Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Belysning op veje til Caspase aktivering ved hjælp af Bimolecular fluorescens komplementering

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/57316
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC); en billeddannelse-baserede metode, der kan bruges til at visualisere induceret nærhed af initiatoren caspases, som er det første skridt i deres aktivering.

Abstract

Familien caspase af proteaser spiller en afgørende rolle i apoptose og medfødt immunitet. Blandt disse er en undergruppe, kendt som initiativtager caspases først til at blive aktiveret i disse veje. Denne gruppe omfatter caspase-2, -8, samt -9 og den inflammatoriske caspases, caspase-1, -4 og -5. Initiatoren caspases aktiveres alle ved dimerization efter rekruttering til specifikke multiprotein komplekser kaldes aktivering platforme. Caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en billedbehandling-baseret tilgang, hvor split fluorescerende proteiner smeltet til initiativtager caspases bruges til at visualisere ansættelse af initiatoren caspases til deres aktivering platforme og den deraf følgende induceret nærhed. Denne fluorescens giver en udlæsning af en af de tidligste trin, der kræves for initiatoren caspase aktivering. Ved hjælp af en række forskellige mikroskopi-baserede tilgange, kan denne teknik give kvantitative data om effektiviteten af caspase aktivering på befolkningsniveau samt kinetik af caspase aktivering og størrelsen på og antallet af caspase aktivering komplekser på pr. celle basis.

Introduction

Familien caspase protease er kendt for deres kritiske roller i apoptose og medfødt immunitet 1. På grund af deres betydning, bestemme Hvornår, hvor, og hvor effektivt specifikke caspases er aktiveret kan give afgørende indsigt i mekanismerne af caspase aktivering veje. Imaging baseret protokollen beskrevet her giver mulighed for visualisering af de tidligste trin i caspase aktivering cascade. Denne teknik tager fordel af de dynamiske protein: protein interaktioner at drive caspase aktivering.

Caspases kan opdeles i to grupper: initiativtager caspases (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 og -12) og bøddel caspases (caspase-3, -6 og -7). Bøddel caspases er til stede i cellen som præfabrikerede dimere og aktiveres ved spaltning mellem store og små subunit 2. Når aktiveret, kløver de talrige strukturelle og regulerende proteiner resulterer i apoptose 3. Initiator-caspases er den første caspases at blive aktiveret i en pathway og aktivering af bøddel caspases vil normalt udløse. I modsætning til bøddel caspases aktiveres initiativtager caspases ved dimerization 4,5. Denne dimerization lettes ved ansættelse af inaktive monomerer til specifikke store molekylvægt komplekser kendt som aktivisering platforme. Montering af aktivering platforme er underlagt en række specifikke protein: protein interaktioner. Disse er medieret af bevarede protein interaktion motiver i den proform af initiatoren caspase og omfatter død domæne (DD), død effektor domæne (DED) og caspase rekruttering domæne (kort) 6 (figur 1A). Aktivering platforme generelt omfatter en receptor protein og en adapter protein. Receptoren er normalt aktiveret ved binding af en ligand, inducerende en konformationel ændring, der giver mulighed for oligomerisering af talrige molekyler. Receptoren derefter rekrutter enten caspase direkte eller adapter molekyler, der igen bringer caspase til komplekset. Således kommer talrige caspase molekyler i umiddelbar nærhed af tillader dimerization. Dette er kendt som den inducerede nærhed model 7. Når dimerized, gennemgår caspase følgende, som tjener til at stabilisere den aktive enzym 4,8. For eksempel, er montering af Apaf1 apoptosome udløst af cytokrom c efter sin løsladelse fra mitokondrier i en proces kaldet ydre membran permeabilization (Lungebetændelse). Apaf1 rekrutter igen caspase-9 gennem en interaktion, der er medieret af et kort til stede i begge proteiner 9. Lignende protein interaktioner resultatet i forsamlingen af CD95 død inducerende signalering komplekse (DISC) der fører til aktivering af caspase-8; PIDDosome, som kan aktivere caspase-2; og forskellige inflammasome komplekser, der indlede caspase-1 aktivering 10,11,12. Således rekrutteres initiativtager caspases til specifikke aktivering platforme af en fælles ordning resulterer i induceret nærhed og dimerization, uden hvilken aktivering vil ikke forekomme.

Caspase Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en billedbehandling-baseret analyse, der blev udviklet for at måle dette første trin i aktivering af initiatoren caspases, giver mulighed for direkte visualisering af caspase induceret nærhed efter aktivering platform forsamling. Denne metode udnytter af split fluorescerende proteiner Venus egenskaber. Venus er en lysere og mere photostable version af gul fluorescerende proteiner (YFP), der kan opdeles i to ikke-fluorescerende og lidt overlappende fragmenter: N-terminus Venus (Venus N eller VN) og C-terminus Venus (Venus C eller VC). Disse fragmenter bevarer evnen til at refold og bliver fluorescerende når i umiddelbar nærhed af 13. Hver Venus fragment er sammenvokset til prodomain af caspase, som er en minimal del af caspase, der binder sig til aktivisering platform. Dette sikrer, at caspases beholder ikke indstillingen enzymatisk aktivitet og derfor samtidige analyse af downstream hændelser i forbindelse med endogene arrangementer er muligt. Venus fragmenter refold når caspase prodomains rekrutteres til aktivering platform og gennemgå induceret nærhed. (Figur 1B). Den resulterende Venus fluorescens kan bruges til at nøjagtigt og konkret overvåge subcellulært lokalisering, at kinetik og effektiviteten af forsamling af initiatoren caspase aktivering platforme i enkelte celler. Imaging data kan erhverves ved Konfokal mikroskopi eller standard Fluorescens mikroskopi og kan tilpasses til en række forskellige mikroskopi metoder herunder: time-lapse imaging for at spore caspase aktivering i realtid; høj opløsning imaging til præcis bestemmelse af subcellulært lokalisering; og slutpunktet kvantificering af effektiviteten af aktivering.

Denne teknik blev først udviklet for at undersøge aktivering af caspase-214. Mens aktivisering platformen for caspase-2 menes at være PIDDosome, bestående af receptor PIDD (p53-induceret protein med en død domæne) og adapter RAIDD (RIP-associerede ICH-1/CAD-3 homologe protein med en død domæne), PIDDosome-uafhængig caspase-2 aktivering er blevet rapporteret. Dette tyder på, at yderligere aktivering platforme for caspase-2 findes 15,16. På trods af ikke at vide de fulde komponenter af caspase-2 aktivering platform, har caspase BiFC teknik tilladt for vellykket forhør af caspase-2 signalering veje på det molekylære niveau 14,17. Vi har også med succes tilpasset denne protokol for den inflammatoriske caspases (caspase-1, -4, -5 og -12) 18 og i princippet den samme tilgang bør være tilstrækkelige til ligeledes analysere hver af de resterende initiativtager caspases. Denne protokol kunne ligeledes være tilpasset til at undersøge andre veje var dimerization er en stor aktiverende signal. For eksempel, er STAT proteiner aktiveret af dimerization efter fosforylering af Janus kinase (JAK) 19. Således kan BiFC system anvendes til at visualisere for STAT aktivering samt mange andre veje, reguleret af dynamiske protein interaktioner. Følgende protokol giver trinvise instruktioner for indførelsen af journalister i celler samt metoder til billede erhvervelse og analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af celler og kultur retter

Bemærk: Udfør trin 1-3 i en vævskultur laminar flow hætte. Bære handsker.

  1. Hvis du bruger glas bund retter, pels glas med fibronektin. Spring til trin 1,2 Hvis bruger plast retter.
    1. Gøre en 0,1 mg/mL opløsning af fibronektin: 1 mL af 1 mg/mL fibronektin løsning i 9 mL 1 X PBS fortyndes.
    2. Dække glas bunden af hver brønd med 0,5-1 mL af fibronektin og inkuberes i 1-5 min ved stuetemperatur.
    3. Ved hjælp af en pipette, indsamle fibronektin løsning og opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: Fibronektin løsning kan genbruges flere gange.
    4. Vaske glas en gang med 1-2 mL 1 X PBS, og Opsug fra PBS.
  2. Plade 1 x 105 celler pr. brønd af et 6-godt plade i 2 mL af den relevante celle kultur medier (Se tabel 1 for celle numre til brug for forskellige størrelse wells). Hvis du bruger en cellelinje, der stabilt udtrykker caspase BiFC komponenter (Se diskussion), plade 2 x 105 celler og videre til behandling trin (trin 3).
  3. Tillad celler til at overholde parabol natten over ved 37 ° C i en vævskultur inkubator.

2. Transfektion af celler til at indføre caspase BiFC komponenter

  1. Transfect celler med passende Transfektion reagens.
    Bemærk: Denne protokol beskriver vejledningen for Lipofectamine 2000, som er blevet optimeret til minimal toksicitet. Denne protokol har held været anvendt i Hela celler, MCF7 celler og LN18 celler. Hvis du bruger ekstra Transfektion reagenser Følg fabrikantens anvisninger og optimere efter behov.
    1. Tilføje 12 µL Transfektion reagens til 750 µL af reducerede serum medier i sterile rør.
    2. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    3. Tilføje 10 ng af en reporter plasmid (et plasmid kodning en fluorescerende proteiner, fx rød fluorescerende protein [RFP], der vil mærke de transfected celler) til et sterile 1,5 mL rør til hver brønd til at være transfekteret.
    4. Tilføj 20 ng af hver caspase BiFC plasmid (f.eks.20 ng af caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC og 20 ng af C2 Pro-VN) til hver tube (tabel 2).
    5. Bringe hver tube op til et samlet volumen på 100 µL ved at tilføje nedsat serum medier.
    6. Bruger en p200 pipette, Tilsæt 100 µL af Transfektion reagens løsning fra trin 2.1.2 til plasmid blandingen i en dråbevis måde.
    7. Inkuber plasmid-Transfektion reagens blandes i 20 min. ved stuetemperatur.
    8. Opsug medier fra celler ved hjælp af en pipette eller med suge og derefter, ved hjælp af en p1000 pipette, afpipetteres 800 µL serum frie medier forsigtigt ned langs siden af brønden.
    9. Bruger en p200 pipette, tilføje 200 µL DNA-lipid komplekse dråbevis til hver brønd.
    10. Inkuber celler i vævskultur inkubator ved 37 ° C til 3 h.
    11. Pas på ikke at forstyrre éncellelag, fjerne serum frie medier, der indeholder DNA-lipid komplekser ved aspiration ved hjælp af suge eller med en pipette.
    12. Der afpipetteres 2 mL pre varmede (37 ° C) komplet vækst medier forsigtigt ned langs siden af hver brønd.
  2. Inkuber celler ved 37 ° C i en vævskultur inkubator i 24-48 timer for optimal protein udtryk.

3. induktion af caspase aktivering

  1. Behandling med et lægemiddel eller stimulus, der inducerer caspase aktivering ca 24 h efter Transfektion.
    1. Tilføj den ønskede koncentration af stof til pre varmede (37 ° C) tænkelig medier (komplet vækst medier suppleret med Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] og 2-mercaptoethanol [55 µM]) og blandes forsigtigt (tabel 3).
    2. Opsug medier fra celler ved hjælp af en pipette eller med suge og derefter, ved hjælp af en pipette, afpipetteres 2 mL af opløsningen fra 3.1.1 forsigtigt ned langs siden af brønden.
    3. Tilføj imaging medier uden stoffet til et godt som et ubehandlet kontrol.
  2. Inkuber celler i vævskultur inkubator ved 37 ° C eller gå videre til trin 4.3 for en time-lapse eksperiment.

4. Caspase BiFC dataopsamling

  1. Caspase BiFC for eneste gang punkt erhvervelse
    1. Tænde mikroskopet og fluorescerende lys kilde efter fabrikantens anvisninger.
    2. Finde celler under RFP filter og fokus på reporter gen fluorescens.
    3. Ved hjælp af en hånd-tally counter Tæl alle RFP-positive celler i det visuelle felt. Registrere antallet.
    4. Samtidig opretholde det samme synsfelt, skifte til normal god landbrugspraksis filter (eller YFP filter hvis det findes), og ved hjælp af en hånd-tally counter tælle antallet af røde blodlegemer, der er også grønne (Venus-positive). Skifte frem og tilbage mellem de to filtre til at sikre, at kun de røde blodlegemer er evalueret for Venus-positivitet. Optage at nummer (figur 3).
    5. Regne mindst 100 RFP-positive celler fra hver af tre individuelle områder af pladen.
    6. I hvert område, beregne procentdelen af Venus-positive transfekteret celler (dvs. røde blodlegemer, der er også grønne). Gennemsnittet af de heraf følgende nedsættelsesprocenter for at få standardafvigelsen.
  2. Tredimensional billeddannelse af caspase BiFC
    1. Tænde mikroskopet efter fabrikantens anvisninger og lancere erhvervelse software.
    2. Vælg den 60 x eller 63 x olie mål og placere en dråbe olie på målet
    3. Placere kultur parabol på mikroskop scene ved hjælp af den korrekte plade holder.
    4. Brug enten et epifluorescensmikroskop lyskilde og mikroskop øjet brik eller Konfokal lasere og computerskærmen, Naviger til et område af interesse.
    5. Fokusere på reporter fluorescens ved hjælp af RFP laser eller filter.
    6. Hvis epifluorescensmikroskop har været anvendt op til dette punkt, skifte lyskilden til Konfokal lasere og visualisere live-billeder fra cellerne som erhvervet af kameraet og viste erhvervelse software på computerskærmen.
    7. Brug joystick-styring og på focus-hjulet, finjustere fokus og placering af celler således at cellerne er i midten af udsigten finderen. Vælge celler, der er adskilt fra hinanden og ikke er overlappende.
    8. Input procentdel laser power til 50% og eksponeringstid på 100 ms for både Venus og RFP som udgangspunkt til at bestemme de optimale indstillinger skal bruges til forsøget.
    9. Tænd levende fangst og inspicere det resulterende billede og de ledsagende display histogrammer for begge kanaler.
    10. Hvis signalet er lav og billedet er svære at skimte, øge procentdel laser power og/eller eksponering tid i intervaller indtil signalet i billedet ser godt ud.
    11. Sikre, at signalet ikke når mætning. Inspicere display histogram for at sikre en tydelig peak er synlige for hver fluor. Hvis peak omfatter hele histogram display, input lavere laser power og eksponering indstillinger (figur 2).
    12. Visualisere kontrol (ubehandlet eller ikke-transfekteret) celler på samme betingelser til at sikre, at signalet er specifikke.
      Bemærk: Ensfarvet transfectants kan også bruges til kontrol for crossover, men hvis signalerne er rumligt adskilte (f.eks. mitokondrie versus cytosole) Dette er ikke nødvendigt.
    13. Vælg eller Åbn Z stak modul i mikroskop software.
    14. Ved hjælp af fokus knop, omtrentlige fokale stilling svarende til midten af cellen.
    15. Fokusér i én retning, indtil cellen ikke længere er synlige, skal du vælge dette som den øverste position.
    16. Fokusér i den modsatte retning, indtil cellen er igen ikke længere synlig og Vælg dette som den nederste position.
    17. Vælge den optimale skridt størrelse (normalt omkring 20 µm) og starte erhvervelse for at instruere kameraet automatisk tage et enkelt billede i hver kanal på hver af de 20 µm-trin mellem de øverste og nederste holdninger.
    18. Bruge 3D rendering software til at rekonstruere 3D-billede (fig. 4film 1).
  3. Time-lapse billeddannelse af caspase BiFC
    1. Mindst 1 time før eksperimentet, tænde mikroskopet og Indstil temperaturen til 37 ° C.
    2. Vælg 40 x eller 60 x 63 x olie mål og placere en dråbe olie på målet.
    3. Placere kultur parabol på mikroskop scene ved hjælp af den korrekte plade holder.
    4. Hvis en CO2 kilde er tilgængelig, skal du placere CO2 levering enhed (normalt plexiglas låg knyttet til røret, der leverer CO2) på toppen af plade-indehaveren. Sæt CO2 plan til 5% og tænde CO2 controller fra i softwaren. Hvis en CO2 kilde ikke er tilgængelig, omfatte 20 mM Hepes til buffer medierne.
    5. Naviger til et felt af transfekteret celler og visualisere live-billeder fra cellerne som erhvervet af kameraet og viste erhvervelse software på computerskærmen ved hjælp af RFP laser.
    6. Efter trin 4.2.8-4.2.12, input indstillingerne for procentdel laser power og eksponering tid for RFP laser. Holde disse værdier så lav som muligt mens du stadig være i stand til at opdage de fluorescerende signal.
    7. Ved hjælp af en positiv kontrol prøve (Se tabel 3 eksempler), Følg trin 4.2.8-4.2.12 til input indstillingerne for procentdel laser power og eksponering tid til YFP laserlys. Holde disse værdier så lav som muligt mens du stadig være i stand til at opdage Venus signal.
    8. For hvert hul i pladen, vælge en række forskellige positioner, der indeholder en eller flere celler, der udtrykker reporter.
    9. Input tidsintervallet mellem hver ramme af time-lapse og total antal billeder tages. Sikre, at der er tid til at erhverve alle de udvalgte positioner før næste stellet er at blive taget.
    10. Re-besøg hver position og korrigere og opdatere fokus efter behov.
    11. For at korrigere for fokale drift, der kan skyldes ændringer i temperatur eller eksterne vibrationer, tænde fokus drift korrektion system (hvis tilgængelig).
    12. Begynder den time-lapse og gemme data.
    13. Analysere data ved hjælp af gængse billedbehandlingsprogrammer (figur 5Movie 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på caspase-2 BiFC induceret af DNA-skader er vist i figur 3. Camptothecin, en topoisomerase jeg inhibitor, blev brugt til at fremkalde DNA skader og caspase-2 aktivering. Rødt fluorescerende protein mCherry blev brugt som en reporter at vise, at cellerne udtrykke BiFC sonde og at visualisere det samlede antal celler. Venus Fluorescens er vist i grøn og den store puncta repræsenterer caspase-2 induceret nærhed. Disse celler kan regnes for at bestemme procentdelen af Venus-positive celler. Konklusioner om subcellulært lokalisering kan også være fremstillet af sådanne billeder. I det viste eksempel blev caspase-2 induceret nærhed opdaget i nucleolus såvel som i cytoplasma 17. For at give høj opløsning visualisering af subcellulært lokaliseringen af caspase aktivering komplekse, kan enkelt celler være afbildet i tre dimensioner. Figur 4 viser to måder til at repræsentere disse 3D-billeder. Først er at skabe en 3D rekonstruktion af cellen. Eksemplet viser camptothecin-induceret caspase-2 BiFC i grøn og kernen i rød. 3D rekonstruktion viser den relative lokalisering af begge fluorophores i cellerne. Denne type resultater skærm er specielt effektivt, når præsenteret som en film, roterende celle omkring en enkelt akse (film 1). Det andet panel er ortogonale visningen af den samme celle. Dette giver i xy-, xz- og yz visualiseringen af celle på et bestemt punkt i cellen. Skildring af resultater på denne måde kan være mere egnet til en paper præsentation som i en Tidsskriftsartikel, da det er lettere at fortolke den 3D data præsenteret i et 2D-format. Figur 5 viser et eksempel på time-lapse billeddannelse af caspase-2 BiFC i en glioblastom cellelinie behandlet med proteasom hæmmer bortezomib (Se også Movie 2). Grafen viser stigningen i de gennemsnitlige Venus intensitet pr. celle et gennemsnit på tværs af en række celler (tilpasset fra 20). Denne type data kan også blive vist som en række enkelt celle spor på en graf. I det viste eksempel er udbruddet af caspase induceret nærhed omkring 2 timer efter behandling.

Figure 1
Figur 1: skematisk af caspase struktur og bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) metode. (A) generel struktur af en initiator caspase. De prodomain, små og store underenheder, og de bevarede QACRG motiv, der indeholder det aktive site cystein er afbildet. (B) BiFC bruger split fluorescerende proteiner, der alene er ikke fluorescerende men kan knytte til at reformere den fluorescerende molekyle når smeltet til interagerende proteiner. For caspase BiFC, den prodomain (Pro) eller fuld længde caspase er sammenvokset til N-terminalen halvt (Venus-N) og til C-terminalen halvdelen (Venus-C) af Venus. I deres monomere stat er caspase fusion proteiner ikke fluorescerende. Ved rekruttering til en aktivering platform, såsom PIDDosome, som vist her, er foreningen af de to halvdele af Venus håndhævet, der repræsenterer caspase induceret nærhed, der er målt som en stigning i Venus fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativt billede for anerkendelse mætning ved hjælp af displayet histogrammet. Eksempler på optimal (øverste panel) og mættede signaler (nederste panel) er vist. Venus (gul peak) og RFP (rød peak) signaler er vist. X-aksen angiver intensiteten og y-aksen er antallet af pixels. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Caspase-2 bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) efter DNA-skader. Hela celler udtrykker caspase-2 BiFC komponenter blev efterladt ubehandlet (A) eller behandlet med camptothecin (100 µM) (B) i nærværelse af qVD-OPH (20 µM). mCherry var Co udtrykt som en fluorescerende reporter. Repræsentative billeder viser celler (rød) med caspase-2 BiFC (grøn) i camptothecin-behandlede celler 16 h efter behandling. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: lokalisering af caspase-2 bimolecular fluorescens komplementering (BiFC). Hela celler udtrykker caspase-2 BiFC komponenter og en fluorescerende nukleare reporter blev behandlet med camptothecin (20 µM) i nærværelse af qVD-OPH (20 µM). 3D rekonstruktioner sammensat fra 0,1 μm seriel Konfokal billeder gennem z-cellen blev foretaget efter 24 timer og Vis kernen i røde og caspase-2 BiFC i grøn. Panelet til venstre viser en 3D maksimal intensitet projektion rendering genopbygning (Se også film 1). Højre panel viser visningen ortogonale skiver af den samme celle. Den midterste boks (blå) er flyet xy , den højre boks (gul) er planet, yz , og top boks (hvid) er xz flyet. Yz og xz fly skærer ifølge trådkorset. Skala søjler repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse af caspase bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) (A) LN18 glioblastom celler transfekteret med caspase-2 BiFC komponenter og en rød fluorescerende mitokondrie markør (DsRed-mito, rød) blev behandlet med bortezomib (15 nM) i nærværelse af qVD-OPH (20 µM). Cellerne blev placeret på en Konfokal mikroskop ved 37 ° C og billeder blev taget hver 2 min til 8 h. billeder af repræsentative celler fra time-lapse viser, at de inducerede nærhed af to caspase-2 BiFC komponenter resulterede i en stigning i Venus fluorescens ( grøn) over tid. (B) den gennemsnitlige intensitet af Venus i hver celle på hvert tidspunkt blev målt. Venus fluorescens steget over tid efter bortezomib behandling. Division i ubehandlet kontrol angivet lav eller ubetydelig toksicitet betingelser fra laserlys (figur tilpasset fra 20). Skala barer repræsenterer 20 µm. fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM) 8 (kontrol) og 14 (bortezomib) individuelle celler (Se også Movie 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Størrelse af pladen Antallet af celler Volumen af medier
6 godt plade 1 x 105 celler / godt 2 mL
12 godt plade 5 x 104 celler / godt 1 mL
24 godt plade 2.5 x 104 celler / godt 0,5 mL
4 kammer parabol 2.5 x 104 celler / afdeling 1 mL
8 afdeling parabol 1.25 x 104 celler / afdeling 0,5 mL

Tabel 1: retningslinjer for antallet af celler til plade. Hvis brug af celler, der stabilt udtrykker caspase bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) komponenter, dobbelt plade de beløb, der er vist her.

Størrelse af pladen Transfektion reagens Nedsat serum medier Reporter plasmid Caspase-pro VC plasmid Caspase-pro VN plasmid Nedsat serum media tilføjes plasmid mix Transfektion reagens løsningen føjes til plasmid mix Serum frie medier er føjet til celler
6 godt plade 12 µL/plade 750 ΜL 10 ng 20 ng 20 ng til i alt 100 µL 100 ΜL 800 ΜL
12 godt plade 12 µL/plade 750 ΜL 5 ng 10 ng 10 ng til i alt 50 µL 50 ΜL 400 ΜL
24 godt plade 12 µL/plade 750 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng til i alt 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
4 kammer parabol 4 µL/plade 250 ΜL 2.5 ng 5 ng 5 ng til i alt 25 µL 25 ΜL 200 ΜL
8 afdeling parabol 4 µL/plade 250 ΜL 1.25 ng 2.5 ng 2.5 ng til samlede 12,5 µL 12,5 ΜL 100 ΜL

Tabel 2: anbefalede mængder reagenser, der anvendes for forbigående Transfektion. Bemærk: mængden af plasmid foreslog er kun et udgangspunkt. Påvises der intet signal, anbefales det at titrere plasmid fra 20-200 ng per godt af en 6-godt plade.

Caspase Behandling Koncentration Tid Forventede resultater
Caspase-1 Over udtrykt ASC 250 ng/brønd af et 6 godt plade 48 h 50% BiFC positive
Caspase-2 Over udtrykt RAIDD 500 ng/brønd af et 6 godt plade 24 h 90% BiFC positive
Camptothecin 100 ΜM 16 h 30-60% BiFC positive
Heat shock 1 h ved 45 ° C 16 h 80% BiFC positive
Caspase-4 Overexpressed NALP1 250 ng/brønd af et 6 godt plade 48 h 30% BiFC positive
Caspase-5 Overexpressed IPAF 250 ng/brønd af et 6 godt plade 48 h 15% BiFC positive

Tabel 3: eksempler på positive kontroller for caspase bimolecular fluorescens komplementering (BiFC). Betingelser og forventede resultater er baseret på offentliggjorte data ved hjælp af Pro konstruerer 14,17,18. Co udtrykt plasmider bør være transfekteret sammen med BiFC plasmider (trin 2.1.4)

Movie 1
Movie 1: 3D lokalisering af caspase-2 bimolecular fluorescens komplementering (BiFC). 3D rekonstruktion, roteret omkring y-aksen af Konfokal billeder gennem z-plan af en Hela celler udtrykker caspase-2-BiFC komponenter og en fluorescerende nukleare reporter blev behandlet med camptothecin (20 µM) til 16 h. Filmen viser caspase-2 BiFC (grøn), og kernen (rød). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Movie 2
Movie 2: Time-lapse af caspase-2 bimolecular fluorescens komplementering (BiFC). LN18 glioblastom celler transfekteret med caspase-2 BiFC komponenter og behandlet med bortezomib (15 nm) blev afbildet hver 2 min til 8 h. Filmen viser caspase-2 BiFC (grøn), og mitokondrier (rød). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver brugen af split fluorescerende proteiner til at måle caspase induceret nærhed. Split Venus blev valgt for denne teknik, fordi det er meget lyse, højt photostable og den hvorved man genfolder er hurtig 13. Således, analysen af Venus, hvorved man genfolder ved caspase induceret nærhed kan give tæt på realtid skøn caspase protein interaktion dynamikker. Venus er opdelt i to lidt overlappende fragmenter, Venus (Venus-N eller VN) bestående af aminosyrer 1-173 N endestation og C terminal fragment (Venus-C eller VC) bestående af restkoncentrationer 155-239. Andre split fluorescerende proteiner findes men nogle, såsom split mCherry, kræver inkubation ved 4 ° C i op til 2 timer for hvorved man genfolder 21. Ekstra split fluorescerende proteiner herunder split Cerulean (en version af cyan fluorescerende proteiner) og langt rød split mLumin har endnu at blive testet i denne sammenhæng 13,22. I sidste ende, hvis disse fluorescerende proteiner bevise velegnet til måling af caspase induceret nærhed, kan dette tillade til samtidige vurdering af flere caspases.

Generelt, caspase prodomain (Pro)-regionen er sammenvokset til split fluorescerende fragmenter. Denne region indeholder en minimal del af caspase forpligtet til at binde sig til aktivisering platform og omfatter CARD eller DED interaktion motivet. Fordelen ved at bruge den prodomain er, at det ikke indføre nogen enzymatisk aktivitet til cellerne. Dette giver mulighed for samtidig overvågning af downstream begivenheder på grund af den endogene caspase. Forskning til dato har vist lidt forskel i kinetik og lokalisering af caspase BiFC mellem den prodomain og fuld længde caspase 14. Dog i fuld længde konstruktioner har tendens til at udtrykke med lavere effektivitet, nødvendiggør Transfektion af øgede mængder af plasmid DNA. Derudover anbefales det at mutere den katalytiske cystein til en Serin at forhindre caspase-induceret apoptose ved udtryk. Trods disse ulemper, kan visse undersøgelser kræver samstemmende analyse af fuld længde BiFC par at afgøre, om der er kontekst-afhængige forskelle i caspase induceret nærhed i tilstedeværelse eller fravær af de katalytiske domæner.

Denne protokol er specielt tilpasset til HeLa celler. Samme protokol fungerer godt for yderligere vedhængende cellelinjer herunder Mamma Cancer cellelinie, MCF-7, glioblastom cellelinie, LN18 og mus embryonale fibroblaster (MEF). Det anbefales, at brugeren optimerer både plating og Transfektion betingelser, når den tilpasser denne protokol til en ny celletype. Protokollen beskriver to vigtigste mikroskopi metoder, der kan bruges til at evaluere cellerne: epifluorescensmikroskop og konfokal mikroskopi. Når du bruger Konfokal mikroskopi, skal celler belagt på glas coverslips, fordi størstedelen af høj numerisk blænde mål, der bruges sammen med Konfokal mikroskopi ikke vil trænge ind tykkelsen af plast retter eller glas lysbilleder. Således, det anbefales at bruge retter med integrerede no. 1,5 glas coverslips, der har den optimale coverslip tykkelse på 0,17 mm. Der findes en række forskellige typer af disse retter der spænder fra individuelle 3 cm retter, til kammeret dias, til standard størrelse multi godt plader. Tabel 1 og 2 skitsere hvordan tilpasses plating og Transfektion instruktionerne til de forskellige godt størrelser. For epifluorescensmikroskop imaging er beskrevet her (4.1), standard plastik vævskultur plader er tilstrækkeligt, så længe mikroskop er udstyret med lang pass mål.

Fordi denne tilgang er faktisk en "lys på" metode til at måle caspase aktivering, er medtagelsen af en fluorescerende reporter vigtigt både at tillade visualisering af cellerne forud for eller i mangel af aktivering af caspase reporter og identificere de transfected celler, når forbigående Transfektion bruges. En række forskellige journalister kan bruges og de eneste kriterier, når du vælger en er: 1) fluorophore er tilstrækkeligt lys, så det let kan påvises ved den billeddiagnostiske protokol; og 2) sin fluorescerende spectrum ikke overlapper med de YFP. Grøn fluorescerende proteiner (NGL) bør for eksempel ikke anvendes som reporter fordi det vil blive opdaget af YFP filter eller laser bruges til at registrere Venus. Dette er på grund af den spektrale overlapning mellem de to fluorophores. At vælge en fluorophore, der lokaliserer til en specifik organelle kan give yderligere kvalitative oplysninger. For eksempel, brug af et protein, mål mitokondrier, som den røde fluorescerende protein DsRed-mito, kan give yderligere oplysninger om den overordnede rentabilitet af cellen. Mitokondrier har tendens til at gennemgå fragmentering (fission) i de tidlige stadier af celle død 23 og dette kan visualiseres med en reporter som DsRed-mito. Brug af en organelle markør som reporter kan også give konklusioner om subcellulært lokalisering af caspase BiFC skal foretages.

Der er en række måder at caspase BiFC data kan erhvervet og analyseret. Beslutte, hvilken metode der skal bruge bestemmes af parametrene, der skal undersøges (slutpunkt befolkning analyse versus enkelt celle positionelle eller kinetisk oplysninger) og tilgængeligheden af instrumentering og tænkelig programmel. Denne protokol beskriver et par mikroskop-baserede tilgange til at indsamle resultaterne af en caspase BiFC eksperiment for at opnå både enkelt tidspunkter og time-lapse data. Men det skal bemærkes at en række variationer og kombinationer af disse tilgange til at blive brugt kreativt afhøre caspase aktivering veje.

Enkelt tidspunkt dataopsamling (4.1) bruges til at bestemme procentdelen af celler med caspase induceret nærhed på et enkelt tidspunkt. For denne protokol tæller man blot antallet af transfekteret celler, der er Venus-positive. Højt specialiseret udstyr er således ikke nødvendigt og kun de mest grundlæggende epifluorescensmikroskop med en normal god landbrugspraksis (eller YFP) og RFP filter og en hånd tally counter er nødvendig. Nogle Billeddannende systemer kan være automatiseret at automatisk tage et angivet antal billeder pr. brønd af en plade. Hvis sådanne instrumentation er tilgængelige, celler i de erhvervede billeder på samme måde kan tælles ved visuel inspektion, eller quantitated ved hjælp af software til billedbehandling. Tredimensional billeddannelse (4.2) giver høj opløsning billeder af caspase BiFC i hele de fokale planer af cellen. En Konfokal mikroskop med lasere, der ophidse Venus og RFP (eller den valgte Transfektion reporter) og Z-stakken kapaciteter er påkrævet. En række 3D rendering softwaremoduler er til rådighed, der leverer forskellige måder at visualisere dataene. For begge disse typer af analyser er det muligt at lave celler og billede eller vurdere dem på et senere tidspunkt. Men processen med fiksering mindsker Venus signal, der kunne tilføje artefakter til analyse og denne fremgangsmåde anbefales derfor ikke. Time-lapse imaging (4.3) kan bruges til at give samtidige kinetisk og positionelle analyse af caspase BiFC. Et mikroskop udstyret med en motoriseret fase kan sættes op til at tage billeder af flere positioner og selv sammenligne forskellige behandlingsgrupper i det samme eksperiment.

For time-lapse, en række yderligere betragtninger bør tages i betragtning. Laserlys kan forårsage artefakter som følge af fototoksicitet eller photobleaching og begge skal kontrolleres. I almindelighed, kan begge undgås ved at bruge den lavest muligt mængden af lys (input lav procentdel laser power og korte eksponering gange i trin 4.3.6-4.3.7). Fototoksicitet resultater når laserlys inducerer død i cellerne og kan blive kontrolleret af imaging ubehandlede celler på samme betingelser og bekræfter, at celledeling provenuet som normalt. Photobleaching opstår Hvornår flere billeder taget af den samme celle falder fluorescens. Venus fluorescerende proteiner er helt photostable, så det er sjældent et problem i praksis. Virkningerne af photobleaching kan bestemmes ved at tage mange sekventielle billeder af et Venus-positive celler og at fluorescens forbliver stabil. Dette skal kun gøres en gang, så længe de samme laser power og eksponering indstillinger bruges til hvert eksperiment. Virkninger på grund af fototoksicitet eller photobleaching kan også mindskes ved at reducere det samlede antal billeder taget. Dette kan opnås ved forlængelse eller afkortelse tidsintervallet mellem fanger (trin 4.3.9). Brug af 5-10 min. intervaller over en 16 h time-lapse er et godt sted at starte. Hvis ikke photoxicity er observeret eller eksperimenter af kortere varighed er nødvendige, kan interval mellem rammer reduceres. Hvis caspase aktivering er hurtige, kan kortere eksperimenter med kortere tidsintervaller bruges. For eksempel, for en 16 h eksperiment med 10 min mellemrum, vil alt 192 billeder blive taget (96 for hver fluorophore) 2 h eksperiment med 1,5 m intervaller vil give 160 billeder. Derfor vil de lange og korte eksperimenter hver udsætte celler til lignende samlede mængder af laserlys. For kortvarige eksperimenter kan caspase aktivering stimulus føjes direkte til media umiddelbart forud for indledningen af time-lapse separation (efter trin 4.3.11 i stedet for på trin 3). For at gøre dette, Fjern låget fra pladen og forsigtigt falde i en oploesning indeholdende den stimulus, ved hjælp af en pipette. Passe på ikke at mase pladen og hurtigt at kontrollere, at cellerne er stadig i fokus før du fortsætter.

Når gennemfører time-lapse forsøg, er det også afgørende for at sikre de umiddelbare omgivelser af cellerne ligner, en vævskultur rugemaskine. En række miljømæssige kontrolelementer er tilgængelige på forskellige mikroskop sæt ups. Disse omfatter mindre fase top væksthuse samt miljømæssige kamre, der indkapsler den hele mikroskop. Begge disse enheder leverer normalt varme, CO2og fugtighed til salen på en måde, der kan styres nøjagtigt. Den præcis kontrol af CO2 og temperaturen er afgørende for succes af eksperimentet, fordi uventede temperatur udsving kan føre til fokale drift og fravær af CO2 forårsager pH i medierne til at stige, der kan være giftige for cellerne. Hvis en CO2 kilde ikke er tilgængelig, kan mediet bufferlagres ved tilsætning af Hepes (Se trin 3.1.1). Selv om en CO2 kilde er tilgængelig, anbefales det at medtage Hepes i den billeddiagnostiske medium som en ekstra foranstaltning til at holde cellerne sunde. Dog, selv i nærværelse af Hepes, fravær af CO2 for længere perioder kan forårsage celledød. Derfor er det vigtigt at inspicere ubehandlede celler, afbildet under de samme betingelser, og farven på medier ved afslutningen af forsøget at sikre, at pH er forblevet stabil. Bemærk, at phenol røde ikke behøver at være udeladt fra nogen af de medier, der anvendes i denne protokol da bidraget fra autofluorescence til Venus signal er minimal.

Der er flere tilgængelige metoder til at analysere de billeddiagnostiske data som følge af en time lapse eksperiment. Måling af gennemsnitlig intensiteten af Venus pixel pr. transfekteret celle er den mest enkle måde at analysere timingen af caspase induceret nærhed. Som vist i figur 3, figur 4, figur 5, optræder caspase-2 BiFC ofte som et eller flere puncta beliggende i forskellige subcellulært rum. Imaging analyse nærmer sig, at foranstaltningen antal foci, størrelsen på de objekter eller andre lignende faktorer kan give en informativ kvantitative data om disse strukturer. Ikke alle caspase BiFC vises som puncta. For eksempel, har de inflammatoriske caspases vist forskellige BiFC mønstre herunder diffus fluorescens, trådformede strukturer og én eller flere puncta pr. celle 18. Disse mønstre var afhængige af caspase aktiveret samt de opstrøms aktiverende signaler. Derfor, hvilken type analyse, der er mest egnet for time-lapse resultaterne vil i vid udstrækning blive dikteret af typen af fluorescerende mønstre, der er observeret.

Mange af de behandling stimuli, der er vurderet ved hjælp af denne protokol vil inducerer apoptose enten direkte gennem den caspase analyseret, eller indirekte ved en anden celle død pathway. Dette får cellerne til at skrumpe og løsnes fra pladen, hvilket gør det meget vanskeligt at billede cellerne og næsten umuligt at fastslå nogen bestemt lokalisering af caspase-BiFC. Medtagelsen af en pan-caspase hæmmer vil forhindre denne celledød. Ansættelse af caspases til deres aktivering platforme og den tilknyttede caspase BiFC er ikke afhængig af caspase katalytisk aktivitet. Derfor caspase hæmning vil have nogen effekt på dette trin, men vil hæmme downstream fysiske karakteristika af apoptose, herunder blebbing, udstationering og eventuel tab i plasma membran integritet. Således, hvis udførelsen af slutpunkt analyse (trin 4.1) eller Z stakke (trin 4.2), inddragelse af en caspase inhibitor er afgørende. For time-lapse eksperimenter derimod hvis apoptose-relaterede begivenheder som Lungebetændelse, annexin V bindende (at opdage phosphatidylphosphatid Serin eksponering) eller propidium Iodid optagelse (at opdage plasma membran permeabilization) skal analyseres sammen med caspase BiFC, den caspase hæmmer bør undlades at forhindre hæmning af disse begivenheder. En caspase hæmmer såsom qVD-OPh (10-20 µM) skal tilføjes i de medier, der indeholder den apoptose-inducerende stimulus (trin 3.1.1). Hvis Co udtrykker en pro-apoptotiske protein med caspase BiFC komponenter, bør caspase-hæmmer tilføjes på trin 2.1.12.

Mens caspase BiFC er en af de få tilgængelige metoder, der kan bruges til at visualisere begivenheder i caspase aktivering veje i levende celler, skal en række overvejelser tages i betragtning, når du udformer disse eksperimenter. Fordi denne tilgang er overekspression-baseret, kontrol for specificitet er vigtige. Dette kan ske på to måder. Først, indførelse af enkelt punktmutationer i kort eller DED af prodomain, således at de forstyrrer bindingen mellem caspase og dens aktivisering platform caspase bør mindske intensiteten af caspase BiFC og procentdelen af Venus-positive celler. For eksempel, mutation af rest D59 til E i prodomain af caspase-1 forstyrrer binding til adapteren protein ASC (apoptose-associerede plet-lignende protein som indeholder en kort) og lige så forstyrrer ASC-induceret caspase-1 BiFC 18,24 . For det andet vil brugen af celler, der er mangelfuld i adapter proteiner, der rekrutterer caspase aktivering-platformen falde specifikke BiFC signaler. Dette kan opnås ved hjælp af knockout celler, hvis den er tilgængelig, eller ved hjælp af siRNA eller CRISPR/Cas9-baserede tilgange til at nedbryder cellerne i adapteren. I overensstemmelse hermed, udtynding af caspase-2 adapter protein RAIDD helt blokeret caspase-2 BiFC induceret af heat shock eller DNA skader 14,17. For disse eksperimenter, knockout eller knockdown celler bør sammenlignes med matchede kontrol celler (dvs. kuld-matchede vildtype MEF eller kontrol knockdown celler), og hvis en ny cellelinje bruges, optimal Transfektion betingelser bør vurderes for at sikre lige udtryk af BiFC reporter på tværs af cellelinjer.

En anden begrænsning af denne tilgang er, at når du bruger forbigående Transfektion, det er vanskeligt at sikre, at hver celle udtrykker lige store mængder af hvert protein. Hvis udtryk er ulige, kunne en Venus fragment ansættes til platform ved højere frekvenser. Dette kunne maskere den fulde fluorescerende signal og fører til falsk negative resultater. For at løse dette problem, blev en ny version af caspase BiFC reporter for stabil celle linje generation for nylig rapporteret 17. Denne nye version bestod af en konstruktion, der udtrykte C2 Pro-BiFC komponenter på en enkelt åben behandling ramme adskilt af viral 2A selvstændige cleaving peptid 25. Derfor, BiFC komponenterne er transkriberet som en enkelt mRNA fra samme initiativtageren men oversat til at producere støkiometrisk lige store mængder af VC og VN fusion proteiner. Cellelinjer genereret stabilt udtrykke denne konstruktion viste lignende tendenser for aktivisering hen til de forbigående udtrykt journalister men var både mere følsomme og viste lavere baggrund fluorescens. Således, den ovennævnte protokol kan blive stærkt forenklet hvis bruges sammen med journalist cellelinjer, der stabilt express caspase BiFC komponenter.

Data til dato foreslår minimal interferens mellem komponenterne caspase BiFC samt de endogene proteiner. For eksempel caspase-2 er kendt for at være aktiveret opstrøms af Lungebetændelse, men caspase-2 BiFC ikke blokerer progression af Lungebetændelse 14. Disse journalister synes således ikke at agere på en dominerende negativ måde. Men hvis samtidig vurdere downstream begivenheder, dette bør undersøges inden for hvert sæt af eksperimenter. Herunder en kontrol, ikke-transfekteret godt i eksperimentet er den bedste måde at nærme sig dette. Hvis kinetik af celledød er uændret med eller uden udtryk af caspase sensoren, vil dette indikere, at komponenterne caspase-BiFC ikke forstyrrer endogene funktion. Omvendt, den endogene caspase kan muligvis påvirke BiFC udlæsning, enten i effektivitet eller størrelse eller form af strukturer. At udtrykke reporter i celler mangelfuld for caspase vil kontrollere for dette.

På trods af disse begrænsninger er caspase BiFC teknik en nyttig metode til at afhøre caspase aktivering veje, der kan supplere og endda forbedre på eksisterende metoder til at måle initiativtager caspase aktivering. Ved måling induceret nærhed, det første skridt i aktivering, overvinder denne teknik problemer forbundet med at måle senere trin som caspase auto-behandling i forbindelse med aktivering. For eksempel, mens du bruger vestlige skamplet for at overvåge kløvningen af bøddel caspases, giver caspase-3 og caspase-7, en nøjagtig måling af aktivering 2, ved hjælp af den samme tilgang til initiativtager caspases kan være behæftet med fejl. Dette skyldes, at kløvningen af initiatoren caspases, ikke er tilstrækkeligt for aktivering 4,26,27. I virkeligheden, er mange initiativtager caspases kløvet under apoptose af caspase-3 uden at producere aktive enzymer 28. Teknikker baseret på ved hjælp af peptid substrater udformet som mål for specifikke caspases skal ligeledes tage hensyn til de overlappende særlige forhold i disse sekvenser for caspases 29. Dette betyder ikke, at sådanne metoder ikke kan bruges til at måle caspase aktivering, men ulemperne bør anerkendes ved fortolkningen af resultaterne. Caspase BiFC giver en alternativ tilgang, der kan hjælpe bekræfte resultater ved hjælp af mere konventionelle metoder. Desuden er evnen til at spore forsamlingen af caspase aktivering komplekser i realtid og udpræget bestemme størrelse, form og lokalisering af komplekser en væsentlig fordel ved denne teknik, det ikke er muligt at vurdere med andre midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende alle de tidligere medlemmer af Bouchier-Hayes lab, der har bidraget til udviklingen af denne teknik. Dette arbejde var delvis finansieret af en Texas children's Hospital Pediatric Pilot award til LBH. Vi takker Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) om tilladelse til at omfatte data udgives i samarbejde med hendes team. Udviklingen af reagenserne beskrevet blev støttet af flowcytometri og celle sortering Core på Baylor College of Medicine med midler fra NIH (NIAID P30AI036211, NIC P30CA125123 og NCRR S10RR024574) og bistand fra Joel M. Sederstrom

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes Mattek P06G-1.5-20-F
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore FC010-10MG
DPBS Sigma D8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668019
OPTI MEM I Invitrogen 31985088
C2-Pro VC plasmid Addgene 49261
C2-Pro VN plasmid Addgene 49262
Inflammatory caspase BiFC plasmids available by request from LBH
HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components available by request from LBH
DsRed mito plasmid Clontech 632421 similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene
HEPES Invitrogen 15630106
2 Mercaptoethanol 1000X Invitrogen 21985023
q-VD-OPH Apex Bio A1901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
  2. Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
  3. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
  4. Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
  5. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  6. Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
  7. Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
  8. Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
  9. Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
  10. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  11. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  12. Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
  13. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  14. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  15. Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
  16. Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
  17. Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
  18. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
  19. Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
  20. Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
  21. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  22. Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
  23. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
  24. Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
  25. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  26. Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
  27. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  28. Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
  29. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).

Tags

Biokemi sag 133 Caspase apoptose Bimolecular fluorescens komplementering mikroskopi Venus Time-lapse
Belysning op veje til Caspase aktivering ved hjælp af Bimolecular fluorescens komplementering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes,… More

Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation. J. Vis. Exp. (133), e57316, doi:10.3791/57316 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter