Summary
Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.
Abstract
A família de caspase de proteases desempenham um papel essencial na apoptose e imunidade inata. Entre estes, um subgrupo conhecido como iniciador caspases são os primeiros a ser ativado nestes caminhos. Este grupo inclui caspase-2, -8 e -9, bem como as caspases inflamatórias, caspase-1, -4 e -5. As caspases iniciador são todos ativadas por dimerização seguir ao recrutamento de complexos Multiproteicos específicos, chamados de plataformas de ativação. Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é uma abordagem baseada em imagem onde dividir proteínas fluorescentes fundidas ao iniciador caspases são usadas para visualizar o recrutamento das caspases iniciador de suas plataformas de ativação e o resultante induzida por proximidade. Esta fluorescência fornece uma leitura de um dos primeiros passos necessários para a ativação de caspase iniciador. Usando um número de diferentes abordagens baseadas em microscopia, esta técnica pode fornecer dados quantitativos sobre a eficiência da ativação de caspase em um nível de população, bem como a cinética de ativação de caspase e o tamanho e o número de ativação de caspase complexos em uma base por célula.
Introduction
A família de protease caspase é conhecida por seus papéis críticos na apoptose e imunidade inata 1. Por causa de sua importância, determinar quando, onde e quanto à eficácia das caspases específicas são ativadas podem fornecer insights cruciais sobre os mecanismos de caspase vias de ativação. O protocolo baseado em imagem descrito aqui permite a visualização dos primeiros passos para a cascata de ativação de caspase. Esta técnica tira proveito das interações da proteína: proteína dinâmica ativação de caspase naquela unidade.
As caspases podem ser divididas em dois grupos: as caspases de iniciador (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e as carrasco caspases (caspase-3, -6 e -7). As caspases carrasco estão presentes na célula como dímeros pré-formadas e são ativadas por clivagem entre os grandes e pequenos subunidade 2. Quando ativado, eles cleave inúmeras proteínas estruturais e reguladoras, resultando em apoptose 3. As iniciador caspases são as caspases primeiras para ser ativado em uma via e geralmente acionar a ativação das caspases carrasco. Em contraste com o carrasco caspases, iniciador caspases são ativadas por dimerização 4,5. Este dimerização é facilitada pelo recrutamento de monômeros inativos para complexos de peso molecular grande específico conhecidos como plataformas de ativação. Montagem de plataformas de ativação é regida por uma série de interações da proteína: proteína específica. Estas são mediadas por motivos de interação de proteínas conservadas presentes no proform de caspase o iniciador e incluem o domínio da morte (DD), domínio effector da morte (DED) e de domínio (cartão) de recrutamento de caspase 6 (figura 1A). Plataformas de ativação incluem geralmente uma proteína do receptor e uma proteína do adaptador. O receptor é normalmente ativado mediante a ligação de um ligante, induzindo uma mudança conformacional que permite a oligomerização de numerosas moléculas. O receptor então também recruta a caspase diretamente ou moléculas do adaptador que por sua vez, trazem a caspase ao complexo. Assim, numerosas moléculas de caspase entram em proximidade que permite dimerização. Isso é conhecido como o modelo de proximidade induzida por 7. Uma vez dimerized, a caspase sofre de autoprocessamento, que serve para estabilizar a enzima activa 4,8. Por exemplo, montagem do apoptossomo Apaf1 é acionada pelo citocromo c após sua libertação da mitocôndria em um processo chamado de permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Apaf1, por sua vez, recruta caspase-9, através de uma interação que é mediada por um cartão presente em ambas as proteínas 9. Semelhante resultado de interações proteína na Assembleia da CD95 morte induzindo sinalização complexo (disco) que leva à ativação de caspase-8; o PIDDosome, que pode ativar caspase-2; e vários inflammasome complexos que iniciam a ativação de caspase-1 10,11,12. Assim, iniciador caspases são recrutadas para plataformas específicas de ativação através de um mecanismo comum, resultando em proximidade induzida e dimerização, sem a qual não ocorrerá ativação.
Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é um ensaio baseado em imagens que foi desenvolvido para medir este primeiro passo na ativação das caspases de iniciador, permitindo a visualização direta da proximidade de caspase induzido após a plataforma de ativação montagem. Este método aproveita-se das propriedades da proteína fluorescente divisão Venus. Vênus é um mais brilhante e mais fotoestável versão de proteína fluorescente amarela (YFP) que pode ser separada em dois fragmentos não-fluorescente e ligeiramente sobrepostos: N-terminal de Vênus (Venus N ou VN) e o C-terminal de Vênus (Venus C ou VC). Estes fragmentos mantêm a capacidade de redobrar e tornar-se fluorescente quando na proximidade de 13. Cada fragmento de Vênus é fundido para o prodomínio da caspase, que é a porção mínima da caspase que vincula-se à plataforma de ativação. Isso garante que as caspases não reter a atividade enzimática e, portanto, a análise simultânea de jusante eventos associados a eventos endógenos é possível. A Vênus de fragmentos redobrar quando os prodomains de caspase são recrutados para a plataforma de ativação e passam por proximidade induzida. (Figura 1B). A fluorescência de Venus resultante pode ser usada com precisão e especificamente monitorar a Localização subcellular, a cinética e a eficiência do conjunto de plataformas de ativação de caspase iniciador em células únicas. Dados de imagem podem ser adquirido por microscopia confocal ou por microscopia de fluorescência padrão e pode ser adaptado para uma série de abordagens diferentes microscopia incluindo: imagem de lapso de tempo para controlar a ativação de caspase em tempo real; imagem de alta resolução para determinações precisas de Localização subcellular; e ponto final quantificação da eficiência de ativação.
Esta técnica foi desenvolvida para investigar a ativação de caspase-214. Enquanto a plataforma de ativação de caspase-2 é pensada para ser o PIDDosome, que consiste do receptor PIDD (proteína p53-induzido com um domínio de morte) e o adaptador RAIDD (RIP-associado ICH-1/CAD-3 proteínas homólogas com um domínio de morte), Ativação de caspase-2 independente de PIDDosome tem sido relatada. Isto sugere que plataformas adicionais de ativação de caspase-2 existem 15,16. Apesar de não saber os componentes completo da plataforma de ativação de caspase-2, permitiu-se a caspase BiFC técnica para interrogatório bem sucedido das vias sinalização caspase-2 para o nível molecular 14,17. Adaptámos também com êxito este protocolo para as caspases inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -12) 18 e, em princípio, a mesma abordagem deve ser suficiente para da mesma forma, analisar cada uma das caspases restantes do iniciador. Este protocolo da mesma forma pode ser adaptado investigar outros caminhos foram dimerização é um grande sinal de ativação. Por exemplo, as proteínas STAT são ativadas por dimerização após fosforilação por Janus quinase (JAK) 19. Assim, o sistema de BiFC pode ser usado para visualizar para ativação STAT, bem como muitas outras vias reguladas por interações proteína dinâmico. O seguinte protocolo fornece instruções passo a passo para a introdução dos repórteres em células, bem como as metodologias de análise e aquisição de imagem.
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Protocol
1. preparação de células e pratos da cultura
Nota: Execute os passos 1-3 em uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos. Use luvas.
- Se utilizar pratos de vidro inferior, cubra o vidro com fibronectina. Ignorar a etapa 1.2 se usando pratos de plástico.
- Fazer uma solução de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL da solução de fibronectina 1 mg/mL em 9 mL de 1X PBS.
- Cubra o fundo de vidro de cada poço com 0,5-1 mL de fibronectina e incube por 15 min à temperatura ambiente.
- Utilizando uma pipeta, recolher a solução de fibronectina e armazenar a 4 ° C.
Nota: A solução de fibronectina pode ser reutilizada várias vezes. - Lave o vidro uma vez com 1-2 mL 1X PBS e aspire o PBS.
- Placa 1 x 105 células por poço de uma placa de 6 em 2 mL dos meios de cultura de célula apropriada (ver tabela 1 para números de celular para usar para poços de tamanhos diferentes). Se usando uma linha celular que expressa estàvel os caspase BiFC componentes (ver discussão), placa de 2 x 105 células e prossiga para a etapa de tratamento (etapa 3).
- Permitir que as células aderir ao prato durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora de cultura de tecidos.
2. transfecção de células para introduzir os caspase BiFC componentes
- Transfect células com o reagente de transfeccao apropriado.
Nota: Este protocolo descreve as instruções para Lipofectamine 2000, que foi otimizado para toxicidade mínima. Este protocolo tem sido usado com sucesso em células Hela, células MCF7 e células LN18. Se usar adicionais reagentes de transfecção sigam as instruções do fabricante e otimizar conforme necessário.- Adicione 12 µ l de reagente de Transfeccao para 750 µ l de mídia reduzida de soro em um tubo estéril.
- Incube a temperatura ambiente por 5 min.
- Adicionar 10 ng de um plasmídeo do repórter (um plasmídeo codificação de uma proteína fluorescente, por exemplo, vermelho proteína fluorescente [RFP], que irá rotular as células transfectadas) para um tubo estéril de 1,5 mL para cada poço a transfected.
- Adicionar 20 ng de cada caspase BiFC plasmídeo (por exemplo, 20 ng de caspase-2 prodomínio [C2 Pro]-VC e 20 ng de C2 Pro-VN) para cada tubo (tabela 2).
- Trazer cada tubo até um volume total de 100 µ l adicionando mídia soro reduzida.
- Usando uma pipeta p200, adicione 100 µ l de solução de reagente de Transfeccao de passo 2.1.2 para a mistura de plasmídeo de forma gota a gota.
- Incube a mistura de reagente de transfeccao Plasmideo por 20 min em temperatura ambiente.
- Aspire os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta p1000, pipetar 800 µ l de meios livres de soro delicadamente para baixo do lado do bem.
- Usando uma pipeta p200, adicione 200 µ l do complexo DNA-lipídico gota a gota a cada poço.
- Incube as células em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C por 3 h.
- Tomando cuidado para não perturbar a monocamada, remover os meios livres de soro contendo os complexos lipídios-DNA por aspiração usando sucção ou de uma pipeta.
- Pipete 2 mL do meio de crescimento completo pré-aquecido (37 ° C) suavemente para o lado de cada poço.
- Incube as células a 37 ° C por 24-48 h para a expressão da proteína ideal numa incubadora de cultura de tecidos.
3. indução de ativação de caspase
- Tratar com uma droga ou estímulo que induz a caspase ativação aproximadamente 24 h pós-do transfection.
- Adicionar a concentração desejada do fármaco para pré aquecido (37 ° C) de imagem media (mídia de crescimento completo suplementada com Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-Mercaptoetanol [55 µM]) e misture delicadamente (tabela 3).
- Aspirar os meios de comunicação das células com uma pipeta ou com sucção e em seguida, usando uma pipeta, Pipetar 2 mL da solução de 3.1.1 suavemente para o lado do bem.
- Adicione imagem de mídia sem a droga a um bem como um controle não tratado.
- Incubar as células em uma cultura de tecidos de incubadora a 37 ° C ou prossiga para o passo 4.3 para um experimento de lapso de tempo.
4.. Aquisição de dados de Caspase BiFC
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Caspase BiFC para aquisição de ponto único tempo
- Liga o microscópio e a fonte de luz fluorescente, seguindo as instruções do fabricante.
- Encontre as células sob o filtro RFP e focar a fluorescência do gene repórter.
- Usando um contador mão-contagem, conte todas as células de RFP-positivo no campo visual. O número de registro.
- Mantendo o mesmo campo visual, alterne para o GFP (ou um filtro YFP se estiver disponível) e, usando um contador mão-contagem, contar o número de células vermelhas que também são verdes (Venus-positivo). Alterne entre os dois filtros para garantir que apenas os eritrócitos são avaliados para Venus-positividade. Registre o número (Figura 3).
- Conte pelo menos 100 células de RFP-positivo de cada uma das três áreas individuais da placa.
- Em cada área, calcule a porcentagem de células transfectada Venus-positivo (ou seja, eritrócitos que também são verdes). Média as percentagens resultantes para obter o desvio padrão.
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Geração de imagens tridimensional de caspase BiFC
- Ligue o microscópio seguindo as instruções do fabricante e lançar o software de aquisição.
- Selecione o x 60 ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo
- Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.
- Usando uma fonte de luz de epifluorescência e a parte do olho de microscópio ou o laser confocal e tela do computador, navegue até um campo de interesse.
- Focar a fluorescência de repórter usando o laser RFP ou filtro.
- Se epifluorescência tem sido utilizada até este ponto, mudar a fonte de luz para o laser confocal e visualizar a imagem ao vivo das células como adquirida pela câmera e exibido pelo software de aquisição na tela do computador.
- Usando o controle de joystick e a roda de foco, ajuste o foco e a posição das células para que as células estão no centro do visor. Escolha as células que são separadas uns dos outros e não se sobrepõem.
- Entrada a potência do laser de porcentagem para 50% e o tempo de exposição a 100 ms para Venus e RFP como ponto de partida para determinar as configurações ideais para usar para o experimento.
- Ligue a captura ao vivo e inspecionar a imagem resultante e os histogramas de exibição acompanhamento para ambos os canais.
- Se o sinal é baixo e a imagem é difícil de decifrar, aumente o tempo percentual de potência e/ou exposição de laser em incrementos até que o sinal na imagem parece ser bom.
- Certifique-se de que o sinal não chega saturação. Inspecione o histograma de exibição para certificar-se de que um pico distinto é visível para cada fluor. Se o pico engloba a exibição de histograma inteiro, entrada do laser poder e exposição ajustes inferiores (Figura 2).
- Visualize as células de controle (não tratada ou não-transfectadas) sob as mesmas condições para garantir que o sinal é específico.
Nota: Única cor transfectants também pode ser usado para controle de crossover, mas se os sinais são espacialmente distintas (por exemplo, mitocondrial contra citosólico) isso não é necessário. - Selecione ou abra o módulo de pilha de Z no software do microscópio.
- Usando o botão de foco, aproximado posição focal correspondente ao centro da célula.
- Ajuste o foco em uma direção, até que a célula não é mais visível, selecione essa opção como a primeira posição.
- Ajuste o foco na direção oposta até a célula novamente não é mais visível e selecionar esta opção como a posição inferior.
- Escolha o tamanho de passo ótimo (geralmente cerca de 20 µm) e iniciar a aquisição para instruir a câmera para tirar automaticamente uma única imagem em cada canal em cada uma das 20 etapas µm entre as posições superior e inferior.
- Use o software de renderização 3D para reconstruir a imagem 3D (Figura 4filme 1).
-
Imagem de lapso de tempo de caspase BiFC
- Pelo menos 1 h antes do experimento, ligue o microscópio e seleccionar a temperatura de 37 ° c.
- Selecione o x 40, 60 x ou objectivo de óleo x 63 e coloque uma gota de óleo sobre o objetivo.
- Coloque o prato de cultura no palco microscópio usando o suporte de placa correta.
- Se uma fonte de2 CO está disponível, coloque o dispositivo de entrega do CO2 (normalmente uma tampa de plexiglass ligada ao tubo que entrega o CO2) em cima do suporte da placa. Definir o CO2 nível de 5% e ligar o CO2 controlador de dentro do software. Se não houver uma fonte de2 CO, incluem 20 mM Hepes para tamponar a mídia.
- Navegue até um campo de células transfectadas e visualizar a imagem ao vivo das células como exibido pelo software de aquisição na tela do computador usando o laser RFP e adquirida pela câmera.
- Seguindo os passos 4.2.8-4.2.12, entrada as configurações para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao do laser de RFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível e ainda ser capaz de detectar o sinal fluorescente.
- Usando um controle positivo da amostra (ver tabela 3 para obter exemplos), siga passos 4.2.8-4.2.12 para as configurações de entrada para porcentagem do laser poder e tempo de exposicao para a luz de laser YFP. Manter estes valores tão baixos quanto possível enquanto ainda é capaz de detectar o sinal de Venus.
- Para cada poço da placa, escolha um número de posições diferentes que contêm uma ou mais células expressando o repórter.
- O intervalo de tempo entre cada quadro do lapso de tempo e total número de quadros a serem tomadas de entrada. Verifique se há tempo para adquirir todas as posições selecionadas antes que o próximo quadro é para ser tomado.
- Re-visitar cada posição e corrigir e atualizar o foco conforme necessário.
- Para corrigir para drift focal que pode resultar de mudanças de temperatura ou vibrações externas, ligue o sistema de correção de desvio de foco (se disponível).
- Começar o lapso de tempo e salvar os dados.
- Analise os dados usando o software de imagem disponível (Figura 5filme 2).
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Representative Results
Um exemplo de caspase-2 BiFC induzida por dano do ADN é mostrado na Figura 3. Camptothecin, uma topoisomerase eu inibidor, foi usado para induzir danos e caspase-2 ativação do DNA. O mCherry da proteína fluorescente vermelha foi usado como um repórter para mostrar que as células expressam a sonda BiFC e para ajudar a visualizar o número total de células. Fluorescência de Vênus é mostrada em verde e a grande partitura representam caspase-2 induzido por proximidade. Estas células podem ser contadas determinar a percentagem de células de Venus-positivo. Conclusões sobre Localização subcellular também podem ser feitas de tais imagens. No exemplo mostrado, proximidade induzida caspase-2 foi detectada no nucléolo, bem como o citoplasma 17. Para fornecer visualização de alta resolução da Localização subcellular da ativação de caspase complexa, células individuais podem ser fotografadas em três dimensões. A Figura 4 mostra duas maneiras de representar tais imagens em 3D. O primeiro é para gerar uma reconstrução 3D da célula. O exemplo mostra induzida por camptothecin BiFC de caspase-2 no núcleo em vermelho e verde. A reconstrução 3D mostra a localização relativa dos dois fluorophores em toda as células. Este tipo de exibição de resultados é especialmente eficaz quando apresentado como um filme, girando a célula em torno de um único eixo (filme 1). O segundo painel é a vista ortogonal da mesma célula. Isto fornece a visualização xy, xze yz da célula em um ponto específico na célula. Representação dos resultados dessa maneira pode ser mais adequada para uma apresentação de papel tais como em um artigo de jornal, como é mais fácil de interpretar os dados 3D apresentados em um formato 2D. A Figura 5 mostra um exemplo de imagem de lapso de tempo de caspase-2 BiFC em uma linhagem de células de glioblastoma tratada com o bortezomib inibidor de proteossomo (Veja também o filme 2). O gráfico mostra o aumento da intensidade média de Venus por célula média de um número de células (adaptado de 20). Este tipo de dados também pode ser exibido como uma série de vestígios de célula única em um gráfico. No exemplo mostrado, o início da proximidade de caspase induzida é cerca de 2 h após o tratamento.
Figura 1: esquemático do caspase estrutura e metodologia de complementação (BiFC) de fluorescência bimolecular. (A) a estrutura geral de uma caspase iniciador. As subunidades prodomínio, grandes e pequenas e o motivo QACRG conservado que contém a sítio ativo de cisteína são retratados. (B) BiFC usa divisão proteínas fluorescentes que sozinho não são fluorescentes, mas podem associar para reformar a molécula fluorescente quando fundido a interação de proteínas. Para caspase BiFC, o prodomínio (Pro) ou caspase completo é fundido ao N-terminal metade (Venus-N) e para o C-terminal metade (Venus-C) de Vênus. Em seu estado monomérico as caspase proteínas de fusão não são fluorescentes. Em cima de recrutamento para uma plataforma de ativação, como o PIDDosome, como mostrado aqui, Associação das duas metades de Vênus é imposta representando a proximidade de caspase induzida que é medida como um aumento na fluorescência de Venus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem representativa para reconhecer a saturação usando o exibição de histograma. São mostrados exemplos de ideal (painel superior) e sinais saturados (painel inferior). A Vênus (pico amarelo) e sinais RFP (pico vermelho) são mostrados. O eixo x indica a intensidade e o eixo y é o número de pixels. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: complementação de fluorescência bimolecular de Caspase-2 (BiFC) seguindo o dano do ADN. Células HeLa, expressando os caspase-2 BiFC componentes foram deixadas não tratado (A) ou tratadas com camptothecin (100 µM) (B) na presença do qVD-OPH (20 µM). mCherry foi co expressa como repórter fluorescente. Imagens representativas mostram células (vermelho) com BiFC de caspase-2 (verde) em células tratadas camptothecin 16 h após o tratamento. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: localização de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). Células HeLa expressando os caspase-2 BiFC componentes e um repórter fluorescente nuclear foram tratadas com camptothecin (20 µM) na presença do qVD-OPH (20 µM). Reconstruções 3D composta de 0,1 μm serial imagens confocal à z-avião da célula foram feitas após 24 h e mostrar o núcleo em vermelho e caspase-2 BiFC em verde. O painel esquerdo mostra uma reconstrução de renderização de projeção 3D de intensidade máxima (ver também 1 filme). O painel direito mostra a exibição de fatias ortogonal da mesma célula. Caixa média (azul) é o plano XY , caixa da direita (amarelo) é o plano yz e caixa superior (branco) é o plano xz . Os planos yz e xz cruzam-se de acordo com a mira. Barras de escala representam 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Time-Lapse de caspase complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) (A) LN18 glioblastoma células transfectadas com os caspase-2 BiFC componentes e um marcador mitocondrial fluorescente vermelho (DsRed-mito, vermelho) foram tratados com bortezomib (15 nM) na presença do qVD-OPH (20 µM). As células foram colocadas em um microscópio confocal a 37 ° C e imagens foram tiradas a cada 2 min para 8 h. imagens de células representativas do show lapso de tempo que a proximidade induzida dos dois componentes caspase-2 BiFC resultou em um aumento na fluorescência de Venus ( verde) ao longo do tempo. (B) a intensidade média de Vênus em cada célula em cada ponto de tempo era medida. Fluorescência de Vênus aumentou ao longo do tempo após o tratamento bortezomib. Divisão no controle não tratado indicou condições de toxicidade baixa ou insignificante de luz de laser (figura adaptada de 20). Escala barras representam 20 µm. barras de erro representam o erro padrão da média (SEM) de 8 (controle) e 14 (bortezomib) de células individuais (Veja também o filme 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tamanho da placa | Número de células | Volume de mídia |
| 6 placa bem | 1 x 105 células / bem | 2 mL |
| 12 placa bem | 5 x 104 células / bem | 1 mL |
| 24 prato bem | 2.5 x 104 células / bem | 0,5 mL |
| prato de câmara 4 | 2.5 x 104 células / câmara | 1 mL |
| prato de câmara 8 | 1,25 x 104 células / câmara | 0,5 mL |
Tabela 1: orientações para um número de células para placa. Se usando células estàvel expressando os componentes de complementação (BiFC) de fluorescência bimolecular caspase, placa dobro as quantias mostradas aqui.
| Tamanho da placa | Reagente de transfeccao | Mídia de soro reduzida | Repórter do | Plasmídeo de caspase-pro VC | Plasmídeo VN caspase-pro | Mídia de reduzida soro adicionada à mistura do plasmídeo | Solução de reagente de transfeccao adicionada à mistura do plasmídeo | Meios livres de soro adicionados às células |
| 6 placa bem | 12 µ l/placa | 750 Μ l | 10 ng | 20 ng | 20 ng | ao total de 100 µ l | 100 Μ l | 800 Μ l |
| 12 placa bem | 12 µ l/placa | 750 Μ l | 5 ng | 10 ng | 10 ng | ao total de 50 µ l | 50 Μ l | 400 Μ l |
| 24 prato bem | 12 µ l/placa | 750 Μ l | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | ao total de 25 µ l | 25 Μ l | 200 Μ l |
| prato de câmara 4 | 4 µ l/placa | 250 Μ l | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | ao total de 25 µ l | 25 Μ l | 200 Μ l |
| prato de câmara 8 | 4 µ l/placa | 250 Μ l | 1.25 ng | 2,5 ng | 2,5 ng | a total 12,5 µ l | 12,5 Μ l | 100 Μ l |
Tabela 2: recomendado volumes dos reagentes utilizados para transientes do transfection. Nota: a quantidade de plasmídeo sugerida é apenas um ponto de partida. Se nenhum sinal for detectado, é aconselhável titula-se o plasmídeo de 20-200 ng por alvéolo de uma placa de 6.
| Caspase | Tratamento | Concentração | Tempo | Resultados esperados |
| Caspase-1 | ASC over expressa | 250 ng/bem de uma placa bem 6 | 48 h | 50% BiFC positivo |
| Caspase-2 | RAIDD over expressa | 500 ng/bem de uma placa bem 6 | 24 h | 90% BiFC positivo |
| Camptothecin | 100 ΜM | 16 h | 30-60% BiFC positivo | |
| Choque de calor | 1 h a 45 ° C | 16 h | 80% BiFC positivo | |
| Caspase-4 | NALP1 Blumental | 250 ng/bem de uma placa bem 6 | 48 h | 30% BiFC positivo |
| Caspase-5 | IPAF Blumental | 250 ng/bem de uma placa bem 6 | 48 h | 15% BiFC positivo |
Tabela 3: exemplos de controlos positivos para complementação de fluorescência bimolecular caspase (BiFC). As condições e os resultados esperados são baseados em dados publicados usando o Pro constrói 14,17,18. Plasmídeos co expressos devem transfected juntamente com o plasmídeo BiFC (etapa 2.1.4)
Filme 1: 3D localização de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). Reconstrução 3D, girava em torno do y-eixo de imagens confocal à z-avião de um Hela células expressando os componentes de caspase-2-BiFC e um repórter fluorescente nuclear foram tratados com camptothecin (20 µM) por 16 h. O filme mostra a caspase-2 BiFC (verde) e o núcleo (vermelho). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Movie 2: Time-Lapse de complementação de fluorescência bimolecular caspase-2 (BiFC). LN18 glioblastoma células transfectadas com os caspase-2 BiFC componentes e tratados com bortezomib (15 nm) foram fotografada a cada 2 min para 8 h. O filme mostra a caspase-2 BiFC (verde) e as mitocôndrias (vermelho). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Este protocolo discute o uso de proteínas fluorescentes divisão para medir caspase induzida por proximidade. Split Vênus foi escolhida para esta técnica, porque é muito brilhante, altamente fotoestável e a dobrar é rápido 13. Assim, a análise de Vênus dobrar sobre proximidade de caspase induzida pode fornecer perto estimativas em tempo real da dinâmica de interação de proteínas caspase. Vênus é dividida em dois fragmentos ligeiramente sobrepostos, o N-terminal de Vênus (Venus-N ou VN) composto por aminoácidos 1-173 e o terminal C do fragmento (Venus-C ou VC) composto por resíduos 155-239. Existem outras proteínas fluorescentes divisão mas algumas, como a divisão mCherry, exigem incubação a 4 ° C por até 2 h para dobrar 21. Proteínas fluorescentes divisão adicional incluindo dividir Cerulean (uma versão da proteína fluorescente ciana) e o mLumin de divisão muito vermelho ainda precisa ser testado neste contexto 13,22. Em última análise, se estas proteínas fluorescentes provar apropriadas para medir a proximidade de caspase induzida, isto poderia permitir que para a avaliação simultânea das várias caspases.
Geralmente, o prodomínio região (Pro) a caspase é fundido aos fragmentos fluorescentes de divisão. Esta região contém a parte mínima necessária para ligar para a plataforma de ativação da caspase e engloba o motivo de interação de cartão ou DED. A vantagem de usar o prodomínio é que não introduza qualquer atividade enzimática para as células. Isto permite o monitoramento simultâneo de eventos a jusante devido a caspase endógena. Pesquisa para data mostrou pouca diferença na localização de caspase BiFC entre o prodomínio e o comprimento total de caspase 14e cinética. No entanto, as longa-metragem Construções tendem a expressar com menor eficiência, necessitando o transfeccao de maiores quantidades de ADN do plasmídeo. Além disso, é recomendável para mutar a cisteína catalítica para uma serina para evitar a apoptose induzida por caspase sobre expressão. Apesar destas deficiências, certas investigações podem exigir a análise simultânea dos pares de BiFC de comprimento total, para determinar se existem diferenças de contexto-dependente na proximidade de caspase induzida na presença ou ausência dos domínios catalíticos.
Este protocolo é especificamente adaptado para as células HeLa. O mesmo protocolo funciona bem para linhas adicionais de células aderentes, incluindo a linhagem de células de carcinoma mamário, MCF-7, a linhagem de células de glioblastoma, LN18 e fibroblastos embrionários de rato (MEF). É recomendável que o usuário otimiza condições chapeamento e de transfeccao quando adaptar este protocolo para um novo tipo de célula. O protocolo descreve duas abordagens de microscopia principal que podem ser usadas para avaliar as células: epifluorescência e microscopia confocal. Quando usando microscopia confocal, células devem ser banhadas em lamelas de vidro porque a maioria dos objectivos de abertura numérica elevada que são usados em conjunto com microscopia confocal não penetrarão a espessura dos pratos plásticos ou lâminas de vidro. Assim, é recomendável usar pratos com as lamelas de vidro incorporado n º 1.5 que têm a espessura ideal da lamela de 0,17 mm. Um número de diferentes tipos destes pratos está disponível que variam de pratos individuais de 3 cm, para slides de câmara, para placas multi bem de tamanho padrão. As tabelas 1 e 2 descrevem como adaptar-se as instruções de chapeamento e de Transfeccao para os tamanhos bem diferentes. Para a epifluorescência da imagem latente que é descrito aqui (4.1), placas de cultura de tecido plástico padrão são suficientes, enquanto o microscópio é equipado com objectivos de passe longo.
Porque esta abordagem é, efetivamente, um método de "luzes" para medir a ativação de caspase, a inclusão de um repórter fluorescente é essencial para permitir a visualização das células antes ou na ausência de ativação do caspase repórter e identificar as células transfectadas, quando transfecção transiente é usada. Um número de relatores diferentes pode ser usado e são os únicos critérios ao escolher uma: 1) o fluoróforo é suficientemente brilhante para que ele pode ser facilmente detectado pelo protocolo de imagem; e 2) seu espectro fluorescente não sobreposição com o da YFP. Por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP) não deve ser usada como um repórter porque ele será detectado pelo filtro YFP ou do laser usado para detectar a Venus. Isto é devido a sobreposição espectral dos dois fluorophores. Escolher um fluoróforo que localiza-se a uma organela específica pode fornecer informações adicionais de qualitativas. Por exemplo, use de uma proteína que alvos as mitocôndrias, tais como a proteína fluorescente vermelha DsRed-mito, podem fornecer informações adicionais sobre a viabilidade global da célula. As mitocôndrias tendem a sofrer fragmentação (fissão) durante os primeiros estágios da célula morte 23 e isto pode ser visualizado com um repórter como DsRed-mito. O uso de um marcador de organela como repórter também pode permitir conclusões sobre Localização subcellular da caspase BiFC para ser feita.
Há um número de maneiras que caspase BiFC dados podem ser adquiridos e analisados. Decidir qual método usar será determinado pelos parâmetros a ser explorado (análise de ponto de extremidade população contra informações posicionais ou cinética de única célula) e a disponibilidade de instrumentação e software de imagem. Este protocolo descreve algumas abordagens baseadas em microscópio para recolher os resultados de uma caspase BiFC experimento para a aquisição de ambos os pontos de tempo único e lapso de tempo dados. No entanto, note-se que um número de variações e combinações dessas abordagens para ser usado para interrogar criativamente vias de ativação de caspase.
Momento único de aquisição de dados (4.1) é usada para determinar a percentagem de células com caspase induzida por proximidade num ponto do tempo único. Para este protocolo, um conta simplesmente o número de células transfectadas Venus-positivo. Assim, equipamentos altamente especializados, não é necessário e só o microscópio de epifluorescência mais básico com GFP (ou YFP) e filtro RFP e um contador de contagem de mão é necessário. Alguns sistemas de imagem podem ser automatizados para tirar automaticamente um determinado número de imagens por alvéolo de um prato. Se tal instrumentação está disponível, as células nas imagens adquiridas podem ser contadas da mesma forma por inspeção visual, ou quantificados usando o software de imagem. Imagem tridimensional (4.2) fornece imagens de alta resolução de caspase BiFC durante todo os aviões focais da célula. Um microscópio confocal com lasers que excite Venus e RFP (ou o repórter de transfeccao escolhido) e capacidades de Z-pilha é necessária. Um número de módulos de software de renderização 3D está disponível que fornecem maneiras de visualizar os dados. Para ambos estes tipos de análise, é possível corrigir as células e imagem ou avaliá-los em um momento posterior. No entanto, o processo de fixação de diminuir o sinal de Venus, que poderia adicionar artefatos para a análise e, portanto, esta abordagem não é recomendada. Imagem de lapso de tempo (4.3) pode ser usada para fornecer análise simultânea de cinética e posicional de caspase BiFC. Um microscópio equipado com um palco motorizado pode ser configurado para tirar fotos de várias posições e até mesmo comparar grupos de tratamento diferentes no mesmo experimento.
Por lapso de tempo, um número de considerações adicionais deve ser considerado. A luz do laser pode causar artefatos devido a fototoxicidade ou fotobranqueamento e ambos precisam ser controlados para. Em geral, ambos podem ser evitados usando a menor quantidade possível de luz (entrada baixa percentagem vezes a exposição curta e poder do laser em etapas 4.3.6-4.3.7). Fototoxicidade resulta quando a luz do laser induz morte nas células e pode ser controlada por células não tratadas nas mesmas condições de imagem e confirmando que a divisão celular continua como normal. Fotobranqueamento ocorre quando várias imagens tiradas da mesma célula diminui a fluorescência. A proteína fluorescente de Vênus é fotoestável bastante, por isso raramente é um problema na prática. Os efeitos de fotobranqueamento podem ser determinados tomando inúmeras imagens sequenciais de uma célula de Venus-positivo e garantir que a fluorescência permanece estável. Isso só precisa ser feito uma vez, desde que as mesmas configurações de alimentação e exposição do laser são usadas para cada experimento. Efeitos devido a fototoxicidade ou fotobranqueamento também podem ser atenuados pela redução do número total de imagens capturadas. Isto pode ser conseguido aumentando ou encurtando o intervalo de tempo entre as capturas (etapa 4.3.9). Usar intervalos de 5-10 min mais um lapso de tempo de h 16 é um bom lugar para começar. Se não photoxicity é observado ou experimentos de menor duração são necessários, o intervalo entre os quadros pode ser reduzido. Se a ativação de caspase é rápida, experimentos mais curtos, com intervalos de tempo mais curtos podem ser usados. Por exemplo, para uma experiência de 16 h com intervalos de 10 min, um total de 192 imagens será tomado (96 para cada fluoróforo). Um experimento de 2 h com intervalos de 1,5 m irá produzir 160 imagens. Portanto, os experimentos de longos e curtos cada um iria expor as células para montantes totais semelhantes de luz laser. Para experimentos de curta duração a caspase ativando o estímulo pode ser adicionada diretamente para a mídia imediatamente antes do início do lapso de tempo captura (depois passo 4.3.11 em vez de no passo 3). Para fazer isso, remova a tampa da placa de e solte suavemente em uma solução contendo o estímulo com uma pipeta. Tome cuidado para não empurram a placa e verificar rapidamente que as células ainda estão em foco antes de prosseguir.
Ao realizar experimentos de lapso de tempo, é também fundamental para certificar-se de que o ambiente imediato das células se assemelha a de uma incubadora de cultura de tecidos. Um número de controles ambientais está disponível no microscópio diferentes set ups. Estes incluem menores incubadoras de nível superior, bem como câmaras ambientais que encapsulam o microscópio inteiro. Ambos estes dispositivos geralmente entregam calor, CO2e umidade para a câmara de uma forma que pode ser controlada precisamente. O controle preciso de CO2 e temperatura é essencial para o sucesso do experimento porque temperatura inesperada flutuações podem levar à deriva focal e ausência de CO2 faz com que o pH dos meios de comunicação a subir que podem ser tóxicos para as células. Se uma fonte de2 CO não estiver disponível, a mídia pode ser tamponada pela adição de Hepes (consulte a etapa 3.1.1). Mesmo se uma fonte de2 CO está disponível, é recomendável incluir Hepes no meio da imagem latente, como uma medida extra de manter as células saudáveis. No entanto, mesmo na presença de Hepes, ausência de CO2 por períodos prolongados de tempo pode causar morte celular. Portanto, é importante inspecionar as células não tratadas, fotografadas sob as mesmas condições e a cor da mídia na conclusão do experimento para garantir que o pH manteve-se estável. Observe que o vermelho fenol não precisa ser omitida de qualquer um dos meios de comunicação utilizados neste protocolo, desde que a contribuição de autofluorescência para o sinal de Venus é mínima.
Há um número de métodos disponíveis para analisar os dados de imagens resultantes de uma experiência de lapso de tempo. Medindo a intensidade média de pixels de Venus por células transfectadas é a maneira mais simples para analisar o timing da caspase induzida por proximidade. Como mostrado na Figura 3, Figura 4, Figura 5, a caspase-2 BiFC muitas vezes aparece como um ou mais partitura localizado em diferentes compartimentos subcellular. Análise de imagem se aproxima em que medida números de focos, o tamanho do objeto ou fatores similares adicionais podem produzir dados quantitativos informativos sobre estas estruturas. Nem todos os caspase BiFC aparece como partitura. Por exemplo, as caspases inflamatórias mostraram diferentes BiFC padronização, incluindo fluorescência difusa, estruturas filamentosas e partitura simples ou múltiplos por célula 18. Esses padrões eram dependentes da caspase ativado bem como os montante ativando sinais. Portanto, o tipo de análise que é mais adequado para os resultados de lapso de tempo em grande parte vai ser ditado pelo tipo de padronização fluorescente que é observado.
Muitos dos estímulos tratamento são avaliadas quando usando este protocolo irá induzir apoptose diretamente por meio da caspase analisados ou indiretamente acoplando um caminho de morte de célula diferente. Isso faz com que as células encolhem e desanexar da placa, que torna muito difícil para as células de imagem e quase impossível de determinar qualquer localização específica do caspase-BiFC. Inclusão de um inibidor de pan-caspase impedirá esta morte celular. O recrutamento de caspases de suas plataformas de ativação e o caspase associado BiFC não é dependente da atividade catalítica do caspase. Portanto, inibição de caspase não tem efeito sobre esta etapa, mas vai inibir as características físicas a jusante da apoptose, incluindo blebbing, desprendimento e eventual perda de integridade da membrana plasmática. Assim, se efectuar a análise de ponto de extremidade (passo 4.1) ou pilhas Z (passo 4.2), a inclusão de um inibidor de caspases é essencial. Para Time-Lapse experimentos em contraste, se os eventos relacionados à apoptose, como MOMP, anexina vinculação de V (para detectar a exposição de fosfatidil serina) ou captação de iodeto de propidium (para detectar a permeabilização da membrana plasmática) estão a ser analisados ao lado de caspase BiFC, o caspase inibidor deve ser omitido para evitar a inibição destes eventos. Um inibidor de caspases como qVD-OPh (10-20 µM) deve ser adicionado na mídia que contém o estímulo de indução de apoptose (etapa 3.1.1). Se co expressar uma proteína pro-apoptotic com os componentes do BiFC de caspase, o inibidor de caspases deve ser adicionado na etapa 2.1.12.
Enquanto caspase BiFC é um dos poucos métodos disponíveis que podem ser usados para Visualizar eventos em vias de ativação de caspase em células vivas, uma série de considerações deve ter em conta ao projetar estes experimentos. Porque esta abordagem é baseada em superexpressão, controles para especificidade são importantes. Isso pode ser feito de duas maneiras. Primeiro, a introdução de mutações de ponto única para o cartão ou DED de prodomínio tal que que isso atrapalhe a vinculação entre a caspase e sua plataforma de ativação da caspase deve diminuir tanto a intensidade da caspase BiFC e a porcentagem de Venus-positivo células. Por exemplo, a mutação do resíduo D59 e no prodomínio de caspase-1 interrompe a ligação à proteína do adaptador ASC (apoptose-grão, como proteína associada contendo um cartão) e igualmente interrompe induzida por ASC caspase-1 BiFC 18,24 . Em segundo lugar, a utilização de células que são deficientes em proteínas adaptador que recrutam a caspase à plataforma de ativação irá diminuir sinais específicos de BiFC. Isto pode ser alcançado usando células de nocaute, se disponível, ou usando siRNA ou baseada em CRISPR/Cas9 se aproxima para esgotar as células do adaptador. Nesse sentido, a depleção das proteínas caspase-2 adaptador RAIDD completamente bloqueado caspase-2 BiFC induzida por choque térmico ou dano de DNA 14,17. Para estas experiências, o nocaute ou células "knockdown" devem ser comparadas com o correspondente controle células (ou seja, maca-combinadas selvagem tipo MEF ou controle "knockdown") e, se for usada uma nova linha de célula, condições ideais de transfeccao devem ser avaliadas para garantir igual expressão do repórter BiFC através das linhas de celular.
Uma segunda limitação dessa abordagem é que, quando usando transfecção transiente, é difícil garantir que cada célula está expressando quantidades iguais de cada proteína. Se a expressão é desigual, um fragmento de Venus poderia ser recrutado para a plataforma em frequências mais altas. Isso poderia mascarar o sinal completo fluorescente e levar a resultados falsos negativos. Para superar este problema, uma nova versão do caspase BiFC repórter para geração de linha celular estável foi recentemente relatado 17. Esta nova versão consistia de um construto que expressa os componentes C2 Pro-BiFC em um quadro único de leitura aberto separado por peptídeo Self chicotada 25a 2A viral. Portanto, os componentes BiFC são transcrito como um único mRNA o mesmo promotor mas traduzidos para produzir quantidades estequiometricamente iguais de proteínas de fusão a VC e VN. As linhas de célula geradas para estàvel expressar essa construção demonstrou tendências similares de ativação para os repórteres transitoriamente expressas mas foram mais sensíveis e exibido baixa fluorescência de fundo. Assim, o protocolo acima pode ser muito simplificado se usado em conjunto com linhas de células de repórter que expressam estàvel os caspase BiFC componentes.
Dados de data sugerem interferência mínima entre os componentes do BiFC de caspase e as proteínas endógenas. Por exemplo, caspase-2 é conhecido por ser ativado o montante de MOMP mas caspase-2 BiFC não bloquear a progressão do MOMP 14. Assim, os repórteres não parecem agir de forma negativa dominante. No entanto, se simultaneamente avaliando eventos a jusante, isto deve ser investigado dentro de cada conjunto de experimentos. Incluindo um controle não-transfectadas bem no experimento é a melhor maneira de abordar isso. Se inalterado, com ou sem expressão do caspase sensor cinética de morte celular, isso indicará que os componentes de caspase-BiFC não estão interferindo com função endógena. Por outro lado, a caspase endógena poderia possivelmente afetar a leitura BiFC, eficiência ou o tamanho ou a forma das estruturas. Expressar o repórter em células deficientes para a caspase controlará para isto.
Apesar dessas limitações, a caspase BiFC técnica é um método útil para interrogar vias de ativação de caspase que podem complementar e até mesmo melhorar as abordagens existentes para medir a ativação de caspase iniciador. Pela medição proximidade induzida, o primeiro passo para ativação, esta técnica supera problemas associados com etapas posteriores, tais como processamento automático caspase associada com ativação de medição. Por exemplo, ao usar o borrão ocidental para monitorar a clivagem das caspases carrasco, caspase-3 e caspase-7, fornece uma medida exata de ativação 2, usando a mesma abordagem de iniciador caspases pode ser falho. Isso ocorre porque a clivagem das caspases de iniciador, não é suficiente para ativação 4,26,27. Na verdade, muitos iniciador caspases são clivadas durante a apoptose por caspase-3, sem produzir enzimas ativo 28. Da mesma forma, técnicas baseadas no uso de substratos de peptídeo projetados como alvos de caspases específicas precisam levar em conta as especificidades de sobreposição dessas sequências para as caspases 29. Isto não significa que tais abordagens não podem ser usadas para medir a ativação de caspase, mas as desvantagens devem ser reconhecidas ao interpretar os resultados. Caspase BiFC fornece uma abordagem alternativa que pode ajudar a confirmar os resultados usando métodos mais convencionais. Além disso, a capacidade de acompanhar a montagem dos complexos de ativação de caspase em tempo real e distintamente determinar o tamanho, forma e localização dos complexos é uma vantagem significativa desta técnica que não é possível avaliar por outros meios.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer todos os membros anteriores do laboratório Bouchier-Hayes que contribuíram para o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de piloto pediátrica Hospital infantil do Texas a LBH. Agradecemos Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permissão para incluir dados publicados em colaboração com a equipe dela. O desenvolvimento dos reagentes descrito foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e a assistência de Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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