Summary
Этот протокол описывает caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ); метод на основе изображений, который может использоваться для визуализации индуцированных близость инициатора caspases, который является первым шагом в их активации.
Abstract
Каспаза семья протеаз играть существенную роль в апоптозе и врожденного иммунитета. Среди них подгруппы, известный как инициатор caspases являются первым, чтобы быть активированы в этих путей. Эта группа включает caspase-2, -8, -9, а также воспалительные caspases, caspase-1, -4 и -5. Инициатор caspases активируются путем димеризации после набора конкретных multiprotein комплексов, называется активации платформ. Caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) является подход на основе изображений где разделить флуоресцентных белков, сливается с инициатора caspases используются для визуализации вербовки caspases инициатора для их активации платформ и в результате Индуцированная близости. Этот флуоресценции обеспечивает индикацию одного из первых шагов, необходимых для инициатора активацию caspase. С помощью ряда различных подходов, основанных на микроскопии, этот метод может обеспечить количественные данные по эффективности caspase активации на уровне населения, а также кинетика активацию caspase и размер и количество активацию caspase комплексы на основе за клеток.
Introduction
Семья протеазы caspase известны за их решающую роль в апоптозе и врожденный иммунитет 1. Из-за их важности, определения того, когда, где и как эффективно конкретных caspases активируются может обеспечить решающую понимание механизмов caspase пути активации. Изображений на основе протокола, описанные здесь позволяет визуализации первых шагов в каскад активацию caspase. Этот метод использует динамический: протеин взаимодействия, активацию caspase диск.
Caspases можно разделить на две группы: инициатор caspases (caspase-1, -2, -4, -5, 8, -9, -10 и -12) и палач caspases (каспазы-3, -6 и -7). Палач caspases присутствуют в ячейке как предварительно димеры и активируются расщепление между больших и малых субъединица 2. При активации, они прилепится многочисленных структурных и регламентационных белки, что приводит к апоптозу 3. Инициатор caspases являются первым caspases активироваться в пути и как правило сработает активировать caspases палача. В отличие от caspases палача инициатор caspases активируются димеризации 4,5. Этот димеризации способствует набору неактивных мономеров для конкретных большой молекулярный вес комплексы, известный как активации платформ. Ассамблея активации платформ регулируется ряд конкретных: протеин взаимодействия. Эти опосредовано сохраненных белков взаимодействия мотивы в proform caspase инициатор и включают смерть домен (DD), смерть эффекторных домен (DED) и caspase набора доменов (карта) 6 (рис. 1A). Активации платформ, как правило, включают белка рецептора и адаптер белка. Обычно, рецептор активируется при Связывание лиганда, вызывая конформационные изменения, что позволяет для олигомеризации многочисленных молекул. Рецептор затем либо новобранцев caspase непосредственно или адаптер молекулы, которые в свою очередь принести caspase комплекса. Таким образом многочисленные caspase молекулы вступают в непосредственной близости, разрешительные димеризации. Это известно как модель индуцированных близости 7. После димерной, caspase подвергается autoprocessing, который служит для стабилизации активной фермента 4,8. Например Ассамблея Апоптосома Apaf1 инициируется c тситохрома после его освобождения из митохондрий в процессе, называемом митохондриальной внешней мембраны permeabilization (MOMP). Apaf1 в свою очередь новобранцев caspase-9 путем взаимодействия, при посредничестве карты присутствует в обоих белков 9. Аналогичный результат взаимодействия протеина в Ассамблее CD95 смерти заставить сигнальный комплекс (диск), приводит к активации caspase-8; PIDDosome, который можно активировать caspase-2; и различные Инфламмасома комплексы, которые инициировать активацию caspase-1 10,,1112. Таким образом инициатор caspases набираются для конкретных активации платформ общий механизм результате индуцированного близости и димеризации, без которого не произойдет активации.
Caspase Bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) является на основе изображений assay который был разработан для измерения этот первый шаг в активировать caspases инициатора, позволяя прямой визуализации caspase индуцированной близости после активации платформы Ассамблеи. Этот метод использует свойства Сплит флуоресцентный белок Венеры. Венера является ярче и более фотостабилен версии желтого флуоресцирующего белка (рекламы ЯФП), которые могут быть разделены на два номера люминесцентные и слегка перекрывающихся фрагментов: N-го Венеры (Venus N или VN) и C-конечная Венеры (Venus C или VC). Эти фрагменты сохраняют способность сворачивают и стать флуоресцентные в непосредственной близости от 13. Каждый фрагмент Венера сливается с prodomain каспазы, который является минимальным часть caspase, который привязывает к платформе активации. Это гарантирует, что caspases не сохраняют ферментативную активность и поэтому параллельный анализ течению событий, связанных с эндогенного события можно. Венера фрагменты, сворачивают при caspase prodomains набираются для активации платформы и проходят индуцированных близости. (Рис. 1B). Результате флуоресценции Венеры может использоваться конкретно и точно контролировать субцеллюлярные локализации, кинетика и эффективности Ассамблеи инициатором caspase активации платформ в одиночных клетках. Визуализации данных могут быть приобретены confocal микроскопии или стандартные флуоресцентной микроскопии и может быть адаптирована к ряду различных микроскопии подходов, в том числе: промежуток времени визуализации для отслеживания активацию caspase в режиме реального времени; высокое разрешение изображения для точного определения субцеллюлярные локализации; и конечную точку количественная оценка эффективности активации.
Этот метод был впервые разработан для расследования активацию caspase-214. В то время как платформы активацию caspase-2 считается PIDDosome, состоящий из рецептора Паспортный (белок p53-индуцированной с доменом смерти) и RAIDD (RIP-связанные ICH-1/CAD-3 гомологичных белок с доменом смерти), адаптер PIDDosome независимый активацию caspase-2 было сообщено. Это свидетельствует о том, что дополнительные активации платформ для caspase-2 существуют 15,16. Несмотря не зная полного компоненты платформы активацию caspase-2, caspase БМФЦ техника позволила успешно допроса caspase-2 сигнальных путей на молекулярном уровне 14,17. Мы также успешно адаптировать этот протокол для воспалительных caspases (caspase-1, -4 и -5 -12) 18 и в принципе, такой же подход должен быть достаточно аналогичным образом проанализировать каждый из оставшихся caspases инициатора. Этот протокол также может быть адаптирована для изучения других путей были димеризации основных активируя сигнал. К примеру стат белки активируются димеризации после фосфорилирования Janus киназа (Як) 19. Таким образом система БМФЦ может использоваться для визуализации для стат активации, а также многих других путей, регулируется динамических белковых взаимодействий. Следующий протокол предоставляет пошаговые инструкции для введения репортеров в клетки, а также методологий для захвата изображений и анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток и культуры блюда
Примечание: Выполните действия 1-3 в культуре ткани Ламинарный шкаф. Надевайте перчатки.
- При использовании стекла дно блюда, слой стекла с фибронектин. Перейдите к шагу 1.2 при использовании пластиковых блюда.
- Сделайте раствор 0,1 мг/мл фибронектин: развести 1 мл раствора фибронектин 1 мг/мл в 9 мл ПБС.
- Покрытие стекла нижней части каждой скважины с 0,5-1 мл фибронектина и инкубировать в течение 1-5 мин при комнатной температуре.
- С помощью пипетки, фибронектин решение собирать и хранить при 4 ° C.
Примечание: Фибронектин раствор может быть использован несколько раз. - Мойте стекло один раз с 1-2 мл 1 X PBS и аспирационная от PBS.
- Пластина 1 х 105 клеток на хорошо 6-ну плиты в 2 мл соответствующую ячейку культуры средств массовой информации (см. в таблице 1 для числа клеток для использования для различных размеров колодцев). Если используется линия клетки, которая стабильно выражает caspase БМФЦ компоненты (см. обсуждение), тарелка 2 x 105 клеток и перейдите к шагу лечения (шаг 3).
- Позволяют клеткам придерживаться блюдо на ночь при 37 ° C в инкубатор культуры ткани.
2. transfection клетки представить caspase БМФЦ компонентов
- Transfect клетки с соответствующим трансфекции реагента.
Примечание: Этот протокол определяет инструкции для Lipofectamine 2000, который был оптимизирован для минимальных токсичности. Этот протокол был успешно используется в клетки Hela, MCF7 клетки и клетки LN18. При использовании дополнительных реагентов трансфекции следовать инструкциям производителя и оптимизировать при необходимости.- Добавьте 12 мкл Реагента трансфекции 750 мкл сокращение сыворотке СМИ в стерильную пробирку.
- Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить 10 нг репортер плазмида (плазмида кодирования флуоресцентный белок, например красный флуоресцирующий белок [запрос], который будет ярлык transfected клеток) в стерильных 1,5 мл трубку для каждой скважины, котор нужно transfected.
- Добавить 20 нг каждого caspase БМФЦ плазмида (например, 20 нг caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC и 20 нг C2 Pro-VN) в каждую пробирку (Таблица 2).
- Принесите каждой трубы до суммарный объем 100 мкл, добавив сокращение сыворотке СМИ.
- С помощью пипетки p200, добавьте 100 мкл раствора реагента трансфекции из шага 2.1.2 плазмида смесь прикапывают образом.
- Инкубируйте плазмида трансфекции реагент микс 20 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная СМИ из клеток с помощью пипетки или с всасывания и затем, используя пипетку p1000, Пипетка 800 мкл сыворотки свободных средств массовой информации осторожно вниз стороне хорошо.
- С помощью пипетки p200, добавьте 200 мкл, комплекса ДНК липидов прикапывают в каждой скважине.
- Инкубируйте клетки культуры ткани инкубатора при 37 ° C 3 h.
- Стараясь не нарушить монослоя, удалить сыворотки свободные средства массовой информации, содержащие комплексов ДНК липидов, стремление с помощью всасывания или с пипеткой.
- Пипетка 2 мл подогретым (37 ° C) полный рост СМИ нежно вниз стороне каждой скважины.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубатор культуры ткани за 24-48 ч для оптимального белков.
3. индукция активацию caspase
- Относиться с наркотиками или стимул, который индуцирует caspase активации около 24 ч после transfection.
- Добавьте желаемой концентрации препарата в предварительно разогретую (37 ° C) изображений массовой (полный рост дополнена 2-меркаптоэтанол [55 мкм] и Hepes [20 мм, pH 7,2-7, 5]) и перемешать аккуратно (Таблица 3).
- Аспирационная СМИ из клеток с помощью пипетки или с всасывания и затем, используя пипетку, Пипетка 2 мл раствора от 3.1.1 нежно вниз стороне хорошо.
- Добавьте изображения СМИ без наркотиков одной скважиной как необработанных элемента управления.
- Инкубировать клетки культуры ткани инкубатора при 37 ° C или перейдите к шаг 4.3 для покадровой эксперимента.
4. Caspase БМФЦ сбора данных
-
Caspase БМФЦ для приобретения точки один раз
- Включите микроскоп и флуоресцентный источник света следуя инструкциям производителя.
- Найти клетки под ППП фильтра и сосредоточиться на Репортер ген флуоресценции.
- Используя руку Талли счетчик, счетчик все ППП положительных клеток в поле зрения. Запишите номер.
- При сохранении же зрительного поля, перейдите на GFP фильтр (или рекламы ЯФП фильтр, если таковые имеются) и, используя руку Талли счетчик, подсчитать количество эритроцитов, которые также являются зеленый (Венера позитивных). Переключаться между двумя фильтры, чтобы убедиться, что только красные клетки, оцениваются для Венеры позитивность. Запишите номер (рис. 3).
- Рассчитывать по крайней мере 100 ППП положительных клеток от каждой из трех отдельных областей пластины.
- В каждой области вычислить процент Венеры положительных transfected клеток (то есть красные клетки, которые также являются зеленый). Средняя полученный процент чтобы получить стандартное отклонение.
-
Трехмерных изображений caspase БМФЦ
- Поверните на микроскопе после инструкции производителя и запуска приобретения программного обеспечения.
- Выделите 60 x 63 x нефти цель и поместите каплю масла на цель
- Место культуры блюдо на микроскопа, используя правильный пластины держателя.
- С помощью эпифлуоресцентного источник света и кусок глаз Микроскоп или конфокальный лазеры и на экране компьютера, перейдите к области интереса.
- Сосредоточиться на флуоресценции репортер, с помощью лазерного ППП или фильтр.
- Если эпифлуоресцентного использовался вплоть до этого момента, источник света переключиться конфокальный лазеры и визуализировать живой клетки приобретенного камеры и отображаемые на приобретение программного обеспечения на экране компьютера.
- С помощью джойстика управления и фокус колесо, Настройте фокус и положение клетки так, что клетки находятся в центре видоискателя. Выберите ячейки, которые отделены друг от друга и не являются перекрывающимися.
- Потребляемая мощность лазера процент до 50% и время воздействия на 100 мс для Венеры и ППП как отправной точки для определения оптимальных параметров для эксперимента.
- Включите видеосъемки и проверить получившееся изображение и сопровождающие отображения гистограммы для обоих каналов.
- Если сигнал низкий, и изображение будет трудно разглядеть, увеличивайте время мощности и/или воздействия лазера процент с шагом до тех пор, пока сигнал в изображении выглядит хорошо.
- Убедитесь, что сигнал не достигают насыщения. Проверка отображения гистограммы, чтобы убедиться, что собственный пик является видимым для каждого Флуор. Если пик охватывает весь гистограммы, ввод ниже параметров по мощности и воздействия лазера (рис. 2).
- Визуализируйте клетки управления (необработанных или не transfected) на тех же условиях, что обеспечивает конкретный сигнал.
Примечание: Один цвет transfectants также может использоваться для управления кроссовер, но если сигналы являются пространственно собственный (например митохондриальной против цитозольной) это не является необходимым. - Выберите или откройте модуль Z стека в Микроскоп программного обеспечения.
- Используя Регулятор фокуса, приблизительное положение фокуса, соответствующий центр ячейки.
- Отрегулируйте фокус в одном направлении, до тех пор, пока ячейка больше не виден, выберите это в качестве верхней позиции.
- Отрегулируйте фокус в противоположном направлении до тех пор, пока ячейка снова больше не видна и выберите это в качестве нижней позиции.
- Выберите оптимальный шаг размер (обычно около 20 мкм) и начать приобретение поручить камеры автоматически принять одно изображение в каждом канале, в каждом из 20 мкм шагов между верхней и нижней позиции.
- Используйте 3D-рендеринга программного обеспечения для воссоздания 3D изображения (Рисунок 4фильм 1).
-
Промежуток времени визуализации caspase БМФЦ
- По крайней мере за 1 час до эксперимента, включите микроскопом и установите температуру до 37 ° C.
- Выберите 40 x, 60 x или 63 x нефти цель и поместите каплю масла на цель.
- Место культуры блюдо на микроскопа, используя правильный пластины держателя.
- Если доступен источник2 CO, место устройства доставки CO2 (обычно оргстекла крышка прилагается к трубе, которая обеспечивает CO2) поверх пластины держателя. Уровень CO2 до 5% и включите контроллер2 CO из программного обеспечения. Если не доступен источник CO2 , включают в себя 20 мм Hepes в буфер средств массовой информации.
- Перейдите к полю transfected клеток и визуализировать живой клетки приобретенного камеры и отображаемые на приобретение программного обеспечения на экране компьютера, с помощью лазера ППП.
- Следующие шаги 4.2.8-4.2.12, введите настройки процент лазер сила и выдержка времени для ППП лазер. Держите эти значения как низкий, как можно еще будучи в состоянии обнаружить флуоресцентного сигнала.
- Используя положительный контроль образца (см. таблицу 3 примеры), выполните шаги 4.2.8-4.2.12 для ввода параметров процент лазер сила и выдержка времени для рекламы ЯФП лазерного света. Держите эти значения как низкий, как можно еще будучи в состоянии обнаружить сигнал Венеры.
- Для каждой скважины пластины выберите несколько различных позиций, которые содержат одну или несколько ячеек, выражая репортер.
- Введите временной интервал между каждого кадра отснятого и общее количество кадров, которые необходимо принять. Убедитесь, что есть время, чтобы приобрести все выбранные позиции, прежде чем принимать следующий кадр.
- Повторное посещение каждой позиции и исправить и обновить фокус при необходимости.
- Для коррекции фокуса дрейф, которые могут возникнуть в результате изменения температуры или внешних вибраций, включите систему коррекции дрейф фокус (если доступно).
- Начать промежуток времени и сохранить данные.
- Анализировать данные с помощью имеющихся изображений программное обеспечение (рис. 5фильм 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3показан пример caspase-2 БМФЦ индуцированных повреждений ДНК. Камптотецина, Топоизомераза I ингибитор, был использован для активации ДНК повреждения и caspase-2. MCherry красный флуоресцирующий белок использовался в качестве репортера чтобы показать, что клетки Экспресс БМФЦ зонд и помочь визуализировать общее количество клеток. Венера флуоресценции показано зеленым цветом и представляют большой puncta caspase-2 индуцированной близости. Эти клетки могут засчитываться для определения доли Венеры положительных клеток. Выводы о субцеллюлярные локализации также могут быть сделаны из таких изображений. В этом примере показано caspase-2 индуцированные близости был обнаружен в ядрышко, также как и в цитоплазме 17. Для обеспечения визуализации высокого разрешения субцеллюлярные локализации комплекс активацию caspase, единичных клеток может отражаться в трех измерениях. На рисунке 4 показаны два способа представляют такие 3D изображения. Первый заключается в создании 3D-реконструкции ячейки. В примере камптотецина индуцированной БМФЦ caspase-2 в зеленый и ядро в красный цвет. 3D реконструкция показывает относительную локализации обоих флуорофоров всей клетки. Этот тип отображения результатов является особенно эффективным, когда представил, как фильм, вращающихся ячеек вокруг одной оси (фильм 1). Вторая группа-это ортогональный вид той же клетке. Это обеспечивает xy, xzи yz визуализации ячейки в определенной точке в ячейке. Изображение результатов таким образом может быть больше подходит для презентации бумаги как в статье журнала, как это легче интерпретировать 3D данные представлены в формате 2D. На рисунке 5 показан пример покадровой съемки БМФЦ caspase-2 в линии клеток глиобластомы относились с Бортезомиб ингибитором протеасом (см. также фильм 2). График показывает увеличение средней интенсивности Венеры в клетку, в среднем через ряд клеток (адаптировано из 20). Этот тип данных может также отображаться как число следов одну ячейку на одном графике. В этом примере показано начала caspase индуцированной близости — около 2 ч, после лечения.
Рисунок 1: схема caspase структуры и методологии bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). (A) общая структура caspase инициатора. Prodomain, крупных и мелких подразделений и сохраняется QACRG мотив, который содержит активный сайт хвоща изображены. (B) БМФЦ использует Сплит флуоресцентные белки, которые самостоятельно не флуоресцентные, но можно связать реформировать флуоресцентные молекулы когда плавленый взаимодействуя белками. Для caspase БМФЦ, prodomain (Pro) или полноразмерные caspase сливается с N-терминальный половина (Венера-N) и C-терминал половины Венеры (Venus-C). В их мономерном состоянии протеины сплавливания caspase не флуоресцентные. После набора для активации платформы, такие как PIDDosome как показано здесь, Ассоциация две половинки Венеры соблюдается, представляющие caspase индуцированной близости, которая измеряется как увеличение в флуоресцировании Венеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель изображение для признания насыщенность с помощью отображения гистограммы. Приведены примеры оптимальных (верхняя группа) и насыщенных сигналов (нанижней панели). Венера (желтый пик) и ППП (красный пик) сигналы отображаются. Ось x указывает интенсивность и оси y число пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) после повреждения ДНК. Клетки HELA, выражая компоненты БМФЦ caspase-2 были остается необработанной (A) с камптотецина (100 мкм) или (B) при наличии qVD-OPH (20 мкм). mCherry был совместно выразили как флуоресцентные репортер. Представитель изображения показывают ячейки (красный) с БМФЦ caspase-2 (зеленый) в камптотецина лечение клетки 16 h после лечения. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: локализация caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). Клетки HELA, выражая caspase-2 БМФЦ компонентов и флуоресцентные ядерной репортер относились с камптотецина (20 мкм) в присутствии qVD-OPH (20 мкм). 3D реконструкций в составе от 0,1 мкм серийный конфокальный изображений через z-плоскости клетки были сделаны после 24 ч и показать ядро в красный и caspase-2 БМФЦ зеленым цветом. Левая панель показывает реконструкция рендеринга 3D максимальная интенсивность проекции (см. также фильм 1). Правой панели отображаются ортогональных срезов той же клетке. Поле среднего (синий) в плоскости xy , поле справа (желтый) представляет собой плоскость yz , и приставка (белый) плоскости xz . Плоскости yz и xz пересекаются согласно перекрестие. Масштаб бары представляют 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: покадровый caspase bimolecular флуоресценции взаимодополняемости (БМФЦ) (A) transfected клеток глиобластомы LN18 с компонентами БМФЦ caspase-2 и флуоресцентные митохондриальной красный маркер (DsRed Мито, красный) лечили Бортезомиб (15 Нм) при наличии qVD-OPH (20 мкм). Клетки были размещены на конфокального микроскопа при 37 ° C и изображения были взяты каждые 2 мин за 8 ч. изображения представитель клеток от промежуток времени показывают, что индуцированных близость этих двух компонентов БМФЦ caspase-2 привело к увеличению в флуоресцировании Венеры ( Зеленый) с течением времени. (B) была измерена средняя интенсивность Венеры в каждой ячейке в каждый момент времени. Венера флуоресценции увеличилась с течением времени после лечения, Бортезомиб. Отдел в необработанной управления указал условия низкий или ничтожно малый токсичности от лазерного света (рисунок адаптировано из 20). Масштаб представляют 20 мкм. Ошибка бары представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) 8 (контроль) и 14 (Бортезомиб) отдельных клеток (см. также фильм 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Размер пластины | Количество ячеек | Объем средств массовой информации |
| 6 хорошо пластины | 1 х 105 клеток / хорошо | 2 мл |
| 12 хорошо пластины | 5 x 104 клетки / хорошо | 1 мл |
| 24 хорошо пластины | 2,5 х 104 клетки / хорошо | 0,5 мл |
| 4 камеры блюдо | 2,5 х 104 ячейки / инструментальная | 1 мл |
| 8 палата блюдо | 1.25 х 104 ячейки / инструментальная | 0,5 мл |
Таблица 1: руководящие принципы для количества клеток к пластине. Если с использованием клеток, стабильно выражая caspase bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ) компонентов, пластины двойной суммы, показанные здесь.
| Размер пластины | Трансфекция реагент | Сокращение сыворотке СМИ | Репортер плазмиды | Каспаза про VC плазмиды | Каспаза про VN плазмиды | Сокращение сыворотке СМИ добавил плазмида смесь | Трансфекция реагент решение добавляется плазмида микс | Свободные СМИ сыворотки добавлены ячейки |
| 6 хорошо пластины | 12 мкл/плита | 750 МКЛ | 10 нг | 20 нг | 20 нг | в общей сложности 100 мкл | 100 МКЛ | 800 МКЛ |
| 12 хорошо пластины | 12 мкл/плита | 750 МКЛ | 5 нг | 10 нг | 10 нг | в общей сложности 50 мкл | 50 МКЛ | 400 МКЛ |
| 24 хорошо пластины | 12 мкл/плита | 750 МКЛ | 2.5 нг | 5 нг | 5 нг | в общей сложности 25 мкл | 25 МКЛ | 200 МКЛ |
| 4 камеры блюдо | 4 мкл/плита | 250 МКЛ | 2.5 нг | 5 нг | 5 нг | в общей сложности 25 мкл | 25 МКЛ | 200 МКЛ |
| 8 палата блюдо | 4 мкл/плита | 250 МКЛ | 1.25 нг | 2.5 нг | 2.5 нг | в общей сложности 12,5 мкл | 12.5 МКЛ | 100 МКЛ |
Таблица 2: рекомендуемые объемы реагентов, используемых для переходных transfection. Примечание: количество плазмида предложил является только отправной точкой. Если сигнал не обнаружен, рекомендуется Титруйте плазмиды от 20-200 ng за хорошо 6-ну плиты.
| Каспаза | Лечение | Концентрация | Время | Ожидаемые результаты |
| Caspase-1 | Чрезмерно выраженная ASC | 250 нг/хорошо 6 хорошо плиты | 48 ч | 50% БМФЦ положительный |
| Caspase-2 | Чрезмерно выраженная RAIDD | 500 нг/хорошо 6 хорошо плиты | 24 h | 90% БМФЦ положительный |
| Камптотецина | 100 МКМ | 16 h | 30-60% БМФЦ положительный | |
| Теплового шока | 1 час при температуре 45 ° C | 16 h | 80% БМФЦ положительный | |
| Каспаза-4 | Гиперэкспрессия NALP1 | 250 нг/хорошо 6 хорошо плиты | 48 ч | 30% БМФЦ положительный |
| Каспаза-5 | Гиперэкспрессия IPAF | 250 нг/хорошо 6 хорошо плиты | 48 ч | 15% БМФЦ положительный |
Таблица 3: примеры положительных элементов для caspase bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). Условия и ожидаемые результаты основаны на опубликованных данных с использованием Pro создает 14,17,18. Наряду с БМФЦ плазмид (шаг 2.1.4) следует transfected совместно выразили плазмиды
Фильм 1: 3D локализация caspase-2 bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ). 3D-реконструкции, вращается вокруг y-ось конфокальный изображений через z-плоскости НеЬа клетки, выражая caspase-2-БМФЦ компоненты и флуоресцентные ядерной репортер лечили камптотецина (20 мкм) для 16 h. Фильм показывает БМФЦ caspase-2 (зеленый) и ядро (красный). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: покадровый caspase-2 bimolecular флуоресценции взаимодополняемости (БМФЦ). LN18 клеток глиобластомы transfected с компонентами БМФЦ caspase-2 и относились с Бортезомиб (15 Нм) были образы каждые 2 мин за 8 ч. Фильм показывает БМФЦ caspase-2 (зеленый) и митохондриях (красный). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает использование Сплит флуоресцентных белков для измерения caspase индуцированной близости. Сплит Венера был выбран для этой техники, потому что это очень яркий, очень фотостабилен и складывая является быстрый 13. Таким образом анализ Венеры, складывая по близости caspase индуцированных может предоставить недалеко от реального времени оценки динамики взаимодействия caspase белка. Венера делится на два слегка перекрывающихся фрагментов, N-го Венеры (Venus-N или VN) состоит из аминокислот 1-173 и Терминал C фрагмент (Венера-C или VC) состоит из остатков 155-239. Существуют другие Сплит флуоресцентных белков, но некоторые, такие как Сплит mCherry, требуют инкубации при температуре 4 ° C до 2 ч для складывая 21. Дополнительные Сплит флуоресцентные белки включая Сплит Cerulean (версия голубой флуоресцентный белок) и mLumin далеко красный Сплит до сих пор испытываться в данном контексте 13,22. В конечном счете если эти флуоресцентные белки доказать подходит для измерений индуцированных caspase близости, это может позволить для одновременной оценки нескольких caspases.
Как правило prodomain (Pro) регион caspase сливается с Сплит флуоресцентные фрагментов. Этот регион содержит минимальную часть caspase, необходимые для привязки к активации платформы и включает в себя карты или дед взаимодействия мотив. Преимущество использования prodomain является, что он не вводить каких-либо ферментативную активность клеток. Это позволяет одновременный мониторинг течению событий вследствие эндогенного caspase. Исследования на сегодняшний день показал небольшое различие в кинетика и локализации caspase БМФЦ между prodomain и полная длина caspase 14. Однако полнометражные конструкции, как правило, выражают с более низкой эффективности, требуя трансфекции повышенных количествах плазмидной ДНК. Кроме того рекомендуется мутировать каталитического цистеина для Серина для предотвращения caspase индуцированного апоптоза выражение. Несмотря на эти недостатки некоторые расследования может потребоваться параллельный анализ полная длина БМФЦ пар, чтобы определить, имеются ли различия контекстно зависимые в близости caspase индуцированной в наличие или отсутствие катализатора доменов.
Этот протокол является специально адаптирован для НеЬа клетки. Тот же протокол работает хорошо для дополнительных адэрентных клеток линии, включая линии клеток молочной железы, MCF-7, линии клеток глиобластомы, LN18 и мышь эмбриональных фибробластов (MEF). Рекомендуется, что пользователь оптимизирует обшивкой и трансфекции условий при адаптации этот протокол на новый тип ячейки. Протокол описывает два основных микроскопии подходы, которые могут использоваться для оценки клетки: эпифлуоресцентного и confocal микроскопии. При использовании confocal микроскопии, клетки должны покрытием на стекло coverslips потому, что большинство целей высокая числовая апертура, которые используются в сочетании с confocal микроскопии не проникнет толщина блюда, пластиковых или стеклянных скольжениях. Таким образом рекомендуется использовать посуду с встроенный № 1,5 стекла coverslips, которые имеют оптимальное coverslip толщина 0,17 мм. Целый ряд различных типов этих блюд доступны в диапазоне от индивидуальных 3 см блюд, до камеры слайды, Стандартный размер нескольких хорошо пластины. В таблицах 1 и 2 изложить как адаптировать обшивкой и трансфекции инструкции для различных размеров хорошо. Для эпифлуоресцентного изображений это описано здесь (4.1), стандартные пластиковые культуры ткани пластины достаточно до тех пор, как микроскоп оснащен длинный пас целей.
Потому что такой подход фактически «огни на» метод измерения активацию caspase, включение репортера флуоресцентные важно позволить визуализации ячеек до или в отсутствие активацию caspase репортер и определить transfected клеток, когда переходные трансфекции используется. Количество различных Репортеры могут использоваться и используются только критерии при выборе одной: 1) Флюорофор достаточно яркий, так что она может быть легко обнаружена изображений протоколом; и 2) флуоресцентного спектра не перекрываются с этим рекламы ЯФП. Например Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) не следует использоваться как репортер, потому, что он будет обнаружен рекламы ЯФП фильтр или лазер, используемый для обнаружения Венеры. Это обусловлено спектрального наложения двух флуорофоров. Выбор Флюорофор, которая локализуется в определенных органелл может предоставить дополнительные качественной информации. Например используйте белка, что цели митохондрий, таких как красный флуоресцирующий белок DsRed Мито, может предоставить дополнительную информацию о общей жизнеспособности клетки. Митохондрии, как правило, подвергаются фрагментации (расщепление) на ранних этапах клеток смерть 23 , и это могут быть визуализированы с репортером как DsRed Мито. Использование маркера органеллы как репортер можно также разрешить выводы о субцеллюлярные локализации caspase БМФЦ быть сделаны.
Существует ряд способов что caspase БМФЦ данные могут быть приобретены и проанализированы. Решение, какой метод использовать будет определяться параметрами необходимо изучить (конечной анализ населения против одноклеточных позиционным или кинетическим информацию) и наличия аппаратуры и программного обеспечения. Этот протокол определяет несколько Микроскоп подходов к сбору результатов caspase БМФЦ эксперимент для приобретения очков один раз и промежуток времени данных. Однако, следует отметить, что количество вариации и комбинации этих подходов к использоваться творчески допросить caspase активации пути.
Один момент сбора данных (4.1) используется для определения доли клеток с caspase индуцированной близости на один момент. Для этого протокола один просто подсчитывает количество transfected клеток, которые являются Венеры позитивными. Таким образом, не требуется высоко специализированное оборудование и только самые основные эпифлуоресцентного микроскопа с помощью GFP (или рекламы ЯФП) и требуется запрос фильтра и ручной подсчет счетчик. Некоторые системы могут быть автоматизированы автоматически занять определенное количество изображений на хорошо плиты. При наличии такого инструментария, клетки в приобретенные изображения могут быть подсчитаны аналогичным путем визуального осмотра, или предел, с использованием изображений программное обеспечение. Трехмерных изображений (4.2) обеспечивает высокое разрешение изображения caspase БМФЦ всей плоскости фокуса ячейки. Конфокальный микроскоп с лазерами, которые возбуждают Венеры и ППП (или выбранной трансфекции репортер) и Z-стек возможности не требуется. Количество модулей программного обеспечения 3D-рендеринга доступны, предоставляют различные способы визуализации данных. Для обоих этих видов анализа это можно исправить клетки и изображения или оценить их на более позднем этапе. Однако процесс фиксации уменьшить Венера сигнал, который может добавить артефакты в анализ, и поэтому этот подход не рекомендуется. Промежуток времени изображений (4.3) может использоваться для обеспечения одновременной кинетические и позиционные анализа caspase БМФЦ. Оснащены моторизованного столика микроскопа можно настроить изображения нескольких позиций и даже сравнить различные группы в том же эксперименте.
Для покадровой, ряд дополнительных соображений должно приниматься во внимание. Лазерный свет может вызвать артефакты из-за Фототоксичность или Фотообесцвечивание, и оба должны контролироваться для. В общем как можно избежать с помощью минимально возможное количество света (ввода низкий процент лазерной энергии и короткой экспозиции раз в шаги 4.3.6-4.3.7). Фототоксичность результаты, когда лазерный свет вызывает смерть в клетках и может управляться для изображений необработанных клетки на тех же условиях и подтверждающий, что деление клеток продолжается как обычно. Фотообесцвечивание происходит, когда несколько снимков, сделанных из той же клетке уменьшается флуоресценции. Флуоресцентный белок Венера является довольно фотостабилен, так что это редко проблемы на практике. Эффекты Фотообесцвечивание можно определить путем принятия многочисленных последовательных изображений Venus положительных клеток и обеспечения флюоресценция остается стабильной. Это только необходимо сделать один раз, поскольку для каждого эксперимента используются те же параметры питания и воздействия лазера. Эффекты обусловлены Фототоксичность или Фотообесцвечивание также могут быть смягчены путем сокращения общее количество изображений, полученных. Это может быть достигнуто путем удлинения или сокращения временной интервал между захватывает (шаг 4.3.9). С помощью 5-10 мин интервалами над 16 h промежуток времени является хорошим местом для начала. Если не photoxicity наблюдается или необходимы эксперименты меньшей продолжительности, интервал между кадрами может быть уменьшена. В случае быстрого активацию caspase, может использоваться короче эксперименты с более короткие интервалы времени. Например 16 h эксперимент с интервалами 10 мин, в общей сложности 192 изображения будут приниматься (96 для каждого Флюорофор). 2 h эксперимент с интервалом 1,5 м принесет 160 изображений. Таким образом длинные и короткие эксперименты каждый подвергнет клетки аналогичные суммы лазерного света. Для краткосрочных экспериментов caspase, активация стимул могут быть добавлены непосредственно в СМИ сразу же до начала покадровой съемки (после шага 4.3.11 вместо на шаге 3). Для этого снять крышку с плиты и осторожно поместите в раствор, содержащий стимул, с помощью пипетки. Будьте осторожны не толкаться пластину и быстро проверить, что клетки являются до сих пор в центре внимания, прежде чем продолжить.
При проведении экспериментов промежуток времени, это также важно убедиться, что непосредственной окружающей среде клеток близко напоминает инкубатор культуры ткани. Ряд экологических элементов управления доступны на множестве различных Микроскоп ИБП. К ним относятся меньше стадии Топ инкубаторов, а также экологические камеры, которые инкапсулируют весь Микроскоп. Оба эти устройства обычно доставить тепла, CO2и влажности воздуха в камеру таким образом, который может точно управляться. Точный контроль температуры и CO2 существенно важное значение для успешного проведения эксперимента, потому что неожиданные температурные колебания могут привести к фокуса дрейфа и отсутствие CO2 вызывает pH СМИ подняться, что могут быть токсичны для клеток. Если не доступен источник CO2 , средства массовой информации можно буферизовать путем добавления Hepes (см. шаг 3.1.1). Даже если доступен источник2 CO, рекомендуется включить Hepes в средство визуализации в качестве дополнительной меры чтобы сохранить здоровые клетки. Однако даже в присутствии Hepes, отсутствие CO2 для длительных периодов времени может привести к смерти клетки. Таким образом важно проверить необработанных клетки, отображаемого в тех же условиях, и цвет СМИ в конце эксперимента, чтобы обеспечить, что pH остается стабильным. Обратите внимание, что красный фенола не нужно опустить в любом из средств массовой информации, используемые в настоящем Протоколе, поскольку вклад аутофлюоресценция сигнал Венера является минимальным.
Существует ряд доступных методов для анализа изображений данные, получаемые от эксперимента промежуток времени. Измерения средней интенсивности пикселей Венеры на transfected клеток является наиболее простым способом для анализа сроков caspase индуцированной близости. Как показано на рисунке 3, Рисунок 4, на рисунке 5, БМФЦ caspase-2 часто появляется как один или более puncta, расположенных в различных внутриклеточных отсеках. Imaging анализ подходов, что мера количества очагов, размер объекта или дополнительные аналогичные факторы могут принести информативные количественные данные об этих структур. Не все caspase БМФЦ появляется как puncta. К примеру воспалительные caspases показали различные БМФЦ патронирования, включая диффузных флуоресценции, нитевидные структуры и одного или нескольких puncta в ячейке 18. Эти модели были зависимы от caspase, а также вышестоящего активация сигналов. Таким образом тип анализа, который наиболее подходит для покадровой результаты во многом будут определяться типа люминесцентные патронирования, что наблюдается.
Многие из обращения раздражители, которые оцениваются при использовании этот протокол будет индуцировать апоптоз непосредственно через caspase проанализированы или косвенно путем привлечения различных клеток смерть путь. Это заставляет клетки сокращаться и отсоединить от пластины, что делает его очень трудно изображение клетки и практически невозможно определить любые конкретные локализации caspase БМФЦ. Включение АБС битор caspase Пан будет препятствовать этой смерти клетки. Набор caspases их активации платформ и связанные caspase БМФЦ зависит не на каталитическую активность каспазы. Таким образом ингибирование caspase будет иметь никакого эффекта на этот шаг, но будет препятствовать вниз по течению физические характеристики apoptosis, включая блеббинг, отряд и возможной потери целостности плазматической мембраны. Таким образом если проведение анализа конечной точки (шаг 4.1) или Z стеки (шаг 4.2), включение АБС битор caspase имеет важное значение. Для покадровой экспериментов и наоборот, если события, связанные с apoptosis, например MOMP, annexin V привязки (для выявления воздействия Серина фосфатидилхолин) или пропидий йодидом поглощения (для выявления плазматической мембраны permeabilization) должны быть проанализированы вместе с caspase БМФЦ, чтобы предотвратить ингибирование этих событий должен быть опущен АБС битор caspase. Ингибитор caspase, например qVD-OPh (10-20 мкм) следует внести в средствах массовой информации, который содержит индуцировать апоптоз стимул (шаг 3.1.1). Если совместно выражения про apoptotic белка с компонентами БМФЦ caspase, АБС битор caspase следует добавить на шаге 2.1.12.
В то время как caspase БМФЦ является одним из немногих доступных методов, которые могут использоваться для визуализации событий в пути активацию caspase в живых клетках, при проектировании этих экспериментов необходимо учитывать целый ряд соображений. Поскольку этот подход основан на гиперэкспрессия, элементы управления для специфики имеют важное значение. Это может быть достигнуто одним из двух способов. Во-первых введение точечные мутации в карты или дед caspase prodomain, таким образом, что они нарушают связывание caspase и его активации платформы следует уменьшить интенсивность caspase БМФЦ и процент Венеры положительных клетки. Например мутации остатков D59 E в prodomain caspase-1 нарушает привязки адаптера белка ASC (апоптоз связанные спек как белок содержит карты) и столь же разрушает ASC-индуцированной caspase-1 БМФЦ 18,24 . Во-вторых использование клеток, которые являются несовершенными в адаптер белки, которые набирать caspase активации платформы будет уменьшаться конкретные БМФЦ сигналы. Это может быть достигнуто с помощью нокаут клетки, если таковые имеются, или малых интерферирующих РНК, или на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подходы к разрушающим клетки адаптер. Соответственно истощение caspase-2 адаптер белка RAIDD полностью заблокирован caspase-2 БМФЦ индуцированных теплового шока или ДНК повреждения 14,17. Для этих экспериментов нокаут или нокдаун клетки должны быть сопоставлены с соответствием контроля клетки (то есть помет согласованной дикого типа MEF или управления нокдаун) и, если используется новая линия клеток, условий оптимального трансфекции должны оцениваться для обеспечения равного выражение БМФЦ репортер по всей линии клеток.
Второе ограничение этого подхода является, что, при использовании переходных трансфекции, трудно обеспечить, что каждая ячейка выражением равное количество каждого белка. Если выражение является неравным, один фрагмент Венера могут быть набраны на платформу на высоких частотах. Это может маскировать полный флуоресцентного сигнала и привести к ложные отрицательные результаты. Для преодоления этой проблемы, Новая версия caspase БМФЦ репортер для стабильной клеток линии поколения был недавно сообщил 17. Эта новая версия состояла из конструкции, который выразил C2 Pro-БМФЦ компонентов на одном открытом чтения раме, разделенных вирусный 2A самостоятельно расщепления пептидов 25. Таким образом компоненты БМФЦ транскрибируется как одно mRNA от же промоутер но перевод производить стехиометрически равное количество белков фьюжн VC и VN. Клеточных линий, созданных стабильно выразить этой конструкции продемонстрировали аналогичные тенденции активации временно выразил журналистам, но были более чувствительны и отображаемых ниже фон флуоресценции. Таким образом вышеупомянутый Протокол может быть значительно упрощена, если используется в сочетании с репортером клеточных линий, которые стабильно Экспресс caspase БМФЦ компонентов.
На сегодняшний день данным минимальное вмешательство между компонентами БМФЦ caspase и эндогенных белков. К примеру, caspase-2, как известно, быть активированный вверх по течению от MOMP но caspase-2 БМФЦ не блокировать прогрессирование MOMP 14. Таким образом эти репортеры не появляются действовать в доминирующей негативные моды. Однако если одновременно оценки течению события, это должны быть расследованы в каждом наборе экспериментов. Включая контроль transfected в эксперименте это лучший способ. Если кинетика смерти клетки остаются неизменными с или без выражения caspase датчика, это будет указано, что компоненты caspase БМФЦ не мешая эндогенной функции. И наоборот эндогенного caspase может воздействовать БМФЦ индикация, эффективности или в размер или форму структур. Выражая репортер в клетках недостаточно для caspase будет контролировать для этого.
Несмотря на эти ограничения caspase БМФЦ техника является полезным методом допросить caspase активации пути, которые могут дополнять и даже улучшить существующие подходы к оценке активацию caspase инициатора. Измерений индуцированных близость, первый шаг в активации, эта техника позволяет преодолеть проблемы, связанные с измерением последующих шагов, например связанные с активацией каспазы автообработки. Например при использовании западную помарку для мониторинга расщепления caspases палача, каспазы-3 и caspase-7, обеспечивает точное измерение активации 2, используя тот же подход для инициатора, который может быть ошибочным caspases. Это потому что расщепления caspases инициатора, не является достаточным для активации 4,,2627. В самом деле многие инициатор caspases являются расщепляется в апоптоз каспазы-3 без производства активных ферментов 28. Аналогичным образом методы, основанные на использовании пептидных субстратов, как целевые показатели для конкретных caspases необходимо учитывать перекрывающиеся особенности этих последовательностей для caspases 29. Это не означает, что такие подходы не могут использоваться для измерения активацию caspase, но следует признать недостатки, при интерпретации результатов. Caspase БМФЦ обеспечивает альтернативный подход, который может помочь подтвердить результаты, с использованием обычных методов. Кроме того способность отслеживать Ассамблея комплексов активацию caspase в режиме реального времени и отчетливо определить размер, форму и локализации комплексов является значительное преимущество этой техники, что не представляется возможным оценить другими средствами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить всех предыдущих членов лаборатории Бушье-Хэйес, которые способствовали развитию этой техники. Эта работа частично финансируется Техас Детская больница педиатрической пилот награду LBH. Мы благодарим Joya Чандра (MD Андерсон, Хьюстон, Техас) за разрешение включить данные, опубликованные в сотрудничестве со своей командой. Разработка реагентов описал была поддержана цитометрии и сортировка сердечник клетки в колледж Бейлор с финансирования из низ (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 и NCRR S10RR024574) и помощи Джоэл м. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
