’est détecté, il est recommandé d’ajuster le plasmide de 20 à 200 ng / puits d’une plaque de 6 puits.
| Caspase | Traitement | Concentration de | Temps | Résultats attendus |
| Caspase-1 | Surexprimé ASC | 250 ng/puits d’une plaque 6 puits | 48 h | 50 % BiFC positif |
| Caspase-2 | RAIDD surexprimée | 500 ng/puits d’une plaque 6 puits | 24h | 90 % BiFC positif |
| Camptothécine | 100 ΜM | 16 h | 30-60 % BiFC positif | |
| Choc thermique | 1 h à 45 ° C | 16 h | 80 % BiFC positif | |
| Caspase-4 | NALP1 surexprimée | 250 ng/puits d’une plaque 6 puits | 48 h | 30 % BiFC positif |
| Caspase-5 | IPAF surexprimée | 250 ng/puits d’une plaque 6 puits | 48 h | 15 % BiFC positif |
Tableau 3 : exemples de contrôles positifs pour la complémentation de fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC). Les conditions et les résultats attendus sont basées sur des données publiées en utilisant le Pro construit 14,17,18. Plasmides conjointement exprimés doivent transfecter aux côtés des plasmides BiFC (étape 2.1.4)
Movie 1 : localisation 3D de complémentation de fluorescence bimoléculaire caspase-2 (BiFC). Reconstruction 3D, tourné autour de y-axe d’images confocales et le z-plane d’un Hela cellules exprimant les composants de la caspase-2-BiFC et un journaliste nucléaire fluorescent ont été traités avec la camptothécine (20 µM) pendant 16 h. Le film montre BiFC caspase-2 (vert) et le noyau (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2 : Time-lapse de complémentation de fluorescence bimoléculaire caspase-2 (BiFC). LN18 glioblastome cellules transfectées avec les composants de BiFC caspase-2 et traités par bortézomib (15 nm) ont été photographié toutes les 2 min pendant 8 h. Le film montre BiFC caspase-2 (vert) et les mitochondries (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Ce protocole traite de l’utilisation de fractionnement des protéines fluorescentes pour mesurer la proximité de caspases induite. Vénus de Split a été choisie pour cette technique car il est très lumineux, hautement photostable et le repliement est rapide 13. Ainsi, l’analyse de Vénus repliement à proximité de caspases induite peut fournir près des estimations en temps réel de la dynamique des interactions protéine caspase. Vénus est divisée en deux fragments légèrement superposées, du N terminale de Vénus (Venus-N ou VN) des acides aminés comprenant 1-173 et C terminal fragment (Vénus-C ou VC) comprenant les résidus 155-239. Autres protéines fluorescentes split existent, mais certains, comme mCherry de split, nécessitent une incubation à 4 ° C pendant 2 h pour le repliement 21. Les protéines fluorescentes divisés supplémentaires y compris fendu Cerulean (une version de la protéine fluorescente cyan) et le rouge sombre split mLumin n’ai pas encore testé dans ce contexte 13,22. En fin de compte, si ces protéines fluorescentes s’avèrent appropriés pour mesurer la proximité de caspases induite, cela pourrait permettre l’évaluation simultanée de plusieurs caspases.
En général, la région de prodomain (Pro) de la caspase est fondue aux fragments fluorescent split. Cette région contient la portion minimale de la caspase requis pour lier à la plateforme d’activation et englobe le motif d’interaction carte ou DED. L’avantage d’utiliser le prodomain est qu’il ne présente pas toute l’activité enzymatique pour les cellules. Cela permet une surveillance simultanée des événements en aval en raison de la caspase endogène. Recherches à ce jour ont montré peu de différence dans la cinétique et la localisation de la caspase BiFC entre la prodomain et la pleine longueur caspase 14. Toutefois, les constructions de longs ont tendance à exprimer avec une efficacité moindre, ce qui nécessite de la transfection des quantités accrues d’ADN plasmidique. En outre, il est recommandé à la cystéine catalytique d’une sérine pour empêcher l’apoptose induite par le caspase sur expression de muter. Malgré ces inconvénients, certaines enquêtes peuvent exiger l’analyse simultanée des paires BiFC pleine longueur à déterminer s’il y a des différences dépendant du contexte à proximité de caspases induite dans la présence ou l’absence des domaines catalytiques.
Ce protocole est spécifiquement adapté pour les cellules HeLa. Le même protocole fonctionne bien pour des lignées de cellules adhérentes supplémentaires dont la lignée de cellules de carcinome mammaire, MCF-7, la lignée de cellules de glioblastome, LN18 et fibroblastes embryonnaires de souris (force expéditionnaire des marines). Il est recommandé que l’utilisateur optimise les conditions de l’électrodéposition et de transfection lors de l’adaptation de ce protocole se rapportant à un nouveau type de cellule. Le protocole décrit deux approches principales de la microscopie qui peuvent être utilisés pour évaluer les cellules : épifluorescence et microscopie confocale. Lors de l’utilisation de la microscopie confocale, les cellules doivent être plaquées sur couvre-objet en verre parce que la majorité des objectifs d’ouverture numérique élevée qui sont utilisés en conjonction avec la microscopie confocale ne pénétrera pas l’épaisseur de la vaisselle en plastique ou des lames de verre. Ainsi, il est recommandé d’utiliser des plats avec des lamelles de verre incorporé no 1.5 disposant de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet optimal de 0,17 mm. Il existe un certain nombre de différents types de ces plats qui vont de plats individuels de 3 cm, à glissières de chambre, aux plaques multipuits de taille standard. Les tableaux 1 et 2 décrivent comment adapter les instructions de placage et de transfection pour les tailles bien différentes. Pour l’épifluorescence imagerie qui est décrite ici (4.1), plaques de culture de tissu en plastique standard suffisent aussi longtemps que le microscope est équipé d’objectifs longue passe.
Parce que cette approche est effectivement une méthode « s’allume » pour mesurer l’activation de la caspase, l’inclusion d’un reporter fluorescent est essentielle pour permettre la visualisation des cellules avant ou en l’absence d’activation de la caspase journaliste tant pour identifier les les cellules transfectées, lorsque transfection transitoire est utilisée. Un certain nombre de journalistes différents peut être utilisé et sont les seuls critères lors du choix d’un : 1) le fluorophore est suffisamment lumineux pour qu’elle puisse être facilement détectée par le protocole d’imagerie ; et 2) son spectre de fluorescence ne se chevauche pas avec celle de la YFP. Par exemple, la protéine fluorescente verte (GFP) déconseillée comme journaliste parce qu’il sera détecté par le filtre YFP ou le laser utilisé pour détecter les Venus. C’est à cause du chevauchement spectral des deux fluorophores. Choisir un fluorophore qui se localise à un organite spécifique peut fournir des informations qualitatives supplémentaires. Par exemple, utilisation d’une protéine que cibles les mitochondries, comme la protéine fluorescente rouge DsRed-mito, peuvent fournir des informations supplémentaires sur la viabilité globale de la cellule. Les mitochondries ont tendance à subir une fragmentation (fission) durant les premiers stades de la cellule mort 23 et cela peut être visualisée avec un journaliste comme DsRed-mito. L’utilisation d’un marqueur d’organites comme journaliste peut aussi permettre des conclusions quant à la localisation sous-cellulaire de caspase BiFC à apporter.
Il y a un certain nombre de façons que la caspase BiFC données peuvent être acquises et analysées. Décider quelle méthode à utiliser sera déterminée par les paramètres à explorer (analyse de populations de point de terminaison par rapport aux informations positionnel ou cinétique de cellule unique) et de la disponibilité des instruments et des logiciels d’imagerie. Ce protocole décrit quelques approches axées sur le microscope afin de recueillir les résultats d’une caspase BiFC expérience pour acquérir des points dans le temps unique et Time-lapse. Toutefois, il convient de noter qu’un certain nombre de variantes et combinaisons de ces approches à utiliser pour interroger créativement les voies d’activation de caspases.
Moment unique d’acquisition de données (4.1) est utilisée pour déterminer le pourcentage de cellules avec des caspases induite par proximité à un moment unique. Pour ce protocole, on compte simplement le nombre de cellules transfectées qui sont Venus-positif. Ainsi, il n’est pas nécessaire de matériel hautement spécialisé et seulement le microscope à épifluorescence plus simple avec un GFP (ou la YFP) et filtre de DP et un compteur de contrôle de main est nécessaire. Certains systèmes d’imagerie peuvent être automatisés pour tenir automatiquement un certain nombre d’images / puits d’une plaque. Si ces instruments n’est disponible, les cellules dans les images acquises peuvent être considérées de la même façon par inspection visuelle ou quantifiés à l’aide de logiciels d’imagerie. Une imagerie tridimensionnelle (4.2) fournit des images haute résolution de caspase BiFC dans tout les plans focaux de la cellule. Un microscope confocal avec des lasers d’exciter Vénus et DP (ou le reporter de transfection choisie) et des capacités de Z-pile est nécessaire. Il existe un certain nombre de modules logiciels de rendu 3D qui fournissent différentes façons de visualiser les données. Pour ces deux types d’analyse, il est possible de fixer les cellules et l’image ou de les évaluer après coup. Toutefois, le processus de fixation ne diminue pas le signal de Vénus, qui pourrait ajouter des artefacts à l’analyse et cette approche n’est donc pas recommandée. Time-lapse imagerie (4.3) peut être utilisé pour fournir une analyse cinétique et de position simultanée de caspase BiFC. Un microscope équipé d’une platine motorisée peut être mis en place pour prendre des photos des postes multiples et même comparer les groupes de traitement différents dans la même expérience.
Pour Time-lapse, un certain nombre de considérations supplémentaires devrait être tenu compte. La lumière laser peut causer des artefacts en raison de la phototoxicité ou photobleaching et tous deux doivent être contrôlés pour. En général, les deux peuvent être évités en utilisant le montant le plus bas possible de la lumière (temps d’exposition court et puissance des laser à d’entrée faible pourcentage en étapes 4.3.6-4.3.7). Phototoxicité se produit lorsque la lumière laser provoque la mort dans les cellules et peut être contrôlée pour en imagerie de cellules non traitées dans les mêmes conditions et en confirmant que la division cellulaire procède comme d’habitude. Photoblanchiment se produit lorsque plusieurs images prises de la même cellule diminue la fluorescence. La protéine fluorescente de Vénus est assez PhotoStation, donc c’est rarement un problème dans la pratique. Les effets de photoblanchiment peuvent être déterminées en prenant de nombreuses images séquentielles d’une cellule de Vénus-positif et veiller à ce que la fluorescence reste stable. Ceci doit seulement être fait une fois, aussi longtemps que les mêmes paramètres de puissance et de l’exposition de laser sont utilisés pour chaque expérience. Les effets dus à la phototoxicité ou photoblanchiment peuvent également être atténués en réduisant le nombre d’images capturées. Ceci peut être réalisé par allongement ou raccourcissement de l’intervalle de temps entre la capture (étape 4.3.9). Utilisant des intervalles de 5 à 10 min sur un Time-lapse de 16 h est un bon point de départ. Si on observe aucun phototoxicité ou expériences de courte durée, l’intervalle entre les images peut être réduite. Si l’activation de la caspase est rapide, plus courtes expériences avec des intervalles de temps plus courts peuvent être utilisés. Par exemple, pour une expérience de 16 h avec des intervalles de 10 min, un total de 192 images est pris (96 pour chaque fluorophore). Une expérience de 2 h avec des intervalles de 1,5 m donnera 160 images. En conséquence, les expériences longues et courtes chacun exposerait les cellules pour des montants totaux similaires de lumière laser. Pour des expériences de courte durée la caspase activation de stimulation peut être ajouté directement sur le support immédiatement avant le début de la capture de Time-lapse (après l’étape 4.3.11 plutôt qu’à l’étape 3). Pour ce faire, retirez le couvercle de la plaque et Déposez délicatement dans une solution contenant le stimulus à l’aide d’une pipette. Prendre soin de ne pas bousculer la plaque et de vérifier rapidement que les cellules sont encore en discussion avant de procéder.
Lorsqu’on effectue des expérimentations Time-lapse, il est également essentiel de s’assurer que l’environnement immédiat des cellules ressemble étroitement à celle d’un incubateur de culture de tissus. Un certain nombre de contrôles environnementaux est disponible sur différentes microscope set ups. Il s’agit de petites pépinières haut stade ainsi que chambres environnementales qui encapsulent le microscope ensemble. Ces deux appareils généralement offrent chaleur, CO2et l’humidité à la chambre d’une manière qui peut être contrôlée avec précision. Le contrôle précis de CO2 et de la température est essentiel à la réussite de l’expérience car température inattendue des fluctuations peuvent conduire à la dérive focal et absence de CO2 provoque le pH du milieu s’élever qui peut être toxiques pour les cellules. Si une source de CO2 n’est pas disponible, les médias peuvent être mis en mémoire tampon par l’addition de Hepes (voir étape 3.1.1). Même si une source de CO2 est disponible, il est recommandé d’inclure Hepes dans le milieu d’imagerie comme une mesure supplémentaire pour maintenir les cellules en bonne santé. Cependant, même en présence de Hepes, l’absence de CO2 pendant de longues périodes peut provoquer la mort cellulaire. Par conséquent, il est important d’inspecter les cellules non traitées, imagés sous les mêmes conditions et la couleur des médias à l’issue de l’expérience pour s’assurer que le pH est resté stable. Notez que le phénol rouge ne doit pas être omis sur tous les supports utilisés dans le présent protocole, étant donné que la contribution d’autofluorescence au signal Venus est minime.
Il y a un certain nombre de méthodes disponibles pour analyser les données d’imagerie résultant d’une expérience de laps de temps. Mesure de l’intensité moyenne des pixels de Vénus par cellules transfectées est la façon la plus simple d’analyser le timing des caspases induite par proximité. Comme illustré à la Figure 3, Figure 4, Figure 5, la caspase-2 BiFC apparaît souvent comme un ou plusieurs examen situé dans différents compartiments subcellulaires. Analyse de l’imagerie des approches que mesure un nombre de foyers, la taille de l’objet ou autres facteurs similaires peut produire des données quantitatives informatives sur ces structures. Pas tous caspase BiFC apparaît sous la forme punctums. Par exemple, les caspases inflammatoires ont montré différents patrons de BiFC notamment fluorescence diffuse, structures filamenteuses et examen simple ou multiple par cellule 18. Ces modèles étaient tributaires de la caspase activé ainsi que les signaux d’activation en amont. Par conséquent, le type d’analyse qui est le plus approprié pour les résultats de Time-lapse sera en grande partie dicté par le type de structuration fluorescent que l'on observe.
Bon nombre des stimuli traitement qui sont évalués en utilisant ce protocole va induire l’apoptose soit directement par l’intermédiaire de la caspase analysés, soit indirectement en se livrant à une voie de mort cellulaire différent. Ce qui provoque les cellules à se rétrécir et se détacher de la plaque, ce qui rend très difficile d’imager les cellules et presque impossible à déterminer toute localisation spécifique de la caspase-BiFC. Inclusion d’un inhibiteur de la caspase-pan n’empêchera cette mort cellulaire. Le recrutement des caspases à leurs plates-formes d’activation et de la caspase associé BiFC n’est pas tributaire de l’activité catalytique de la caspase. Par conséquent, inhibition de la caspase n’a aucun effet sur cette étape, mais empêchera les caractéristiques physiques en aval de l’apoptose incluant blebbing, détachement et perte éventuelle dans l’intégrité de la membrane plasmique. Ainsi, si la réalisation d’analyse de point de terminaison (étape 4.1) ou des piles de Z (point 4.2), l’inclusion d’un inhibiteur de la caspase est essentielle. Pour les expériences Time-lapse, en revanche, si les événements liés à l’apoptose tels que MOMP, annexin liaison V (pour détecter l’exposition phosphatidyl sérine) ou absorption de l’iodure de propidium (pour détecter la perméabilisation de la membrane plasmique) doivent être analysés aux côtés de caspase BiFC, le inhibiteur de la caspase devrait être supprimé afin d’éviter l’inhibition de ces événements. Un inhibiteur de la caspase tels que qVD-OPh (10 à 20 µM) doit être ajouté à des médias qui contient le stimulus induisant l’apoptose (étape 3.1.1). Si co exprimant une protéine pro-apoptotique avec les composants de BiFC caspase, inhibiteur de la caspase s’ajouteront à l’étape 2.1.12 ;
Alors que la caspase BiFC est l’une des rares méthodes disponibles peuvent être utilisés pour visualiser les événements dans les voies d’activation de caspases dans des cellules vivantes, un certain nombre de considérations doit tenir compte lors de la conception de ces expériences. Parce que cette approche est axée sur la surexpression, contrôles de spécificité sont importants. Ceci peut être accompli dans l’une des deux façons suivantes. Tout d’abord, introduction de mutations uniques dans la carte ou le delta de la caspase prodomain telle qu’ils perturbent la liaison entre la caspase et sa plateforme d’activation doit diminuer l’intensité de la caspase BiFC tant le pourcentage de séropositifs au Venus cellules. Par exemple, la mutation du résidu D59 à E dans la prodomain de la caspase-1 perturbe la liaison à la protéine adaptatrice ASC (associées à l’apoptose speck-protéine contenant une carte) et perturbe également induite par l’ASC caspase-1 BiFC 18,24 . En second lieu, utilisation de cellules qui sont déficients en protéines adaptateur qui recrutent la caspase à la plateforme d’activation diminuera de signaux spécifiques de BiFC. Cela peut être obtenu en utilisant des cellules de knockout, si elle est disponible, ou à l’aide de siARN ou CRISPR/Cas9-based approaches to appauvrissent les cellules de l’adaptateur. En conséquence, l’appauvrissement de la protéine caspase-2 adaptateur RAIDD complètement bloqué caspase-2 BiFC induite par un choc thermique ou ADN dommages 14,17. Pour ces expériences, le masquage ou le knockdown cellules devraient être comparés avec témoin apparié (cellules c.-à-d. litière assortie de type sauvage MEF ou contrôle démontable) et, si une nouvelle lignée cellulaire est utilisée, des conditions optimales de transfection devraient être évaluées afin d’assurer un égal expression du reporter BiFC dans des lignées cellulaires.
Une autre limite de cette approche est que, lors de l’utilisation de transfection transitoire, il est difficile de s’assurer que chaque cellule exprime une quantité égale de chaque protéine. Si expression est inégale, un fragment de Vénus pourrait être recruté à la plate-forme à des fréquences plus élevées. Cela pourrait masquer le signal fluorescent complet et conduire à des résultats faussement négatifs. Pour contourner ce problème, une nouvelle version du caspase BiFC reporter pour la génération de ligne de variétés de cellule stables a été récemment rapporté 17. Cette nouvelle version se composait d’une construction qui a exprimé les composants C2 Pro-BiFC sur une trame de lecture ouverte unique séparée par le viral 2 a un clivage peptide 25. Par conséquent, les composants BiFC sont transcrit en un ARNm unique du même promoteur mais traduits pour produire stoechiométriquement égales des protéines de fusion VC et VN. Les lignées de cellules générées pour stablement exprimer cette construction a montré des tendances similaires d’activation aux reporters transitoirement exprimés mais sont plus sensibles et affichée abaisser la fluorescence de fond. Ainsi, le protocole ci-dessus peut être grandement simplifié si utilisé en conjonction avec des lignées de cellules journaliste stablement exprimant les caspase BiFC composants.
À ce jour suggèrent une interférence minimale entre les composants de BiFC caspase et les protéines endogènes. Par exemple, caspase-2 est connu pour être activé en amont de MOMP mais caspase-2 BiFC n’a pas bloqué la progression de MOMP 14. Ainsi, ces journalistes ne semblent pas agir de manière négative dominante. Toutefois, si en même temps évaluer les événements en aval, cela devrait être étudiée au sein de chaque série d’expériences. Insertion d’un contrôle non transfectées bien dans l’expérience est la meilleure façon d’aborder la question. Si la cinétique de la mort cellulaire est inchangée avec ou sans expression de la sonde de caspase, cela indique que les composants de la caspase-BiFC n’interfèrent pas avec la fonction endogène. À l’inverse, la caspase endogène pourrait toucher la lecture BiFC, efficacité ou dans la taille ou la forme des structures. Exprimant le reporter dans les cellules déficientes pour le caspase commandera pour cela.
Malgré ces limites, la caspase BiFC technique est une méthode utile d’interroger les voies d’activation de caspase qui peuvent compléter et améliorer encore sur les approches existantes pour mesurer l’activation des caspases initiateur. Par mesure proximité induite, la première étape d’activation, cette technique surmonte les problèmes associés aux étapes ultérieures comme traitement automatique caspase associés à l’activation de la mesure. Par exemple, lorsque vous utilisez la tache occidentale pour surveiller le clivage des caspases bourreau, caspase-3 et caspase-7, donne la mesure exacte d’activation 2, en utilisant la même approche pour initiateur caspases peuvent être erronées. C’est parce que le clivage des caspases initiateur, ne suffit pas pour activation 4,26,27. En effet, nombreux initiateur caspases sont clivés pendant l’apoptosis de caspase-3 sans produire des enzymes actives 28. De même, techniques basées sur l’utilisation de substrats peptidiques conçus comme cibles pour les caspases spécifiques doivent prendre en compte les spécificités de chevauchements de ces séquences pour les caspases 29. Cela ne signifie pas que ces approches ne permet pas de mesurer l’activation de la caspase, mais il convient de reconnaître les inconvénients lors de l’interprétation des résultats. Caspase BiFC fournit une autre méthode qui peut aider à confirmer les résultats à l’aide des méthodes plus conventionnelles. En outre, la possibilité de suivre l’Assemblée des complexes caspase activation en temps réel et de déterminer clairement la taille, la forme et la localisation des complexes est un avantage important de cette technique qui n’est pas possible d’évaluer par d’autres moyens.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres précédents du laboratoire Bouchier-Hayes qui ont contribué au développement de cette technique. Ce travail a été financé en partie par hôpital pédiatrique pilote award un Texas enfants à LBH. Nous remercions Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas, États-Unis) pour obtenir l’autorisation d’inclure des données publiées en collaboration avec son équipe. Le développement des réactifs décrit a été soutenu par la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 et RRRNC S10RR024574) et l’assistance de Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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