Summary

تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

البروتوكولات اثنين مختلفة 3 ‘التضخيم السريع كدنا الغايات (3’ سباق) جعل هنا وصف استخدام اثنين بولمرس الحمض النووي مختلفة لتعيين تسلسل التي تشمل جزءا من الإطار القراءة المفتوحة (ORF) كودون التوقف وأكملها 3 ‘ UTR من نسخة باستخدام الحمض النووي الريبي الحصول على خطوط خلايا السرطان المختلفة.

Abstract

نضوج مرناس التوكسينات ينطوي على إنهاء تشكيل 3 ‘، الذي ينطوي على إضافة ذيل poly(A). من أجل تعيين 3 ‘نهاية الجين، هو الطريقة التقليدية لاختيار 3’ التضخيم السريع كدنا الغايات (3 ‘ سباق). تتطلب بروتوكولات لسباق 3 ‘التصميم الدقيق والتحديد كبسولة تفجير متداخلة ضمن 3’ المنطقة غير مترجمة (3 ‘ UTR) من الجينات المستهدفة للفائدة. ومع ذلك، مع بعض التعديلات يمكن استخدام البروتوكول لتشمل كامل 3 ‘UTR وتسلسل داخل الإطار القراءة المفتوحة (ORF)، تقديم صورة أكثر شمولاً عن العلاقة بين ORF و 3’ UTR. هذا بالإضافة إلى تحديد إشارة بوليادينيليشن (PAS)، فضلا عن موقع الانقسام وبوليادينيليشن تقدمها التقليدية 3 ‘ العرق. توسيع 3 ‘العرق يمكن الكشف عن غير عادية 3’ تحيلها، بما في ذلك اندماج الجينات داخل 3 ‘ UTR، وتسلسل المعلومات التي يمكن استخدامها للتنبؤ المحتملة ميرنا ربط المواقع، فضلا عن الاتحاد الأفريقي الغنية زعزعة العناصر التي قد تؤثر على استقرار محضر.

Introduction

تشكيل نهاية 3 ‘ هو خطوة حاسمة في نضوج مرناً التي تتألف الانقسام ومن المصب مرناً قبل نظام تقييم الأداء متبوعاً بالإضافة ~ 250 أونتيمبلاتيد أدينينيس، التي تشكل poly(A) الذيل1،2. البروتين ملزمة poly(A) (بابب) بربط ذيل poly(A)، وهذا يحمي نسخة مرناً من التدهور، ويسهل الترجمة1.

وتشير التقديرات الحالية إلى أن 70% جينات البشرية المرور متعددة، وهكذا يخضع بوليادينيليشن البديلة، أسفر عن عدة 3 ‘ ينتهي3. وبالتالي، من المهم أن تحدد فيها الذيل poly(A) تعلق على بقية 3 ‘ UTR، فضلا عن تحديد نظام تقييم الأداء المستخدمة من قبل أي نص معين. وادي ظهور الجيل التالي التسلسل في تحديد وقت واحد 3 ‘ تحيلها وتمرير الآلاف من الجينات. هذه الزيادة في القدرة على تسلسل يتطلب تطوير خوارزميات بيوينفورماتيك لتحليل البيانات التي تنطوي على بوليادينيليشن البديلة للنهاية 3 ‘. لكشف حيثياته أو التحقق من صحة نظام تقييم الأداء ومن ثم تعيين النهاية 3 ‘للجينات الفردية من البيانات تسلسل واسعة النطاق، 3’ العرق يظل أسلوب اختيار4،5. وتشمل تسلسل المدرجة في منتجات كدنا 3 ‘سباق عادة جزء فقط من 3’ UTR يحتوي على الذيل poly(A) وموقع الانقسام، ونظام تقييم الأداء، وفي تسلسل المنبع لنظام تقييم الأداء. خلافا لبكر، الأمر الذي يتطلب تصميم واستخدام الجينات محددة إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير، 3 ‘ سباق فقط يتطلب اثنين الجينات محددة المتداخلة إلى الأمام الإشعال. ومن ثم، بكر يتطلب معرفة أكثر تفصيلاً من تسلسل النوكليوتيدات من منطقة كبيرة من الجينات يجري تضخيم4،6. منذ 3 ‘ سباق يستخدم نفس عكس التمهيدي أن أهداف الذيل poly(A) لجميع بوليادينيلاتيد الحمض النووي الريبي النصوص، إلا الإشعال إلى الأمام يجب أن تكون الجينات محددة، وبالتالي، فقط التي تتطلب معرفة بمنطقة أصغر بكثير من مرناً. وهذا يتيح تضخيم المناطق التي تسلسل لا تتسم تماما4،7. وقد سمح 3 ‘سباق لاستخدامها ليس فقط لتحديد نهاية 3’ الجينات، ولكن أيضا تحديد وتوصيف مناطق شاسعة في المنبع لنظام تقييم الأداء التي تشكل جزءا كبيرا من 3 ‘ UTR. عن طريق الجمع بين 5 ‘سباق مع معدلة 3’ سباق يتضمن أجزاء أكبر من 3 ‘UTR ومناطق الحماية، من الممكن تماما تسلسل أو استنساخ أكمله نسخة مرناً من النهاية 5’ إلى النهاية 3 ‘8.

مثال على هذا التطبيق من تعديل 3 ‘العرق هو تحديد الأخيرة من رواية CCND1-مرك الانصهار الجينات نسخة من خطوط الخلايا”اللمفاوية خلية عباءة” ومرضى السرطان. 3 ‘ UTR تتألف من تسلسل من جينات كلا من CCND1 و مرك والمعاندة لميرنا البند9. اثنين متداخلة CCND1 محددة إلى الأمام الإشعال تعتبر مكملة للمنطقة المتاخمة والمتلقين للمعلومات من كودون وقف CCND1 فورا. على الرغم من أن يمكن استخدام تسلسل الترنسكربيتوم كله جنبا إلى جنب مع أدوات بيوينفورماتيك محددة للكشف عن اندماج الجينات داخل UTR 3 ‘10، العديد من مختبرات قد تفتقر إلى الموارد المالية أو الخبرة بيوينفورماتيك لجعل استخدام هذه التكنولوجيا. ومن ثم، 3 ‘العرق بديل لتحديد حيثياته والتحقق من صحة الجينات الانصهار الرواية التي تشمل 3′ UTR. وبالنظر إلى زيادة في عدد الجينات الانصهار المبلغ عنها جذرية كذلك قراءة من خلال النصوص، 3 ‘ سباق قد أصبح أداة قوية في وصف تسلسل الجين11،12. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تسلسلات مختلفة داخل 3 ‘UTR فضلا عن طول 3’ UTR يمكن أن تؤثر على استقرار نسخة مرناً، التعريب، طواعية، ووظيفة13. يرجع جزئيا إلى زيادة اهتمام في رسم الخرائط الترنسكربيتوم، وكان هناك زيادة في العدد من مختلف بولمرس الحمض النووي يجري تطويرها لاستخدامها في المختبر. من المهم تحديد ما أنواع التعديلات يمكن جعل 3 ‘ بروتوكول سباق في النظام باستخدام مرجع متاح للحمض النووي [بولمرس].

عمل هذه التقارير تكييف 3 ‘سباق الخريطة أكملها 3’ UTR، نظام تقييم الأداء، و 3 ‘ نهاية الانقسام والموقع من محضر ANKHD1 باستخدام كبسولة تفجير داخل القسم ANKHD1 من النسخة وهما الحمض النووي [بولمرس] مختلفة متداخلة.

Protocol

ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات السلامة في جميع الأوقات أثناء تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول. التأكد من فتح الحاويات/الأنابيب التي تحتوي على الفينول وغوانيدين isothiocyanate الكاشف هي فقط في هود مصدقة، والتخلص من نفايات الفينول في حاوية معينة. استخدام أنابيب معقمة خالية من الدنا?…

Representative Results

البحث التمهيدي إلى الأمام متداخلة: [اغروس] هلام من ويبين الشكل 1 اثنين مميزة بكر جل المنتجات (الممرات 1 و 2) التي تستخدم نفس الأمام التمهيدي لكن الإشعال عكس مختلفة. 3 لين منتج PCR متميزة ومتميزة إلى الأمام وعكس تمهيدي. ك?…

Discussion

وعلى الرغم من ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية، على أساس الجينات بالجينات، 3 ‘ سباق لا يزال الأسلوب الأسهل والأكثر اقتصادا للتعرف على نظام تقييم الأداء والنيوكليوتيدات المجاورة بذيل poly(A). تكييف الموصوفة هنا يوسع استخدام 3 ‘سباق إلى تضخيم وخريطة تسلسل التي تشمل قسما من ORF كودون التوقف و أكملها 3…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نعترف جيبس بيتين لمساعدتها التقنية.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Play Video

Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

View Video