Summary
Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.
Abstract
La familia de caspasas de proteasas juega un papel esencial en la inmunidad innata y la apoptosis. Entre ellos, un subgrupo conocido como iniciadores de caspasas son los primeros en activarse en estas vías. Este grupo incluye a caspasa-2, -8, -9, como la inflamatoria caspasas caspasa-1, -4 y -5. Todos los iniciadores de caspasas son activadas por dimerización después de reclutamiento a complejos de multiproteínas específicos llamados plataformas de activación. Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un enfoque basado en la proyección de imagen de donde se dividen proteínas fluorescentes fusionadas al iniciador de caspasas se utilizan para visualizar el reclutamiento de las caspasas de iniciador a sus plataformas de activación y la resultante proximidad inducida. Esta fluorescencia proporciona una lectura de uno de los primeros pasos necesarios para la activación de caspase del iniciador. Utilizando un número de diferentes enfoques basados en la microscopía, esta técnica puede proporcionar datos cuantitativos sobre la eficacia de la activación de caspasas en un nivel de población, así como la cinética de la activación de caspasas y el tamaño y número de activación de la caspasa complejos de forma por la célula.
Introduction
La familia de proteasas caspasas es conocida por su crítico papel en apoptosis e inmunidad innata 1. Debido a su importancia, determinar cuándo, dónde y sobre la eficacia específicas caspasas son activadas puede proporcionar información crucial sobre los mecanismos de la caspasa vías de activación. El protocolo basado en proyección de imagen se describe aquí permite la visualización de los pasos más tempranos en la cascada de activación de la caspasa. Esta técnica aprovecha las interacciones proteína: proteína dinámica activación de la caspasa en coche.
Las caspasas pueden dividirse en dos grupos: los iniciadores de caspasas (caspasa-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 y -12) y el verdugo caspasas (caspasa-3, -6 y -7). El verdugo caspasas están presentes en la célula como dímeros preformadas y son activadas por clivaje entre las subunidades grandes y pequeñas 2. Cuando se activa, hienden numerosas proteínas estructurales y reguladoras, dando como resultado apoptosis 3. Los iniciadores de caspasas son las caspasas primera a activarse en un camino y generalmente desencadenan la activación de las caspasas de verdugo. En contraste con verdugo caspasas, iniciadores de caspasas son activadas por dimerización 4,5. Esta dimerización facilita el reclutamiento de monómeros inactivos a complejos de peso molecular grande específico conocidos como plataformas de activación. Montaje de plataformas de activación se rige por una serie de interacciones proteína: proteína específica. Estas son mediadas por motivos de interacción proteína conservada presentes en proform de lo caspase del iniciador e incluyen el dominio de la muerte (DD), dominio efector de muerte (DED) y caspasas reclutamiento dominio (CARD) 6 (figura 1A). Plataformas de activación generalmente incluyen una proteína receptora y una proteína del adaptador. El receptor se activa generalmente en Unión de un ligando, induce un cambio conformacional que permite la Oligomerización de numerosas moléculas. El receptor entonces recluta o la caspasas directamente o moléculas del adaptador que a su vez la caspasa al complejo. Así, numerosas moléculas caspasa entran en proximidad, que permite la dimerización. Esto se conoce como el modelo de proximidad inducida por 7. Una vez dimerized, la caspasa experimenta autoprocessing, que sirve para estabilizar la enzima activa 4,8. Por ejemplo, el montaje del apoptosome Apaf1 es accionada por citocromo c tras su liberación de la mitocondria en un proceso llamado permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP). Apaf1 alternadamente recluta a caspasa-9 a través de una interacción que es mediada por una tarjeta presente en dos de las proteínas 9. Similar resultado de interacciones de proteínas en la Asamblea del CD95 muerte induce señalización complejo (disco) que conduce a la activación de la caspasa-8; el PIDDosome, que puede activar la caspasa-2; y varios complejos de inflammasome que inician la activación de la caspasa-1 10,11,12. Por lo tanto, iniciadores de caspasas son reclutados a plataformas de activación específico por un mecanismo común en proximidad inducida y dimerización, sin la cual no se producirá la activación.
Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un ensayo basado en la proyección de imagen que se desarrolló para medir este primer paso en la activación de las caspasas de iniciador, que permite la visualización directa de la proximidad de caspasas inducida tras la plataforma de activación Asamblea. Este método aprovecha las propiedades de la proteína fluorescente split Venus. Venus es un más brillante y más Fotoestables versión de proteína fluorescente amarilla (YFP) que puede dividirse en dos fragmentos no fluorescente y ligeramente superpuestos: el N-terminal de Venus (Venus N o VN) y el C-terminal de Venus (Venus C o VC). Estos fragmentos conservan la capacidad de replegar y fluorescente en cerca de 13. Cada fragmento de Venus está fusionada a la prodomain de las caspasas, que son la mínima porción de la caspasa que se une a la plataforma de activación. Esto asegura que las caspasas no retienen actividad enzimática y por tanto es posible el análisis simultáneo de posteriores eventos asociados con eventos endógenos. Venus los fragmentos doblados cuando las prodomains caspasas son reclutados a la plataforma de activación y experimentar la proximidad inducida. (Figura 1B). La fluorescencia resultante de Venus puede utilizarse con precisión y específicamente monitorear la localización subcelular, la cinética y la eficacia del conjunto de plataformas de activación de caspasas de iniciador en las células. Datos de la proyección de imagen puede ser adquirido por microscopía confocal o por microscopía de fluorescencia estándar y puede ser adaptado a una serie de microscopía diferentes incluyendo: Time-lapse de imágenes para el seguimiento de la activación de caspasas en tiempo real; proyección de imagen de alta resolución para la determinación precisa de la localización subcelular; y cuantificación de la punto final de eficacia de la activación.
Esta técnica se desarrolló inicialmente para investigar la activación de la caspasa-214. Mientras que la plataforma de activación de la caspasa-2 se cree que el PIDDosome, compuesto por el receptor PIDD (inducida por p53 proteína con un dominio de la muerte) y el adaptador RAIDD (RIP-asociado de ICH-1/CAD-3 proteína homóloga con un dominio de la muerte), Se ha reportado activación de caspasa-2 PIDDosome-independiente. Esto sugiere que las plataformas de activación adicional para la caspasa-2 existen 15,16. A pesar de no saber los componentes completos de la plataforma de activación de la caspasa-2, caspasa centro técnica ha permitido eficazmente los interrogatorios de las vías de señalización de caspasa-2 en el nivel molecular 14,17. También hemos adaptado este protocolo para las caspasas inflamatoria (caspasa-1, -4, -5 y -12) 18 y, en principio, el mismo enfoque debería ser suficiente analizar del mismo modo cada uno de los restantes caspasas iniciador. Este protocolo de manera similar podría ser adaptado investigar otras vías era dimerización es una importante señal activadora. Por ejemplo, las proteínas STAT se activan por dimerización por fosforilación de Janus quinasa (JAK) 19. Así, el sistema de centro podría utilizarse para visualizar tendencia activación así como muchas otras vías regulados por las interacciones de la dinámica de la proteína. El siguiente protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la introducción de los reporteros en las células, así como metodologías para el análisis y la adquisición de la imagen.
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Protocol
1. preparación de células y platos de la cultura
Nota: Realice los pasos 1-3 en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Guantes.
- Si usando platos de fondo de vidrio, capa del vidrio con fibronectina. Si utiliza platos de plástico, vaya al paso 1.2.
- Hacer una solución de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL de solución de fibronectina de 1 mg/mL en 9 mL de 1 X PBS.
- Cubrir el fondo del vidrio de cada pozo con 0.5-1 mL de fibronectina e incubar durante 1-5 min a temperatura ambiente.
- Usando una pipeta, recoger la solución de fibronectina y almacenar a 4 ° C.
Nota: La solución de fibronectina puede reutilizarse varias veces. - Lavar el vaso una vez con 1-2 mL 1 X PBS y aspirar de PBS.
- Placa de 1 x 105 células por pocillo de una placa de 6 pozos en 2 mL de los medios de cultivo celular adecuado (ver tabla 1 para los números de celulares para diferentes pozos de tamaño). Si utiliza una línea celular que expresa estable los componentes de centro de caspasa (ver discusión), placa de 2 x 105 células y proceder al tratamiento paso (paso 3).
- Permitir que las células se adhieran a la placa durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.
2. transfección de las células para introducir los componentes de centro de caspasa
- Transfectar las células con el reactivo de transfección adecuada.
Nota: Este protocolo esboza las instrucciones para Lipofectamine 2000, que ha sido optimizada para toxicidad mínima. Este protocolo se ha utilizado con éxito en células Hela, células MCF7 y LN18 células. Si usa más reactivos de transfección siguen las instrucciones del fabricante y optimización según sea necesario.- Añadir 12 μl del reactivo de transfección a 750 μl de medios reducidos del suero en un tubo estéril.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Añadir 10 ng de un plásmido reportero (un plasmid codificando una proteína fluorescente, e.g. rojo proteína fluorescente [convocatoria], que se etiqueta las células transfected) a un tubo de 1,5 mL estériles para cada pozo a ser transfectadas.
- Añadir 20 ng de cada plásmido centro de caspasas (por ejemplo, 20 ng de caspasa-2 prodomain [C2 Pro]-VC y 20 ng de C2 Pro-VN) a cada tubo (tabla 2).
- Traer cada tubo hasta un volumen total de 100 μl mediante la adición de suero reduce los medios de comunicación.
- Utilizando una pipeta de p200, añadir 100 μl de solución de reactivo de transfección de paso 2.1.2 a la mezcla de plásmido en forma gota a gota.
- Incubar la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos por 20 min a temperatura ambiente.
- Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta p1000, pipetear 800 μl de medios libres de suero suavemente hacia abajo al lado del pozo.
- Utilizando una pipeta de p200, añadir 200 μL del ADN-lípido complejo gota a gota a cada pocillo.
- Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 3 horas.
- Teniendo cuidado de no interrumpir la monocapa, retire los medios libres de suero que contiene los complejos DNA-lipídica por aspiración mediante succión o con una pipeta.
- Pipetear 2 mL de medio de crecimiento completo precalentado (37 ° C) suavemente por el lado de cada pozo.
- Incube las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos para 24-48 h para la expresión de la proteína óptimo.
3. inducción de la activación de caspasas
- Tratar con un fármaco o estímulo que induce la caspasa activación aproximadamente 24 h después de la transfección.
- Añadir la concentración deseada del fármaco a la caliente (37 ° C) proyección de imagen medios (crecimiento completo suplementado con Hepes [20 mM, pH 7.2-7.5] y 2-Mercaptoetanol [55 μm]) y mezclar suavemente (tabla 3).
- Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta, pipeta 2 mL de la solución 3.1.1 suavemente hacia abajo al lado del pozo.
- Añadir imágenes medios de comunicación sin la droga a un pocillo como control sin tratamiento.
- Incubar las células en una incubadora a 37 ° C de cultivo de tejidos o proceder a paso 4.3 para un experimento de Time-lapse.
4. Adquisición de datos de Caspase BiFC
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Caspase BiFC para adquisición de punto de vez
- Encienda el microscopio y fuente de luz fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Encontrar las células bajo el filtro de la RFP y enfoque en la fluorescencia del gen reportero.
- Utilizando un contador de mano cuenta, contar todas las celdas de RFP-positivo en el campo visual. Anotar el número.
- Manteniendo el mismo campo visual, cambiar el filtro GFP (o filtro YFP si está disponible) y, usando un contador de mano cuenta, contar el número de eritrocitos que también son verdes (Venus-positivo). Alternar entre los dos filtros para asegurar que sólo los eritrocitos son evaluados para Venus-positividad. Anotar el número (figura 3).
- Contar por lo menos 100 células de RFP-positivas de cada una de tres áreas individuales de la placa.
- En cada área, calculando el porcentaje de células transfectada Venus-positivo (es decir, las células rojas que también son de color verdes). Promedio de los porcentajes resultantes para obtener la desviación estándar.
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Proyección de imagen tridimensional de la caspasa centro
- Encienda el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante y ejecutar el programa de adquisición.
- Seleccione la x 60 o 63 x aceite objetivo y coloque una gota de aceite en el objetivo
- Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.
- Con una fuente de luz de epifluorescencia y el ocular del microscopio o el láser confocal y la pantalla del ordenador, vaya a un campo de interés.
- Se centran en la fluorescencia del reportero con el láser RFP o filtro.
- Si epifluorescencia se ha utilizado hasta este punto, cambiar la fuente de luz para el láser confocal y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador.
- Usando el control de joystick y la rueda de enfoque, afinar el enfoque y la posición de las células para que las células están en el centro del visor. Seleccione las celdas que están separadas unos de otros y no se solapan.
- Entrada de la energía del laser porcentaje al 50% y el tiempo de exposición a 100 ms para Venus y RFP como punto de partida para determinar la configuración óptima para el experimento.
- Encienda la captura vivo e inspeccione la imagen resultante y los histogramas de pantalla acompañamiento para ambos canales.
- Si la señal es baja y la imagen es difícil de hacer, aumentar el tiempo porcentaje láser potencia y/o exposición en incrementos de hasta que la señal en la imagen se ve bien.
- Asegúrese de que la señal no alcanza la saturación. Inspeccione el histograma de la pantalla para asegurarse de que un pico distinto es visible para cada fluor. Si el pico abarca la pantalla histograma completo, entrada de ajustes más bajos láser potencia y exposición (figura 2).
- Visualizar las células control (no tratados o no transfectadas) bajo las mismas condiciones para que la señal sea específica.
Nota: Solo color transfectants puede utilizarse también para control de crossover, pero si las señales son espacialmente distintas (por ejemplo, mitocondrial y citosólica) esto no es necesario. - Seleccione o abra el módulo de pila de Z en el software del microscopio.
- Usando la perilla de enfoque, aproximado de la posición focal correspondiente al centro de la célula.
- Ajuste el foco en una dirección hasta que la celda no está visible, seleccione esta como la posición superior.
- Ajuste el enfoque en la dirección opuesta hasta que la célula otra vez ya no sea visible y seleccione esta como la posición inferior.
- Elegir el tamaño de paso óptimo (generalmente aproximadamente 20 μm) y empezar la adquisición para indicar a la cámara para tomar automáticamente una sola imagen en cada canal en cada uno de los 20 pasos μm entre las posiciones superior e inferior.
- Utilizar software de Render 3D para reconstruir la imagen 3D (figura 4película 1).
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Imágenes de Time-lapse de la caspasa centro
- Al menos 1 h antes del experimento, encienda el microscopio y ajustar la temperatura a 37 ° C.
- Seleccione el 40 x, 60 x u objetivo de aceite x 63 y coloque una gota de aceite sobre el objetivo.
- Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.
- Si una fuente de CO2 está disponible, coloque el dispositivo de entrega de CO2 (generalmente una tapa de plexiglás al tubo que entrega el CO2) en la parte superior del sostenedor de la placa. Fijar el CO2 nivel 5% y encienda el CO2 controlador dentro del software. Si no hay una fuente de CO2 , son 20 mM Hepes para proteger los medios de comunicación.
- Desplácese a un campo de células transfected y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador usando el laser de la RFP.
- Siguiendo pasos 4.2.8-4.2.12, entrada de la configuración de tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para el láser RFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaces de detectar la señal fluorescente.
- Utilizando un control positivo de la muestra (ver tabla 3 para los ejemplos), siga 4.2.8-4.2.12 pasos para la configuración de entrada para tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para la luz de láser YFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaz de detectar la señal de Venus.
- Para cada pocillo de la placa, elija un número de diversas posiciones que contengan una o más células expresando el reportero.
- Entrada del intervalo de tiempo entre cada fotograma del time-lapse y total número de marcos a tomarse. Asegúrese de que hay tiempo para adquirir todas las posiciones seleccionadas antes de tomarse el siguiente fotograma.
- Volver a visitar cada posición y corregir y actualizar el enfoque según sea necesario.
- Para corregir para la deriva focal que puede resultar de cambios de temperatura o las vibraciones externas, encienda el sistema de la corrección de la deriva del foco (si está disponible).
- Comienza el lapso de tiempo y guardar los datos.
- Analizar los datos utilizando el software de imágenes disponible (figura 5película 2).
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Representative Results
En la figura 3se muestra un ejemplo de centro de caspasa-2 inducida por daño en el ADN. Camptotecina, una topoisomerasa I inhibidor, fue utilizado para inducir daño y caspasa-2 activación de ADN. La proteína fluorescente roja mCherry fue utilizado como reportero para demostrar que las células expresan la sonda del centro y para ayudar a visualizar el número total de células. Fluorescencia de Venus se muestra en verde y el orificio grande representan caspasa-2 inducida por proximidad. Estas células pueden ser contadas determinar el porcentaje de células positivas de Venus. También pueden hacer conclusiones acerca de la localización subcelular de tales imágenes. En el ejemplo mostrado, proximidad inducida caspase-2 fue detectada en el nucleolo, así como en la 17de la citoplasma. Para proveer visualización de alta resolución de la localización subcelular de la activación de la caspasa compleja, las células pueden ser reflejadas en tres dimensiones. La figura 4 muestra dos formas de representar estas imágenes en 3D. La primera es generar una reconstrucción 3D de la célula. El ejemplo muestra camptothecin-inducida caspase-2 centro en verde y núcleo rojo. La reconstrucción 3D muestra la localización relativa de ambos fluoróforos a través de las células. Este tipo de visualización de resultados es especialmente eficaz cuando se presenta como una película, girar las células alrededor de un solo eje (película 1). El segundo panel es la vista ortogonal de la misma célula. Esto proporciona la visualización xy, xzy yz de la célula en un determinado punto de la célula. Representación de los resultados de esta manera puede ser más adecuado para una presentación en papel como en un artículo de diario ya que es más fácil interpretar los datos 3D presentados en un formato 2D. La figura 5 muestra un ejemplo de proyección de imagen de Time-lapse de la caspasa-2 centro en una línea de células de glioblastoma tratada con el inhibidor el proteasoma bortezomib (véase también película 2). El gráfico muestra el aumento en la intensidad media de Venus por la célula promediada a través de un número de células (adaptado de 20). Este tipo de datos también se puede visualizar como una serie de rastros de la célula en un gráfico. En el ejemplo mostrado, la aparición de caspasas inducida por proximidad está sobre 2 h después del tratamiento.
Figura 1: esquema de caspasa estructura y metodología de complementariedad (centro) bimolecular de la fluorescencia. (A) estructura General de un caspase del iniciador. Las subunidades prodomain, grandes y pequeñas y el motivo conservado de QACRG que contiene la cisteína del sitio activo son representados. (B) centro utiliza proteínas fluorescentes split solo no fluorescentes pero que pueden asociar a reformar la molécula fluorescente cuando fusionados a proteínas de interacción. Para caspasa centro, el prodomain (Pro) o larga duración caspasa está fusionada a la N-terminal medio (Venus-N) y el C-terminal mitad (Venus-C) de Venus. En estado monomérico las proteínas de fusión de caspasas no son fluorescentes. Sobre reclutamiento a una plataforma de activación, como el PIDDosome, como se muestra aquí, Asociación de las dos mitades de Venus se aplica que representa la proximidad de caspasas inducida que es medido como un incremento en fluorescencia de Venus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen representativa para el reconocimiento de saturación mediante el histograma pantalla. Se muestran ejemplos de óptima (panel superior) y saturados (panel inferior). Se muestran las señales de la RFP (pico rojo) y Venus (pico amarillo). El eje x indica la intensidad y el eje y es el número de píxeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: complementación bimolecular de la fluorescencia de caspasa-2 (centro) después de daño de la DNA. Hela células expresan los componentes de centro de caspasa-2 se deja sin tratar (A) o tratadas con camptotecina (100 μm) (B) en presencia de qVD-OPH (20 μm). mCherry fue co expresado como un reportero fluorescente. Imágenes representativas muestran células (rojo) con caspasa-2 centro (verde) en células tratadas con camptotecina 16 h después del tratamiento. Barras de escala representan 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: localización de complementación bimolecular de la fluorescencia caspasa-2 (centro). Hela células expresan los componentes de centro de caspasa-2 y un reportero fluorescente nuclear fueron tratadas con camptotecina (20 μm) en presencia de qVD-OPH (20 μm). Reconstrucciones 3D componen de imágenes confocales serial de 0,1 μm a través de la z-avión de la célula fueron hechas después de 24 h y muestran el núcleo rojo y caspasa-2 centro en verde. El panel izquierdo muestra una reconstrucción de representación de proyección 3D de máxima intensidad (véase también película 1). El panel de la derecha muestra la vista ortogonal rodajas de la misma célula. El cuadro central (azul) es el plano xy , la caja derecha (amarillo) es el plano yz y cuadro superior (Blanco) es el plano xz . Los planos yz y xz se cruzan según el retículo. Barras de escala representan 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Time-lapse de complementación bimolecular de la fluorescencia de caspasa (centro) (A) las células de glioblastoma LN18 transfected con los componentes de centro de caspasa-2 y un marcador mitocondrial fluorescente rojo (DsRed mito, rojo) fueron tratados con bortezomib (15 nM) en presencia de qVD-OPH (20 μm). Las células se colocaron en un microscopio confocal a 37 ° C y de imágenes fueron tomadas cada 2 min para 8 h. imágenes de células representativas del show Time-lapse que la proximidad inducida de los dos componentes de caspasa-2 centro dio lugar a un aumento en fluorescencia de Venus ( verde) con el tiempo. (B) se midió la intensidad media de Venus en cada célula en cada momento. Fluorescencia de Venus aumenta con el tiempo después del tratamiento de bortezomib. División del control sin tratar indica condiciones de toxicidad baja o insignificante de luz láser (figura adaptada de 20). Escala barras representa 20 μm. barras de Error representan el error estándar de la media (SEM) de 8 (control) y 14 (bortezomib) células individuales (véase también película 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tamaño de la placa | Número de células | Volumen de medios de comunicación |
| placa de la pozo 6 | 1 x 105 células / pozo | 2 mL |
| placa de la pozo 12 | 5 x 104 células / pozo | 1 mL |
| 24 placa bien | 2.5 x 104 células / pozo | 0, 5 mL |
| plato de cámara 4 | 2.5 x 104 células / cámara | 1 mL |
| plato de cámara 8 | 1.25 x 104 células / cámara | 0, 5 mL |
Tabla 1: directrices para los números de placa de las células. Si utiliza células estable expresan los componentes de (centro) de complementación bimolecular de la fluorescencia de caspasa, placa doble las cantidades mostradas aquí.
| Tamaño de la placa | Reactivo de transfección | Suero reducido los medios de comunicación | Plásmido reportero | Plásmido de VC de caspasa-pro | Plásmido VN caspasa-pro | Medios de comunicación reducido suero añadido a la mezcla de plásmido | Solución de reactivo de transfección ha añadido a la mezcla de plásmido | Medios libres de suero añadidos a las células |
| placa de la pozo 6 | 12 μl/placa | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | en total 100 μl | 100 ΜL | 800 ΜL |
| placa de la pozo 12 | 12 μl/placa | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | en total 50 μl | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24 placa bien | 12 μl/placa | 750 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | en total 25 μl | 25 ΜL | 200 ΜL |
| plato de cámara 4 | 4 μl/placa | 250 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | en total 25 μl | 25 ΜL | 200 ΜL |
| plato de cámara 8 | 4 μl/placa | 250 ΜL | 1.25 ng | 2,5 ng | 2,5 ng | a total 12.5 μl | 12.5 ΜL | 100 ΜL |
Tabla 2: recomienda volúmenes de reactivos para transfección transitoria. Nota: la cantidad de plásmido sugirió es sólo un punto de partida. Si no se detecta ninguna señal, se recomienda valorar el plásmido de 20-200 ng por pozo de una placa de 6 pozos.
| Caspasa | Tratamiento | Concentración | Tiempo | Resultados esperados |
| Caspasa-1 | Sobreexpresados ASC | 250 ng/pozo de una placa de la pozo 6 | 48 h | 50% centro positivo |
| Caspasa-2 | RAIDD sobreexpresado | 500 ng/pozo de una placa de la pozo 6 | 24 h | 90% centro positivo |
| Camptotecina | 100 ΜM | 16 h | 30-60% centro positivo | |
| Choque térmico | 1 h a 45 ° C | 16 h | 80% centro positivo | |
| Caspasa-4 | NALP1 sobreexpresada | 250 ng/pozo de una placa de la pozo 6 | 48 h | 30% centro positivo |
| Caspasa-5 | IPAF sobreexpresada | 250 ng/pozo de una placa de la pozo 6 | 48 h | 15% centro positivo |
Tabla 3: ejemplos de controles positivos para complementación bimolecular de la fluorescencia de caspasa (centro). Las condiciones y los resultados esperados se basan en datos publicados usando el Pro construye 14,17,18. Plásmidos Co expresados deben transfected junto con la plásmidos de centro (paso 2.1.4)
Película 1: la localización 3D de complementación bimolecular de la fluorescencia caspasa-2 (centro). Reconstrucción 3D, gira alrededor del y-axis de imágenes confocales a través de la z-plano de un Hela células expresando los componentes de la caspasa-2-centro y un reportero fluorescente nuclear fueron tratados con camptotecina (20 μm) de 16 h. La película muestra caspasa-2 centro (verde) y el núcleo (rojo). Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Película 2: Time-lapse de complementación bimolecular de la fluorescencia caspasa-2 (centro). LN18 glioblastoma células transfected con los componentes de centro de caspasa-2 y tratados con bortezomib (15 nm) fueron imágenes cada 2 min durante 8 h. La película muestra caspasa-2 centro (verde) y la mitocondria (rojo). Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Este protocolo trata el uso de proteínas fluorescentes split para medir caspasas inducida por proximidad. Venus de Split fue elegida para esta técnica porque es muy brillante, altamente Fotoestables y el refolding es rápido 13. Así, el análisis de Venus refolding sobre proximidad de caspasas inducida puede proporcionar cerca de las estimaciones en tiempo real de la dinámica de interacción de la proteína caspasa. Venus se divide en dos fragmentos ligeramente superpuestas, la terminal N de Venus (Venus-N o VN) compuesto por aminoácidos 1-173 y C terminal del fragmento (Venus-C o VC) compuesto por residuos 155-239. Existen otras proteínas fluorescentes de split pero algunos, como split mCherry, requieren incubación a 4 ° C por hasta 2 h para refolding 21. Proteínas fluorescentes split adicional incluyendo fractura Cerulean (una versión de la proteína fluorescente ciánica) y el mLumin de split ahora rojo todavía tienen que ser probados en este contexto 13,22. En definitiva, si estas proteínas fluorescentes resultan adecuadas para la medición de la caspasa inducida por proximidad, esto podría permitir que para la evaluación simultánea de múltiples caspasas.
En general, la región (Pro) prodomain de la caspasa se fusiona a los fragmentos fluorescentes de split. Esta región contiene la porción mínima de la caspasa necesaria para enlazar con la plataforma de activación y comprende el motivo de interacción tarjeta o DED. La ventaja de usar el prodomain es que no introduce ninguna actividad enzimática a las células. Esto permite la monitorización simultánea de eventos aguas abajo debido a la caspasa endógena. Investigación hasta la fecha ha demostrado poca diferencia en la cinética y la localización de la caspasa centro entre el prodomain y la longitud total caspase 14. Sin embargo, las construcciones de larga duración tienden a expresar con menor eficiencia, lo que requeriría la transfección de mayores cantidades de ADN plásmido. Además, se recomienda para mutar la cisteína catalítica a una serina para prevenir la apoptosis inducida por la caspasa en expresión. A pesar de estos inconvenientes, ciertas investigaciones pueden requerir el análisis concurrente de los pares del centro integral para determinar si hay diferencias de contexto-dependiente en proximidad de caspasas inducida en la presencia o ausencia de los dominios catalíticos.
Este protocolo está adaptado para las células HeLa. El mismo protocolo funciona bien para las líneas de células adherentes adicionales incluyendo la línea celular de carcinoma mamario MCF-7, la línea de células de glioblastoma, LN18 y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Se recomienda que el usuario optimiza condiciones placas y transfección cuando la adaptación de este protocolo a un nuevo tipo de célula. El protocolo describe dos enfoques principales de la microscopia que pueden utilizarse para evaluar las células: epifluorescencia y microscopía confocal. Cuando usando la microscopia confocal, células deben ser plateadas en cubreobjetos de vidrio porque la mayoría de los objetivos de alta apertura numérica que se utilizan en combinación con la microscopía confocal no penetrará el grueso de plástico platos o laminas de vidrio. Por lo tanto, se recomienda utilizar platos con cubreobjetos de vidrio incrustado no. 1.5 que el cubreobjetos óptimo espesor de 0,17 mm. Un número de diferentes tipos de estos platos están disponibles que van desde platos individuales de 3 cm, para portaobjetos de la cámara, a placas de varios pocillos tamaño estándar. Las tablas 1 y 2 del esquema cómo adaptar las instrucciones para los diferentes tamaños bien chapado y transfección. Para la epifluorescencia imagen es descrito aquí (4.1), las placas de cultivo de tejido de plástico estándar son suficientes como el microscopio está equipado con los objetivos del pase largo.
Porque este enfoque es un método de "luces" para medir la activación de la caspasa, la inclusión de un reportero fluorescente es esencial para permitir una visualización de las células antes o en la ausencia de la activación de la caspasa reportero e identificar las células transfected, cuando se usa la transfección transitoria. Puede utilizarse un número de diferentes reporteros y es el único criterio al elegir uno: 1) el fluoróforo es suficientemente brillante para que puede ser fácilmente detectada por el protocolo de imagen; y 2) su espectro fluorescente no se superpone con la de YFP. Por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) debe no utilizarse como reportera ya que será detectado por el filtro de YFP o láser que se utiliza para detectar a Venus. Esto es debido a la superposición espectral de las dos fluoróforos. Elegir un fluoróforo que se localiza a un orgánulo específico puede proporcionar información cualitativa adicional. Por ejemplo, uso de una proteína que metas la mitocondria, como la proteína roja fluorescente DsRed mito, pueden proporcionar información adicional sobre la viabilidad global de la célula. Las mitocondrias tienden a experimentar la fragmentación (fisión) en las primeras etapas de la célula muerte 23 y esto puede visualizarse con un reportero como DsRed mito. El uso de un marcador de organelas como reportero de también puede permitir conclusiones acerca de la localización subcelular de la caspasa centro a realizarse.
Hay un número de maneras que caspase centro adquiridos y datos analizados. Decidir qué método debe utilizar será determinado por los parámetros a ser explorada (análisis de la población de endpoint versus información postural o cinético unicelular) y la disponibilidad de instrumentación y software de imágenes. Este protocolo describe unos enfoques basados en el microscopio que recoge los resultados de una caspasa centro de experimento para la adquisición de datos Time-lapse y puntos de tiempo individuales. Sin embargo, cabe señalar que un número de variaciones y combinaciones de estos enfoques para interrogar creativamente vías de activación de la caspasa.
Momento único de adquisición de datos (4.1) se utiliza para determinar el porcentaje de células con caspasas inducida por proximidad en un solo momento. De este protocolo, uno cuenta simplemente el número de células transfected que son positivos de Venus. Por lo tanto, no se requiere equipo altamente especializado y sólo lo más básico microscopio de epifluorescencia con GFP (o YFP) y se necesita filtro RFP y un contador de mano cuenta. Algunos sistemas de proyección de imagen pueden ser automatizados para tomar automáticamente un número determinado de imágenes por pozo de una placa. Si tal instrumentación disponible, las células en las imágenes adquiridas pueden contarse igualmente por inspección visual o cuantificaron utilizando el software de imágenes. Proyección de imagen tridimensional (4.2) proporciona imágenes de alta resolución de la caspasa centro a lo largo de los planos focales de la célula. Un microscopio confocal con láser que excitar a Venus y RFP (o el reportero elegido transfección) capacidades de Z-stack es necesaria. Un número de módulos de software de renderizado 3D están disponibles que proporcionan diferentes formas de visualizar los datos. Ambos estos tipos de análisis, es posible fijar las células y la imagen o evaluar en un momento posterior. Sin embargo, el proceso de fijación disminuye la señal de Venus, que podría agregar artefactos para el análisis y por lo tanto no se recomienda este enfoque. Time-lapse (4.3) la proyección de imagen puede utilizarse para proporcionar análisis cinético y postural simultáneo de la caspasa centro. Un microscopio equipado con una platina motorizada se puede configurar para tomar imágenes de múltiples posiciones e incluso comparar grupos de tratamiento diferentes en el mismo experimento.
Para Time-lapse, una serie de consideraciones adicionales debe tomarse en cuenta. La luz láser puede causar artefactos por fototoxicidad o fotoblanqueo y ambos necesitan ser controlados para. En general, ambos pueden evitarse utilizando la menor cantidad posible de luz (entrada bajo porcentaje láser potencia y corto tiempos de la exposición en pasos 4.3.6-4.3.7). Fototoxicidad se produce cuando la luz láser induce la muerte en las células y se puede controlar para las células no tratadas en las mismas condiciones de imagen y confirmación de que ésa División de célula procede como normal. Fotoblanqueo ocurre cuando múltiples imágenes tomadas de la misma célula disminuye la fluorescencia. La proteína fluorescente de Venus es muy Fotoestables, así que esto es raramente un problema en la práctica. Los efectos de fotoblanqueo pueden determinarse tomando numerosas imágenes secuenciales de una célula de Venus-positivo y garantizar que la fluorescencia se mantiene estable. Esto sólo debe hacerse una vez, siempre y cuando se utilizan los mismos ajustes de exposición y potencia de láser para cada experimento. Efectos debido a la fototoxicidad o fotoblanqueo también pueden ser mitigados reduciendo el número total de imágenes capturadas. Esto puede lograrse alargando o acortando el intervalo entre capturas (paso 4.3.9). Con intervalos de 5-10 min en un lapso de tiempo de 16 h es un buen lugar para empezar. Si no photoxicity se observa o se requieren experimentos de corta duración, puede reducirse el intervalo entre fotogramas. Si la activación de caspasas es rápida, pueden utilizar experimentos más cortos con intervalos de tiempo más cortos. Por ejemplo, para un experimento de 16 h con intervalos de 10 minutos, un total de 192 imágenes tomarán (96 de cada fluoróforo). Un experimento de 2 h con intervalos de 1.5 m producirá 160 imágenes. Por lo tanto, los experimentos cortos y largos uno expondría las células similares cantidades totales de luz láser. Para los experimentos de corta duración la caspasa activa estímulo puede agregarse directamente a los medios de comunicación inmediatamente antes de iniciar la captura de Time-lapse (después paso 4.3.11 en vez de en el paso 3). Para ello, retire la tapa de la placa y suavemente la gota de una solución que contiene el estímulo con una pipeta. Tenga cuidado de no empujar la placa y comprobar rápidamente que las células todavía están en foco antes de proceder.
Al llevar a cabo experimentos de lapso de tiempo, también es fundamental para asegurarse de que el entorno inmediato de las células de cerca se asemeja al de una incubadora de cultivo de tejidos. Una serie de controles ambientales está disponible en microscopio diferentes set ups. Se trata de pequeñas incubadoras superior de la etapa, así como cámaras ambientales que encapsulan el microscopio todo. Ambos de estos dispositivos generalmente aportan calor, CO2y la humedad a la cámara de manera que puede ser precisamente controlada. El control preciso de CO2 y temperatura es esencial para el éxito del experimento porque temperatura inesperada fluctuaciones pueden llevar a la deriva focal y la ausencia de CO2 hace que el pH de los medios de comunicación aumento que pueden ser tóxicos para las células. Si una fuente de CO2 no está disponible, los medios de comunicación se pueden protegido por la adición de Hepes (ver paso 3.1.1). Incluso si una fuente de CO2 está disponible, se recomienda incluir Hepes en el medio de imágenes como una medida adicional para mantener las células sanas. Sin embargo, incluso en presencia de Hepes, la ausencia de CO2 por períodos prolongados de tiempo puede causar la muerte celular. Por lo tanto, es importante inspeccionar las células no tratadas, reflejadas en las mismas condiciones y el color de los medios de comunicación al finalizar el experimento para asegurar que el pH se ha mantenido estable. Observe que eso rojo de fenol no debe omitirse cualquiera de los medios utilizados en el presente Protocolo ya que la contribución de la autofluorescencia de la señal de Venus es mínima.
Hay un número de métodos disponibles para analizar los datos de imágenes resultantes de un experimento de lapso de tiempo. Medición de la intensidad media de los píxeles de Venus por células transfected es la forma más sencilla para analizar el momento de caspasas inducida por proximidad. Como se muestra en la figura 3, figura 4, figura 5, el centro de la caspasa-2 aparece a menudo como uno o más orificio ubicado en diferentes compartimentos subcelulares. Análisis de la proyección de imagen se acerca a que medida número de focos, tamaño del objeto o factores similares adicionales puede producir informativos datos cuantitativos sobre estas estructuras. No todos los caspase centro aparece como puncta. Por ejemplo, las caspasas inflamatorias han demostrado diferentes patrones centro incluyendo fluorescencia difusa, estructuras filamentosas y orificio único o múltiples por celular 18. Estos patrones eran dependientes en la caspasa activada así como las señales de activación upstream. Por lo tanto, el tipo de análisis que es más conveniente para los resultados de Time-lapse se ser dictado en gran parte por el tipo de patrón fluorescente que se observa.
Muchos de los estímulos de tratamiento que se evaluaron cuando se utiliza este protocolo inducen apoptosis directamente a través de la caspasa analizados o indirectamente participando una vía de muerte celular diferente. Esto hace que las células se encogerán y separarlo de la placa, que hace que sea muy difícil para las células de la imagen y casi imposible de determinar cualquier localización específica de la caspasa-centro. Inclusión de un inhibidor de la caspasa pan evitará que esta muerte celular. El reclutamiento de las caspasas a sus plataformas de activación y la caspasa asociado centro no es dependiente de la actividad catalítica de la caspasa. Por lo tanto, inhibición de caspasas no tendrá efecto en este paso, pero inhibirá las características físicas aguas abajo de la apoptosis como blebbing, separación y eventual pérdida en la integridad de la membrana plasmática. Así, si llevar a cabo análisis de punto final (paso 4.1) o pilas de Z (paso 4.2), la inclusión de un inhibidor de caspasas es esencial. Para Time-lapse experimentos en cambio, si los hechos relacionados con la apoptosis como la MOMP, anexina V Unión (detectar exposición de fosfatidil serina) o captación de yoduro de propidio (para detectar la permeabilización de la membrana del plasma) deben ser analizadas junto a caspasa centro, la inhibidor de caspasa debe omitirse para evitar la inhibición de estos eventos. Un inhibidor de caspasas como qVD-OPh (10-20 μm) debe ser agregado en los medios de comunicación que contiene los estímulos inductores de apoptosis (paso 3.1.1). Si Co expresando una proteína pro-apoptótica con los componentes de centro de caspasa, debe agregarse el inhibidor de caspasas en paso 2.1.12.
Mientras que la caspasa centro es uno de los pocos métodos disponibles que pueden utilizarse para visualizar eventos en vías de activación de caspasas en células vivas, una serie de consideraciones debe tenerse en cuenta en el diseño de estos experimentos. Porque este enfoque está basado en la sobreexpresión, controles de especificidad son importantes. Esto se puede lograr de dos maneras. En primer lugar, introducción de mutaciones puntuales en la tarjeta o DED de la caspasa prodomain que interrumpen el enlace entre la caspasa y su plataforma de activación debe disminuir la intensidad de la caspasa centro y el porcentaje de positivos de Venus células. Por ejemplo, mutación del residuo D59 a E en el prodomain de caspasa-1 interrumpe la Unión a la proteína adaptadora de ASC (apoptosis proteína asociada a Mota-como una tarjeta) e igualmente interrumpe ASC-inducida caspase-1 centro 18,24 . En segundo lugar, el uso de las células que son deficientes en las proteínas del adaptador que reclutan caspasas a la plataforma de activación disminuirá señales específicas del centro. Esto puede ser logrado utilizando células de octavos de final, si está disponible, o usando siRNA o CRISPR/Cas9 basado en enfoques para agotar las células del adaptador. Por consiguiente, el agotamiento de la proteína caspasa-2 adaptador RAIDD completamente bloqueado centro caspasa-2 inducida por choque térmico o DNA daños 14,17. Para estos experimentos, el golpe de gracia o células precipitación deberían compararse con control emparejado células (es decir, tipo salvaje litera-emparejado MEF o control de precipitación) y, si se utiliza una nueva línea de celulares, deben evaluarse las condiciones óptimas de la transfección para garantizar igual expresión de la periodista del centro a través de líneas celulares.
Una segunda limitación de este enfoque es que, cuando se usa la transfección transitoria, es difícil asegurar que cada célula expresa cantidades iguales de cada proteína. Si la expresión es desigual, un fragmento de Venus podría ser reclutado a la plataforma en las frecuencias más altas. Podría enmascarar la señal fluorescente completo y conducir a resultados falsos negativos. Para superar este problema, una nueva versión de caspasa centro reporter para la generación de línea celular estable fue recientemente reportado 17. Esta nueva versión consistió en una construcción que expresa los componentes C2 Pro-centro en un marco de lectura abierto solo separado por el viral 2A auto Hendedoras péptido 25. Por lo tanto, los componentes de centro se transcribe como un mRNA único de la promotora de mismo pero traducidos para producir stoichiometrically iguales cantidades de las proteínas de fusión VC y VN. Las líneas celulares generadas para expresar estable esta construcción demostró tendencias similares de activación a los reporteros expresadas transitoriamente pero eran más sensibles y mostrado baja fluorescencia de fondo. Así, el protocolo anterior puede simplificarse enormemente si se utiliza en conjunción con líneas celulares de reportero que estable expresan los componentes de centro de caspasas.
Datos hasta la fecha sugieren la mínima interferencia entre los componentes de centro de caspasas y las proteínas endógenas. Por ejemplo, la caspasa-2 es conocido por ser centro activado aguas arriba de MOMP pero caspasa-2 no bloquear la progresión de MOMP 14. Así, estos periodistas no parecen actuar de una manera negativa dominante. Sin embargo, si al mismo tiempo evaluar eventos posteriores, esto debe ser investigado dentro de cada serie de experimentos. Incluyendo un control no transfectadas en el experimento es la mejor manera de abordar esto. Si la cinética de muerte celular es sin cambios, con o sin expresión de caspasa sensor, esto indicará que los componentes de la caspasa-centro no interfieran con la función endógena. Por el contrario, la caspasa endógeno posiblemente podría afectar la lectura del centro, en eficacia o en el tamaño o la forma de las estructuras. Expresando el reportero de las células deficientes para la caspasa de control para esto.
A pesar de estas limitaciones, la caspasa centro técnica es un método útil para interrogar a vías de activación de caspasas que pueden complementar y mejorar incluso los enfoques existentes para medir la activación de caspase del iniciador. Por medición de proximidad inducida, el primer paso en la activación, esta técnica supera problemas asociados con la medición de pasos posteriores como caspasa auto procesamiento asociado con la activación. Por ejemplo, durante el uso de western blot para supervisar la separación de las caspasas de verdugo, caspasa-3 y caspasa-7, proporciona una medida exacta de activación 2, usando el mismo enfoque para iniciador de caspasas pueden ser errónea. Esto es porque el escote de las caspasas de iniciador, no es suficiente para la activación 4,26,27. De hecho, muchos de iniciadores de caspasas son troceados durante la apoptosis caspasa-3 sin producir enzimas activas 28. Del mismo modo, técnicas basadas en el uso de sustratos de péptido diseñados como objetivos de caspasas específicas necesitan tener en cuenta las especificidades superpuestas de estas secuencias para las caspasas 29. Esto no significa que estos enfoques no se puede utilizar para medir la activación de caspasas, pero deberían reconocerse las desventajas al interpretar los resultados. Caspase BiFC proporciona un método alternativo que puede ayudar a confirmar los resultados mediante métodos más convencionales. Además, la capacidad de rastrear el conjunto de los complejos de activación de la caspasa en tiempo real y determinar claramente el tamaño, forma y localización de los complejos es una importante ventaja de esta técnica que no es posible evaluar por otros medios.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer a todos los miembros anteriores del laboratorio Bouchier-Hayes que contribuyeron al desarrollo de esta técnica. Este trabajo fue financiado en parte por el Premio de piloto pediátrica Hospital infantil Texas a LBH. Agradecemos a Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permiso para incluir los datos publicados en colaboración con su equipo. El desarrollo de los reactivos descritos fue apoyado por la citometría y base de clasificación de la célula en el Baylor College of Medicine con la financiación de los NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 y NCRR S10RR024574) y la asistencia de Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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